宋戈，亢美娟，苗晶

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，哈爾濱150086）

乳制品中多種常用人工合成色素的同時(shí)測(cè)定

宋戈，亢美娟，苗晶

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，哈爾濱150086）

建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定乳及乳制品中11種常用人工合成色素的方法。通過加入適量沉淀劑除去樣品中蛋白質(zhì)后，經(jīng)氨水甲醇溶液提取，混合型聚酰胺固相萃取柱凈化濃縮后，采用C18色譜柱，以乙腈-0.02mol/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，用二極管陣列檢測(cè)器多波長(zhǎng)檢測(cè)。回收率在92.0%～103.5%，精密度(RSD)為1.89%～3.96%，檢出限在2.0～15.0 ug/kg。該方法可用于乳及乳制品中人工合成色素的日常檢測(cè)。

人工合成色素；乳制品；高效液相色譜

0 引 言

食品著色劑可分為天然色素和人工合成色素兩大類，合成色素是以苯、甲苯萘等化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)過一系列有機(jī)反應(yīng)合成的，具有一定毒性，過多食用會(huì)危害人體健康，但由于其成本低、色澤鮮艷、著色力強(qiáng)、色調(diào)多樣，故被廣泛使用。合成色素有嚴(yán)格的控制使用范圍和最大使用量[1]，因此食品中合成色素的準(zhǔn)確測(cè)定具有重要意義。近年來，報(bào)道了一些測(cè)定合成色素的新方法，有超高效液相色譜法[2]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3-6]、毛細(xì)管色譜法[7-8]等，對(duì)儀器設(shè)備要求高。文獻(xiàn)報(bào)道較多的高效液相色譜法[9-15]和我國(guó)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[16]采用的聚酰胺吸附法,還有用C 18固相萃取柱凈化的方法[17-19]和混合型弱陰離子交換固相萃取柱凈化的方法[20-23]，局限于果汁、碳酸類飲料、配制酒、硬糖和肉類制品等基質(zhì)的食品色素提取，或?qū)Σ糠趾铣缮氐倪x擇性較差，不適用于對(duì)乳制品中合成色素的測(cè)定。關(guān)于乳制品中合成色素檢測(cè)方法的報(bào)道[22-27]，或前處理方式不易操作，操作復(fù)雜耗時(shí)長(zhǎng)；或方法回收率較低。

本研究通過沉淀樣品中的蛋白質(zhì)和脂肪等干擾物質(zhì)，氨水甲醇溶液提取，混合型聚酰胺固相萃取柱凈化濃縮，合理的色譜條件和多波長(zhǎng)檢測(cè)，同測(cè)定乳制品中的檸檬黃、新紅、莧菜紅、靛藍(lán)、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)、喹啉黃、赤蘚紅、專利藍(lán)這11種合成色素，靈敏度高，準(zhǔn)確，簡(jiǎn)單實(shí)用。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器設(shè)備

Waters2695高效液相色譜儀配Waters2996二極管陣列檢測(cè)器，QL-901型振蕩器。

1.2 材料試劑

檸檬黃、新紅、莧菜紅、靛藍(lán)、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)、喹啉黃、赤蘚紅和專利藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度1.000mg/mL)；乙酸銨(色譜純)、乙腈(色譜純)、氨水和冰乙酸；實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水；亞鐵氰化鉀水溶液質(zhì)量濃度109 g/L；乙酸鋅水溶液質(zhì)量濃度219 g/L；乙酸銨水溶液濃度0.02 mol/L，pH值為4.5；以上試劑除標(biāo)注的外均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Athena C 18-W P柱（250 mm×4.6mm，5 m），柱溫為25℃；檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器；波長(zhǎng)范圍為190～800 nm；流動(dòng)相A為濃度0.02 mol/L乙酸銨水溶液；流動(dòng)相B為乙腈；流速為1.0mL/min；梯度洗脫程序：0→10 min,5%B線性升至10%B；10→20 min,10%B線性升至30%B；20→30 min,30%B線性升至40%B；30→35min,40%B勻速降至5%B,保持5min。

