俞鵬，朱珍珍，賈杏林

（1.湖南省常德市畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，湖南常德415400；湖南省常德津市市畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，湖南常德415400；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

IHA法和間接ELISA法檢測(cè)豬附紅細(xì)胞體抗體結(jié)果對(duì)比分析

俞鵬1，朱珍珍2，賈杏林3※

（1.湖南省常德市畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，湖南常德415400；湖南省常德津市市畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，湖南常德415400；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

為了尋求適用于基層實(shí)驗(yàn)室對(duì)豬附紅細(xì)胞體抗體的檢測(cè)方法，文章試驗(yàn)用間接血凝試驗(yàn)（IHA）和間接ELISA兩種方法分別檢測(cè)了402份臨床送檢豬血清，并對(duì)這兩種方法的敏感性和符合率進(jìn)行比較研究。結(jié)果表明，IHA和ELISA法結(jié)果符合率為80.1％，且ELISA方法比IHA敏感性更高，更適合批量檢測(cè)和群體普查。

豬附紅細(xì)胞體；抗體；間接ELISA;IHA；對(duì)比

豬附紅細(xì)胞體病在世界范圍內(nèi)對(duì)所有日齡豬均有危害，常與豬瘟、豬肺疫、豬鏈球菌病、豬流感等疾病混合感染，病愈后的豬可終生攜帶病原[1-2]。該病的流行不但對(duì)畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，而且對(duì)人類健康構(gòu)成威脅，因此，急需一種對(duì)豬附紅細(xì)胞體病準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。

一直以來(lái)，由于尚無(wú)對(duì)附紅細(xì)胞體成熟的體外培養(yǎng)方法，難以獲取大量原始抗原，阻礙了血清學(xué)檢測(cè)附紅細(xì)胞體的發(fā)展以及快速診斷試劑盒的研制[3]。湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院李曉云博士[4]改進(jìn)了豬附紅細(xì)胞體的培養(yǎng)體系，做到除首次接種外不添加任何紅細(xì)胞且連續(xù)培養(yǎng)達(dá)280d以上，染蟲(chóng)率維持近100％。本實(shí)驗(yàn)全菌病原均由李曉云老師提供，為實(shí)驗(yàn)的順利完成提供了重要保障，同時(shí)也證明了附紅細(xì)胞體培養(yǎng)的可行性。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)豬附紅細(xì)胞體病的檢疫常采用傳統(tǒng)的染色鏡檢法，該法敏感度較低。血清學(xué)方法最適合群體檢測(cè)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和IHA是臨床上較常用的一種血清學(xué)檢測(cè)方法[5]。為了尋求適用于基層實(shí)驗(yàn)室對(duì)豬附紅細(xì)胞體病抗體檢測(cè)方法，將血清學(xué)檢測(cè)方法廣泛的應(yīng)用于臨床診斷，本文將進(jìn)一步探討兩種試驗(yàn)方法的敏感性及特異性。

1 材料及方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 抗原

豬附紅細(xì)胞體抗原由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院李曉云博士等人提供。豬附紅細(xì)胞體用Thermo NANODROP 2000微量分光光度計(jì)A260/A280測(cè)定蛋白濃度。

1.1.2 豬血清

陰性血清由Gibco公司生產(chǎn)，且IHA檢測(cè)為陰性;陽(yáng)性血清由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院臨床獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制;微量分光光度計(jì)（型號(hào)為T(mén)hermo NANODROP 2000）由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院臨床獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；臨床檢測(cè)樣來(lái)自湖南省22個(gè)豬場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 陽(yáng)性血清的制備

將培養(yǎng)抗原依照楊漢春[6]等人的方法免疫家豬（母豬），每周一次，免疫4次。最后一次免疫9天后心臟采血分離血清,間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)。間接ELISA效價(jià)檢測(cè)的結(jié)果判定:以測(cè)定孔OD值(P)/陰性對(duì)照孔OD值(N)≥2.1判為陽(yáng)性,1.5≤P/N≤2.1為可疑,P/N＜1.5為陰性。

1.2.2 間接ELISA

按照本實(shí)驗(yàn)室建立的ELISA方法，抗原80ug每孔4℃包被過(guò)夜，洗滌3次；用0.5％BSA37℃封閉1小時(shí)加4℃封閉一小時(shí)，洗滌3次;血清1:40作用1.5小時(shí)后洗滌3次;辣根過(guò)氧化物酶兔抗豬IgG 1:1000稀釋作用為45min后洗滌5次;最后TMB 37℃顯色20min。ELISA結(jié)果判定如下，當(dāng)OD450≥0.228時(shí)判為陽(yáng)性；當(dāng)OD450＜0.162時(shí)判為陰性；當(dāng)0.162≤OD450＜0.195時(shí)判為可疑。

