王 珊 張 兵△

1)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150086 2)黑龍江省麻醉與危重病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150081 3)黑龍江省普通高等學(xué)校麻醉基礎(chǔ)理論與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150081

·綜述·

冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白腦保護(hù)作用機(jī)制的研究現(xiàn)狀

王 珊1，2，3)張 兵1，2，3)△

1)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150086 2)黑龍江省麻醉與危重病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150081 3)黑龍江省普通高等學(xué)校麻醉基礎(chǔ)理論與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150081

冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白；腦保護(hù)；氧化應(yīng)激；凋亡；低溫

在全世界，腦缺血、中風(fēng)屬于第2、3位最常導(dǎo)致死亡的疾病，且是導(dǎo)致永久性殘疾最常見的疾病[1-2]。近年來低溫治療技術(shù)已經(jīng)成為一種有效的減輕腦中風(fēng)、外傷性腦損傷后腦組織初次和再次損傷的方法，且在心臟驟停復(fù)蘇后發(fā)揮重要的神經(jīng)保護(hù)作用[3]，但由于其存在的不良反應(yīng)，如易誘發(fā)低血壓、低血容量、心率過緩、電解質(zhì)紊亂及高血糖等，常會(huì)影響患者預(yù)后，導(dǎo)致低溫技術(shù)在腦保護(hù)作用中的應(yīng)用受到限制[4]。既往觀點(diǎn)認(rèn)為，低溫治療的保護(hù)作用是通過減少組織和器官的分解代謝，減少蛋白質(zhì)的合成，并抑制組織、器官的氧耗來實(shí)現(xiàn)[5-6]。然而近期研究表明，在低溫條件下，冷誘導(dǎo)RNA 結(jié)合蛋白(cold-inducible RNA-binding protein，CIRP)有明顯的上調(diào)，CIRP在低溫治療中通過多種作用機(jī)制發(fā)揮重要的作用。本文重點(diǎn)闡述CIRP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用中的可能機(jī)制。

1 CIRP的細(xì)胞定位與表達(dá)

CIRP是一種RNA結(jié)合蛋白，也被稱為核不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP)，是富含甘氨酸RNA結(jié)合蛋白家族的一種18 kD蛋白[7]。人類的CIRP 基因定位在第19 號(hào)染色體p13.3位點(diǎn)上[8]。大鼠和小鼠的CIRP的蛋白序列是相同的，且人類的CIRP與它們有95%的同源性[9]。在K562、HepG2、NC65等多種人類細(xì)胞系及大鼠的腦、肺、腎臟、肝臟、胃、結(jié)腸、卵巢、睪丸、甲狀腺和骨髓組織中CIRP均有結(jié)構(gòu)性的表達(dá)，并在應(yīng)激原的刺激下表達(dá)升高或降低[10]。在人和動(dòng)物的大多數(shù)細(xì)胞中，CIRP位于細(xì)胞核中[7]，在應(yīng)激原的刺激下，通過精氨酸的甲基化作用，CIPR從細(xì)胞核遷移至細(xì)胞質(zhì)中[11]，參與體內(nèi)多種生物學(xué)過程。

2 CIRP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用

2．1 CIRP調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯 CIRP是應(yīng)激反應(yīng)蛋白，它有一個(gè)專門的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列(internal ribosome entry site，IRES)介導(dǎo)的翻譯機(jī)制。通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列與不同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。CIRP從細(xì)胞核移到細(xì)胞液中，結(jié)合mRNA′s 5′/3′ 未翻譯區(qū)域(untranslated region，UTR)調(diào)節(jié)翻譯的起始速度、提高轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性，并通過與特異靶基因結(jié)合，刺激激活的轉(zhuǎn)錄物的翻譯而發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用，且?guī)椭?xì)胞快速適應(yīng)環(huán)境的變化[12]。

2．2 CIRP對(duì)損傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用 Li等[13]和李首春等[14]利用RNAi技術(shù)研究了CIRP在亞低溫中的作用，結(jié)果顯示，亞低溫下CIRP蛋白表達(dá)升高，可以明顯降低受損神經(jīng)元凋亡，提高細(xì)胞存活率；沉默CIRP蛋白表達(dá)后，亞低溫不能抑制神經(jīng)元的凋亡。蔡英等[15]將原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元分為對(duì)照組、損傷組和治療組，氧糖剝奪55 min制作海馬神經(jīng)元損傷模型，損傷組和治療組在氧糖剝奪后分別置于37 ℃和32 ℃培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞，檢測各組細(xì)胞的存活率、凋亡率、CIRP的mRNA和蛋白的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，損傷組細(xì)胞生存率明顯下降，治療組細(xì)胞生存率明顯升高；與損傷組比較，治療組細(xì)胞凋亡率下降，CIRP的mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高。

