朱 娜，方 超，周成捷，柴強強，王送林，黎滿香※,2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙410128）

湖南省豬源腸球菌的分離鑒定

朱 娜1，方 超1，周成捷1，柴強強1，王送林1，黎滿香※1,2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙410128）

為了從豬糞便中分離出腸球菌，采用6.5％NaC1pH 9.6 TSB和麥康凱血平板兩種方法分別對80個健康豬源樣品和53個流行性腹瀉豬源樣品進行檢測。結(jié)果顯示，共分離出115株腸球菌，其中健康豬源腸球菌72株，包括糞腸球菌2株，屎腸球菌30株，其他腸球菌40株，檢測率為90％；從流行性腹瀉中共分離到43株腸球菌，其中糞腸球菌9株，屎腸球菌29株，其他腸球菌5株，檢出率為81.1％，前者方法中其他腸球菌的檢出率比較高，后者方法屎腸球菌的檢出率比較高。兩種方法各有側(cè)重，為分離不同菌種的腸球菌提供依據(jù)。

腸球菌；糞腸球菌；屎腸球菌；分離鑒定

腸球菌在自然界中分布很廣，在動物、植物、水、土壤、食物中均有分布，在人和動物體內(nèi)腸球菌主要定居在陰道、口腔及消化道內(nèi)，屬正常的菌群之一。腸球菌一般不會引起機體發(fā)病，是一種非常重要的條件致病菌[1]。目前，腸球菌是細菌性感染疾病中的第二大病原菌，可以引起尿道感染、腹腔感染、心內(nèi)膜炎、敗血癥和傷口感染等[2]，嚴重時可以引起死亡。在獸醫(yī)臨床中，發(fā)現(xiàn)的由腸球菌引起的動物疾病也日益增多[3-5]。

腸球菌屬兼性厭氧、無芽孢的革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性成對或鏈狀排列的球菌。腸球菌對環(huán)境的耐受性較強，耐酸、堿、熱及高鹽，一般可以在自然狀況下存活數(shù)周，可在羊血瓊脂平板上檢測腸球菌的溶血性。根據(jù)OD值估測腸球菌的生長中，pH對其影響最大，而鹽濃度和溫度對其生長影響小[6]。腸球菌的PYR（吡咯烷酮芳胺酶）試驗為陽性，觸過氧化氫酶陰性，可分解多種糖醇類，但屎腸球菌一般不發(fā)酵山梨醇。

腸球菌傳統(tǒng)的鑒定方法主要是將分離株與典型的菌株在形態(tài)學(xué)和理化特性等進行比較而鑒定。但是由于細菌的不斷進化和可能產(chǎn)生的變異，使得傳統(tǒng)的鑒定方法不一定準確，而且用于比較的典型菌株都是人源腸球菌，這對其他動物源的菌株有可能不適用，所以目前一般都用腸球菌的理化特性來進行細菌的輔助鑒定。腸球菌可以通過細菌的16SrDNA測序來鑒定，也可以通過設(shè)計特異性引物用PCR方法鑒定。本次對采集的疑似菌株進行了PCR鑒定、傳統(tǒng)的理化特性鑒定，并抽取部分菌株采用16SrDNA測序來鑒定，以確定所分離的豬源腸球菌的準確性。

1 材料和方法

1.1 病料來源

來自于湖南岳陽市、汨羅市、耒陽市、平江縣四個不同豬場的共80頭健康母豬的肛門拭子，以及來自于岳陽市、瀏陽市、郴州市三個不同豬場的被確診為流行性腹瀉的共53頭患豬的肛門拭子。

1.2 主要試劑

DNA聚合酶和dNTP購自天根生物工程公司。Mix購自寶生物公司。生化試劑購于杭州天和微生物試劑有限公司。TSB、TSA、6.5％NaC1pH9.6 TSB、生理鹽水、麥康凱血培養(yǎng)基平板、哥倫比亞綿羊血瓊脂平皿等。

1.2 腸球菌的分離與鑒定

1.2.1 樣品的采集與處理

無菌采集湖南省四個地區(qū)(豬場情況見表1)養(yǎng)殖場的健康豬肛門拭子接種于6.5％NaC1pH 9.6 TSB中37℃振蕩培養(yǎng)18～24h后，接種于TSA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)18～24h，挑取鏡檢為革蘭氏陽性、成對、球形的菌株為可疑菌株。無菌采集的流行性腹瀉的病豬拭子接種到麥康凱血培養(yǎng)平板上，劃線分離于37℃培養(yǎng)16～18h，選取平板上紅色的，生長良好，微凸，表面光滑的圓形的小菌落增菌并革蘭氏染色鏡檢，以鏡檢為革蘭氏陽性、成對、球形的菌株為可疑菌株。

表1 四個豬場的用藥情況

1.2.2 PCR鑒定

所用特異性引物[7]見表1，由上海生物工程有限公司合成。以可疑菌株為模板，PCR體系15μL，其中Mix7.5μL,水5.5μL，模板1μL，上下游引物各0.5μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，退火30s，72℃延伸30s，30循環(huán)，72℃延伸7min，10℃保存。取7μL經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

表2 腸球菌PCR鑒定所用引物序列

1.2.3 生化鑒定

根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[8]將陽性的菌株分別接種于乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、精氨酸雙水解酶、七葉苷、40％膽汁、葡萄糖、V-P試驗、水楊素、馬尿酸鹽等生化鑒定管中于35℃培養(yǎng)24～48h，觀察生化鑒定結(jié)果。