1.3.2 樣品處理

調(diào)味乳和乳飲料：吸取10 mL移入50 mL容量瓶中準(zhǔn)確稱量；酸奶、雪糕、冰激淋和奶酪：準(zhǔn)確稱量2至4 g到小燒杯中，用50℃以下的水10 mL溶解并轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中。然后向樣品中加入1.0 mL亞鐵氰化鉀水溶液和1.0 mL乙酸鋅水溶液，混勻后用25%氨水甲醇溶液（體積比為25:75）沖洗小燒杯并定容。旋渦振蕩1 min，水浴超聲20 min以上，倒入50 mL離心管中在轉(zhuǎn)速為7 000 r/min下離心5 min，將上清液倒入另一50mL離心管中在-18℃的冰箱中冷凍60 min后在7000轉(zhuǎn)每分鐘下冷凍離心5min。準(zhǔn)確吸取25mL上清液到三角瓶中，加入25 mL水搖勻后用冰乙酸調(diào)pH值到4.5，洗入適配儲(chǔ)液器的Anpelclean混合型聚酰胺固相萃取柱(6cc/500mg)(已經(jīng)依次用甲醇6 mL、水6mL活化過的),用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%甲酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%甲醇的水溶液6 mL淋洗,再用6 mL10%氨化甲醇洗脫,收集洗脫液，于50℃下氮?dú)獯蹈珊笥觅|(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%乙腈水溶液定容到1mL,搖勻，用0.45 m濾膜過濾,供分析測(cè)定。

1.3.3 定量測(cè)定

標(biāo)樣與加標(biāo)樣品測(cè)定的色譜圖如圖1所示。按照出峰的順序，色譜峰依次為檸檬黃，新紅，莧菜紅，靛藍(lán)，胭脂紅，日落黃，誘惑紅，亮藍(lán)，喹啉黃，赤蘚紅，專利藍(lán)。圖1中，峰1～峰11分別為：1檸檬黃，2新紅，3莧菜紅，4靛藍(lán)，5胭脂紅，6日落黃，7誘惑紅，8亮藍(lán)，9喹啉黃，10赤蘚紅，11專利藍(lán)。

圖1 標(biāo)樣與加標(biāo)樣品測(cè)定的色譜

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

在滿足分離效果，達(dá)到待測(cè)物質(zhì)與雜質(zhì)基本分離的條件下，應(yīng)選擇能改善待測(cè)物質(zhì)的響應(yīng)，提高靈敏度的流動(dòng)相。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙腈-乙酸銨溶液作流動(dòng)相時(shí)待測(cè)物質(zhì)分離度和靈敏度比甲醇-乙酸銨溶液作流動(dòng)相時(shí)高，而且系統(tǒng)壓力小。本實(shí)驗(yàn)還考察了磷酸鹽、硫酸銨和檸檬酸銨等溶液作為緩沖溶液時(shí)對(duì)分離測(cè)定的影響，結(jié)果顯示，乙腈-乙酸銨溶液作流動(dòng)相時(shí)分離效果最好，待測(cè)物質(zhì)靈敏度最高。

通過改變流動(dòng)相中緩沖溶液的濃度與pH值比較被測(cè)組分的色譜峰和分離度，確定流動(dòng)相的緩沖溶液的濃度與pH值。當(dāng)乙酸銨溶液的濃度為分別為0.01，0.02，0.05，0.10 m o l/L時(shí)，對(duì)分離影響不大，但隨著乙酸銨溶液濃度的增加，待測(cè)物質(zhì)的出峰時(shí)間愈穩(wěn)定，考慮到緩沖鹽濃度增大，對(duì)色譜柱及系統(tǒng)管路造成的損害也會(huì)加大，所以選擇濃度為0.02 m ol/L的乙酸銨溶液作為緩沖溶液。調(diào)節(jié)濃度為0.02 m o l/L乙酸銨溶液pH值分別為5.0，4.5，4.0，3.5，3.0；隨著乙酸銨溶液pH值的降低，峰形越來越對(duì)稱而且尖銳，重復(fù)性也越來越好，考慮到色譜柱的耐酸程度，調(diào)節(jié)濃度為0.02 m ol/L乙酸銨溶液pH值為4.5較為合適。