3 CIRP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用中的可能機(jī)制

3．1 CIRP抑制氧化應(yīng)激反應(yīng) 腦組織缺血時(shí)抗氧化防御功能失調(diào)，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)相對(duì)缺少抗氧化酶，因此氧化損傷的累積在腦組織發(fā)生率更高[16]。Liu等[13]將培養(yǎng)的小鼠皮質(zhì)神經(jīng)用慢病毒CIRP-RNAi轉(zhuǎn)導(dǎo)，分析了CIRP在低溫條件下對(duì)過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用。發(fā)現(xiàn)與37 ℃相比，32 ℃下CIRP的表達(dá)明顯增加，且CIRP的表達(dá)誘導(dǎo)capase-3蛋白表達(dá)下降，而硫氧還原蛋白(thioredoxin，TRX)的表達(dá)升高，硫氧還原蛋白通過清除氧自由基而發(fā)揮保護(hù)作用。由此推測CIRP在低溫下可能是通過誘導(dǎo)硫氧還原蛋白的表達(dá)而發(fā)揮腦保護(hù)作用。李靜輝等[17]用體外分離培養(yǎng)的原代大鼠海馬神經(jīng)元，對(duì)比亞低溫(32 ℃)與常溫下(37 ℃)相關(guān)的氧化還原指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，單純低溫組和CIRP過表達(dá)組總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD) 等抗氧化物質(zhì)的活性成分明顯升高，而丙二醛(MDA) 作為脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物則表達(dá)下降。因此認(rèn)為，亞低溫通過上調(diào)CIRP的表達(dá)，抑制細(xì)胞內(nèi)氧自由基的生成，進(jìn)而抑制氧自由基導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。

3．2 CIRP抑制炎癥因子的表達(dá) Toshiharu 等[12]用腫瘤壞死因子α(TNF-α)和放線菌酮處理BALB/3T3 細(xì)胞，在低溫培養(yǎng)下發(fā)現(xiàn)CIRP 的表達(dá)增加，并使細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK) 的磷酸化水平升高，抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。低溫(32 ℃) 時(shí)將CIRP 轉(zhuǎn)導(dǎo)入CIRP 缺失的鼠成纖維細(xì)胞后，同樣發(fā)現(xiàn)增加ERK 的磷酸化水平并抑制了TNF-α 誘導(dǎo)的凋亡。在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，他們將含有NF-κB 結(jié)合位點(diǎn)并帶有報(bào)告基因的載體與CIRP 共轉(zhuǎn)染至CIRP 缺失的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過表達(dá)CIRP 增加了NF-κB的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在溫和低溫刺激應(yīng)激下，CIRP 通過激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK) 級(jí)聯(lián)中的ERK通路和NF-κB 信號(hào)通路而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用。Tomomi等[18]將小鼠暴露在4 ℃～5 ℃ 24 h和48 h后，選取小鼠腦組織用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CIRP、熱休克蛋白70.1在嗅球和下丘腦表達(dá)升高，且CIRP的表達(dá)早于熱休克蛋白70.1，而具有代表性的炎癥因子TNF-α和IL-6在嗅球和下丘腦的表達(dá)則下降。推測CIRP在亞低溫下是通過抑制炎癥因子通路發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。

3．3 CIRP抑制線粒體凋亡途徑 細(xì)胞凋亡可通過線粒體、死亡受體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑產(chǎn)生。線粒體凋亡途徑包括釋放細(xì)胞色素C、Smac、凋亡誘導(dǎo)因子和核酸內(nèi)切酶，經(jīng)過多步的激活反應(yīng)使細(xì)胞的DNA破碎進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Zhang等[19]將小鼠的皮質(zhì)神經(jīng)元分離后在32 ℃下培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)CIRP過表達(dá)可使抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w和相應(yīng)蛋白的表達(dá)增加，而促凋亡基因Bax、Bak、Bok、Bad、Bid和相應(yīng)蛋白表達(dá)減少。在CIRP過表達(dá)組ERK和Akt的表達(dá)也相應(yīng)增加，而ERK和Akt可直接或間接影響B(tài)cl-2家族基因的表達(dá)。激活ERK1/2可使Bad磷酸化防止Bad的促凋亡功能，激活A(yù)kt可使Bad、Baxa和Caspase-9磷酸化并失活。因此，亞低溫上調(diào)的CIRP可通過線粒體途徑抑制神經(jīng)元凋亡從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