1.2.3 間接血凝實(shí)驗(yàn)(IHA)

在96孔微量板中每孔加入25μL稀釋液；將待檢血清25μL加入第1孔混勻后倍比稀釋至12孔，最后1孔棄去25μL。此時(shí)1排的1～12孔待測(cè)血清的稀釋度依次為：1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1: 64、1:128、1:256、1:512、1:1024、1:2048、1:4096。2號(hào)待檢血清加入第2排；取3號(hào)血清加入第3排,均按上方法稀釋；在微量板的第7排加陰性性血清25μL倍比稀釋到第4孔。第5～6孔為稀釋液對(duì)照。在第8排的第1孔加陽(yáng)性血清25μL并倍比稀釋到第12孔掉。被檢血清各孔、陰性對(duì)照各孔、陽(yáng)性對(duì)照各孔、稀釋液對(duì)照孔均加入致敏紅細(xì)胞25 μL。加樣完畢，于微型振蕩器上振蕩3～5min，并將血凝板放于有濕紗布的搪瓷盤(pán)內(nèi)，置37℃恒溫箱中40～60min,取出觀察結(jié)果，必要時(shí)放室溫下過(guò)夜，做終判。IHA試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)為小于或等于1:8判為陰性，大于1:8判為陽(yáng)性。

1.2.4 敏感性試驗(yàn)

分別用IHA和ELISA同時(shí)檢測(cè)8份豬陽(yáng)性血清，比較兩種方法的敏感性。

1.2.5 臨床樣品檢測(cè)及符合率試驗(yàn)

用IHA和ELISA方法分別檢測(cè)湖南22個(gè)豬場(chǎng)402份送檢血清，比較二者的靈敏度及符合率。

2 結(jié)果

2.1 敏感性試驗(yàn)

取8份豬血清，倍比稀釋后分別用IHA和ELISA方法檢測(cè)。結(jié)果表明，ELISA方法的敏感性比IHA高5倍左右。

表1 I HA法和間接EL I SA法敏感性結(jié)果比較

2.2 符合率試驗(yàn)

從表2可知，用IHA和ELISA方法同時(shí)檢測(cè)臨床送檢豬血清402份，IHA和ELISA的陽(yáng)性率分別為53.73％、57.21％。

從表3可知，相對(duì)IHA法檢測(cè)，間接ELISA法檢測(cè)陽(yáng)性（a）為187份，陰性(d)135份，假陽(yáng)性（c）為29份。間接ELISA法檢測(cè)靈敏度=a/(a+c)×100％ =86.6％;特異度=d/(b+d)×100％=72.6％;漏檢率=c/ (a+c)×100％=13.4％;誤診率=b/(b+d)×100％=27. 4％;診斷符合率=（a+d）/(a+b+c+d)×100％=80.1％。

表2 兩種方法檢測(cè)豬附紅細(xì)胞體抗體結(jié)果

表3 間接血凝抑制法和間接E L I S A法符合率試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

ELISA與IHA方法比較結(jié)果可知，IHA和ELISA的陽(yáng)性率分別為53.73％、57.21％，兩者總符合率為80.15。ELISA比IHA的敏感度更高，并且具有快速、靈敏、操作更加簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可最大限度的避免試驗(yàn)過(guò)程中各種因素對(duì)結(jié)果的影響并減輕實(shí)驗(yàn)室人員的工作強(qiáng)度。另外也可用于檢測(cè)單個(gè)樣本，特別適用于基層防疫員和規(guī)模戶，大大方便的畜病的快速診斷，有效提高了該病的檢出率。

參考文獻(xiàn)：

[1]王國(guó)永,潘耀謙,劉志軍.豬附紅細(xì)胞體檢測(cè)方法研究概況[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2006,27(5):9-12.

[2]Wu J,Yu J,Song C.Porcine eperythrozoonosis in China[J]. Vet.J,2012,193(2):535-8.

[3]張長(zhǎng)瑩，李玉峰，華榮蓉.豬支原體重組MSGI蛋白間接ELISA檢測(cè)方法的建立[J].畜牧與獸醫(yī),2011,43(2):12-18.

[4]李曉云,賈杏林,石德時(shí),等.豬附紅細(xì)胞體的體外連續(xù)培養(yǎng)[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,39(8):1142-1146.

[5]戴愛(ài)玲,李曉華,楊小燕.間接血凝試驗(yàn)與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)豬瘟抗體的比較[C].福建：福建省畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)論文集.2009:122-126.

[6]楊漢春.動(dòng)物免疫學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2003.

S854.43

A

1006-4907（2016）02-0035-02

10.3969/j.issn.1006-4907.2016.02.017

2016-02-19

※通訊作者：賈杏林。