為了讓待測(cè)組分更好的分離，選用濃度為0.02 m o l/ L乙酸銨溶液與乙腈進(jìn)行梯度洗脫。最初10 min內(nèi)，如果乙腈體積分?jǐn)?shù)變化過快，檸檬黃、新紅、莧菜紅和靛藍(lán)不能很好的分離，乙腈所占比例必須緩慢上升。10 min后，如果乙腈所占比例過小，喹啉黃、赤蘚紅和專利藍(lán)很難洗脫出來，所以在保證各組分良好分離的前提下，加快了乙腈上升的速率，縮短了分析時(shí)間，最終的梯度程序?yàn)?.3.1節(jié)所述。

2.2 波長(zhǎng)的選擇

通過二極管陣列檢測(cè)器獲得的光譜圖，在190～800 nm范圍內(nèi)對(duì)分析物進(jìn)行紫外波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn),在流動(dòng)相中各個(gè)組分的最大吸收波長(zhǎng)分別是檸檬黃428 nm，新紅525 nm，莧菜紅521 nm，靛藍(lán)608 nm，胭脂紅509 nm，日落黃483 nm，誘惑紅507 nm，亮藍(lán)625 nm，喹啉黃415 nm，赤蘚紅529 nm，專利藍(lán)635 nm。選擇各個(gè)組分的最大吸收波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)，并利用儀器軟件進(jìn)行時(shí)間段的分段設(shè)置，可以減少干擾，能提高靈敏度，降低檢出限[28-30]。

2.3 樣品提取條件的確定

由于乳制品中含有較多的蛋白質(zhì)和脂肪，如果不除去蛋白和脂肪，提取液則比較渾濁，不利于凈化。通過試驗(yàn)，用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作復(fù)合沉淀劑，可除去樣品中絕大部分蛋白質(zhì)和脂肪，效果要比調(diào)節(jié)酸堿沉淀、加入堿和硫酸銅沉淀等其他方法好。但如果亞鐵氰化鉀和乙酸鋅復(fù)合沉淀劑加入的少，蛋白沉淀不完全，會(huì)給提取和凈化帶來困難，影響測(cè)定。加的過多會(huì)造成提取不完全導(dǎo)致被測(cè)物的損失。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)確定1.0 mL質(zhì)量濃度為109g/L亞鐵氰化鉀水溶液和1.0 mL質(zhì)量濃度為219g/L乙酸鋅水溶液的用量，既能使蛋白完全沉淀，又能保證被測(cè)物的完全提取。通過比較氨水水溶液、氨水甲醇溶液、氨水乙醇醇溶液和氨水乙腈溶液對(duì)樣品中色素的提取效果，發(fā)現(xiàn)提取液中氨水濃度相同時(shí)，配制提取液用的另一種溶劑極性越大，樣品中色素的提取效率越高，但得到的上清液就越渾濁，不利于固相萃取凈化。其中氨水甲醇溶液作為提取溶劑既能保證色素的萃取率又能減少蛋白在萃取液中的溶解而利于固相萃取凈化。另外通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氨水甲醇溶液中氨水所占比例越大，色素的提取更加完全，但提取出來的溶液調(diào)完pH值后越容易變渾濁，不利于固相萃取凈化。通過比較，體積比為75:25的甲醇氨水混合溶液作為提取溶劑比較合適，能夠把樣品中的色素充分提取出來，而且上清液經(jīng)過進(jìn)一步處理和調(diào)完P(guān)H值后沒有蛋白析出，有利于固相萃取凈化。此外用提取液萃取樣品中的色素時(shí)，提取次數(shù)越多，會(huì)導(dǎo)致得到的上清液越渾濁，經(jīng)過進(jìn)一步處理和調(diào)完pH值后蛋白析出的越多，不利于固相萃取凈化。由于樣品用熱水完全溶解了，是均勻的乳濁液，用提取液萃取時(shí)也是均勻的乳濁液，所以只需提取一次，除去沉淀得到上清液。萃取得到的上清液經(jīng)過冷凍處理可以進(jìn)一步讓溶解在萃取液中的蛋白析出沉淀，利于準(zhǔn)確移取的萃取液在調(diào)完pH值并加水后上樣凈化，萃取得到的上清液在-18℃的冰箱中冷凍60 min以上，準(zhǔn)確移取的萃取液在調(diào)完P(guān)H值并加水后，析出的蛋白明顯減少甚至沒有。用提取液超聲萃取的時(shí)間過短不能使樣品溶液和提取液充分混勻，形成均勻的乳濁液，不利于色素的完全提取，試驗(yàn)的回收率隨著提取液超聲萃取時(shí)間的增加而提高，當(dāng)提取液超聲萃取時(shí)間達(dá)到20 min以上后不再變化。準(zhǔn)確移取的萃取液在調(diào)完pH值后加入一定量水，降低上樣液中的甲醇比例，可以讓固相萃取小柱更好地保留被測(cè)物，利于回收率的提高。