3．4 CIRP調(diào)節(jié)細(xì)胞周期 Liu等[16]用N2a細(xì)胞作為神經(jīng)細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)用重組CIRP(rCIRP)培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞和用rCIRP預(yù)處理的神經(jīng)細(xì)胞與H2O2共同培養(yǎng)，神經(jīng)細(xì)胞的成活率都明顯提高。進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)，rCIRP能防止H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞停留在細(xì)胞周期的S期，且增加細(xì)胞周期中從S期到G2/M期的進(jìn)程。用rCIRP預(yù)處理過的神經(jīng)細(xì)胞能抑制H2O2導(dǎo)致的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinD1和c-Myc表達(dá)下降，且增加p-Akt和p-ERK的表達(dá)水平。表明CIRP發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控下游靶因子cyclinD1和c-Myc的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖實(shí)現(xiàn)的。

3．5 CIRP與能量代謝的關(guān)系 Liu等[20]研究低溫組、腦局部缺血組、缺血后低溫組腦組織中CIRP的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在低溫環(huán)境下，腦組織中CIRP表達(dá)水平明顯升高，且具有區(qū)域性和時(shí)間性差異，下丘腦區(qū)的CIRP表達(dá)增強(qiáng)的出現(xiàn)明顯早于其他腦區(qū)，且缺血性損傷可以推遲低溫造成的CIRP 的表達(dá)，但并不能降低CIRP 的表達(dá)量，揭示了CIRP與能量代謝的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在低溫誘導(dǎo)下的CIRP的表達(dá)與乳酸鹽、PFK-1和丙酮酸鹽無直接聯(lián)系。因此，低溫下CIRP的神經(jīng)保護(hù)作用不是通過影響腦的能量代謝實(shí)現(xiàn)的。

4 問題與討論

盡管上述研究證實(shí)CIRP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過不同的作用機(jī)制發(fā)揮保護(hù)作用，但也有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，CIRP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)可能是一種促炎物質(zhì)。Brochu等[21]發(fā)現(xiàn)，在紫外線照射下CIRP可上調(diào)IL-1β的表達(dá)，而干擾CIRP可減少p-IkBa、IL-1β的表達(dá)，降低NF-κB的活性；Rajayer等[22]發(fā)現(xiàn)，用酒精誘導(dǎo)的小鼠的腦組織和血液中CIRP表達(dá)增加，炎癥因子TNF-α和IL-1β也相應(yīng)增加；Zhou等[23]發(fā)現(xiàn)，在小鼠的大腦中動(dòng)脈栓塞模型中，TNF-α伴隨CIRP的表達(dá)增加而升高，且CIRP能直接誘導(dǎo)TNF-α從BV2細(xì)胞中釋放并激活NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路。上述研究似乎表明，CIRP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)中的作用是相互矛盾的，既發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用又可能促進(jìn)炎癥反應(yīng)的進(jìn)展。綜合分析上述研究發(fā)現(xiàn)，CIRP抑制腦組織炎癥反應(yīng)作用的研究大多是在低溫下和在體外實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)的；而CIRP的促炎作用多是在室溫和在體實(shí)驗(yàn)中得到的。因此猜測CIRP是否在不同的溫度和體內(nèi)外環(huán)境下存在不同的狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)不同的信號(hào)通路發(fā)揮不同的作用。因此，CIRP的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

5 展望

在腦缺血缺氧損傷、腦缺血/再灌注損傷、腦外傷等情況下，CIRP作為一種應(yīng)激狀態(tài)下大量表達(dá)的RNA 結(jié)合蛋白，通過多種作用機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但CIRP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)中作用的研究結(jié)果相互矛盾，尚有待進(jìn)一步深入研究。開展CIRP 的功能性研究具有重要的基礎(chǔ)研究價(jià)值及應(yīng)用前景。

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(收稿2017-04-11)

責(zé)任編輯：王喜梅

R338

A

1673-5110(2017)17-0111-03

10.3969/j.issn.1673-5110.2017.17.037

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81372026)

△通信作者：張兵，博士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。研究方向：心跳驟停腦復(fù)蘇、圍術(shù)期腦保護(hù)、服缺血再灌注損傷。Email：zhang_bing08@126．com