1.2.4 16srDNA測序鑒定

隨機抽取3株P(guān)CR鑒定為陽性菌株為模板，用于合成16srDNA通用引物[9]：F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，Rp：5’-CGGTTACCTTGTTACGAC TT-3’，該引物能擴增出多數(shù)細菌近乎全長的16srDNA基因，片斷大小為1500bp左右。50μL的PCR體系:水40μL，10×PCR buffer5μL，dNTP2μL，上、下游引物各1μL，Taq酶0.5μL，模板0.5μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s,59℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)35次，再72℃延伸7min，4℃保存。取5μL經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證后，產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測序。

2 結(jié)果

2.1 PCR 鑒定

從四個不同地區(qū)不同規(guī)模的豬場收集到80個健康豬源樣品，從中分離出72株腸球菌，其中糞腸球菌2株，屎腸球菌30株，其他腸球菌40株。從湖南岳陽、瀏陽、郴州等地流行性腹瀉的患豬的53個樣品中則共分離到43株腸球菌，其中糞腸球菌9株，屎腸球菌29株，其他腸球菌5株。詳情見表3。

表3 湖南省各地腸球菌分離情況

2.2 生化鑒定結(jié)果

115株分離菌的生化結(jié)果顯示與腸球菌的生化特性相似，發(fā)現(xiàn)一株P(guān)CR鑒定為屎腸球菌對山梨醇呈陽性反應(yīng)，各種腸球菌對所鑒定試劑的陽性反應(yīng)菌株數(shù)見表4。

表4 腸球菌分離株的生化鑒定結(jié)果

表4 腸球菌分離株的生化鑒定結(jié)果

圖1 分離株的1 6 S r DNAPCR擴增結(jié)果

3 討論

本次的樣品采集選擇的幾個不同地區(qū)和規(guī)模的豬場，樣品具有一定的地域性和代表性，并且在健康豬源肛門拭子的采集過程中，盡量選取的剛剛投入生產(chǎn)的母豬和將被淘汰的老母豬,總體來說能代表整個豬場的一個形勢。腸球菌傳統(tǒng)分離方法是用選擇性培養(yǎng)基THB篩選，因為THB中的疊氮鈉可以殺死除腸球菌外的大部分其他細菌。劉佳[10]等用此方法分離的豬源腸球菌分離率為86％，分離的腸球菌中糞腸球菌的分離率最高，屎腸球菌次之，其他腸球菌的分離率較低。本實驗中，采用6.5％ NaC1pH 9.6的TSB篩選的分離率為90％，其中屎腸球菌占41.7％，糞腸球菌僅占2.8％，其他腸球菌占55.6％。該方法的分離率較高于目前國內(nèi)其他文獻[11,12]所報道的分離率，這可能與樣品的低溫運輸和及時處理有關(guān)，含有6.5％的NaC1且pH值為9.6的TSB肉湯選擇培養(yǎng)基，極大的提高了腸球菌的檢出率，使其它非腸球菌難以繁殖。在麥康凱血培養(yǎng)基平板上的分離率為81.1％，屎腸球菌分離率最占分離株的67.4％，糞腸球菌次之占20.9％，其他腸球菌占11.6％。以上三種方法對腸球菌的分離率都較高，且均有各自的優(yōu)勢，傳統(tǒng)的THB方法糞腸球菌的分離率較高，而本實驗中6.5％NaC1pH 9.6的TSB方法其他腸球菌分離率較高，麥康凱血培養(yǎng)基平板方法中屎腸球菌的分離率較高。因此可以根據(jù)需要的不同腸球菌的菌種采取不同的分離方法。同時本實驗中采用生化鑒定，也是為了更進一步的確立分離到的為腸球菌屬。16SrDNA結(jié)構(gòu)保守，在許多細菌中普遍存在，且包含了大量信息，是較為理想的細菌分類序列，本文采用隨機抽取分離菌株進行16SrDNA測序分析，更能好的對分離腸球菌作進一步的驗證。

從大量的文獻報道中[12-16]，我們發(fā)現(xiàn)動物源糞便樣品中糞腸球菌和屎腸球菌的分離率為腸球菌種中最高的，其中在豬源腸球菌中糞腸球菌的分離率較高于屎腸球菌，為腸球菌中最高。然而，從此次實驗的分離結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌的分離率要遠低于屎腸球菌，在健康豬源糞便中僅耒陽市豬場分離到兩株，這也與豬場的用藥情況有關(guān)。根據(jù)文獻報道[17]發(fā)現(xiàn)糞腸球菌對青霉素G、高濃度鏈霉素、萬古霉素的敏感性較高，而這幾種藥物的同時使用也會對動物機體的菌群產(chǎn)生影響，體內(nèi)的菌群失調(diào)也會容易引起腸球菌的感染。因此，也能在一定程度上為更合理的使用抗生素提供依據(jù)。

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S852.61

A

1006-4907（2016）02-0041-04

10.3969/j.issn.1006-4907.2016.02.020

2016-03-14

湖南省科技計劃項目(2015-NK-3017)。作者簡介：朱娜（1992～），女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)。

※通訊作者：黎滿香，E-mail:manxiangl@163.com。