2.4 固相萃取的選擇與優(yōu)化

通過試驗(yàn)對(duì)比同樣量的填料不同類型的固相萃取柱吸附合成色素的容量，選擇吸附色素容量大的固相萃取柱，不僅可凈化樣品溶液，還可直接進(jìn)行濃縮，使實(shí)驗(yàn)操作更加簡(jiǎn)單化。在合成色素的分子結(jié)構(gòu)中都含有磺酸基團(tuán)，弱陰離子交換固相萃取柱比C 18固相萃取柱對(duì)此基團(tuán)有更好的選擇性和保留性。由于合成色素都是水溶性的物質(zhì)，個(gè)別合成色素如檸檬黃和新紅在C18固相萃取柱保留很差，導(dǎo)致其回收率低。在選擇弱陰離子交換固相萃取柱時(shí)，通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)赤蘚紅在O asisW AX固相萃取柱的保留性很強(qiáng)，需要大量的洗脫液進(jìn)行洗脫，才能回收完全，不利于進(jìn)一步氮?dú)獯蹈?，而Anpelclean混合型聚酰胺固相萃取柱對(duì)這幾種合成色素的選擇性和保留性比較合適。合并后的提取液呈強(qiáng)堿性，在Anpelclean混合型聚酰胺固相萃取柱上沒有保留，進(jìn)行調(diào)節(jié)pH值至4.5，可以保證合成色素的磺酸基電離狀態(tài)，有利于其在混合型聚酰胺固相萃取柱的保留和選擇，另外可以讓提取液中溶解的蛋白沉淀析出，有利于提高上樣、凈化和洗脫的效率。在凈化的過程中，通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)淋洗液中甲醇比例大時(shí)，赤蘚紅會(huì)流失，而淋洗液中甲酸加入的量多時(shí)，專利藍(lán)會(huì)流失。為了保證合成色素在固相萃取時(shí)有較好的回收率和去除盡可能多的雜質(zhì)，用含20%甲酸和40%甲醇的水溶液淋洗效果較好。此外，洗脫劑的洗脫效率也是一個(gè)關(guān)鍵因素，和回收率息息相關(guān)。通過試驗(yàn)對(duì)比甲醇、氨水甲醇溶液和氨水乙醇溶液在混合型聚酰胺固相萃取柱上進(jìn)行洗脫的回收率，結(jié)果表明用氨水甲醇溶液作洗脫劑，回收率最高。為了達(dá)到用最少的量的洗脫液得到最高的回收率，通過試驗(yàn)進(jìn)一步得出在保證回收率的前提下，洗脫溶液中氨水所占比例越大，洗脫劑的用量越少，但洗脫溶液中氨水所占比例達(dá)到10%后洗脫劑的用量不在明顯減少。由于洗脫溶液中氨水所占比例越大越不利于洗脫后吹干濃縮，為了讓吹干濃縮節(jié)省時(shí)間，最終選擇10%氨水甲醇溶液為洗脫液。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

分別配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，在最佳色譜條件下，進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定，得到11種化合物的回歸方程及線性相關(guān)系數(shù)、線性范圍，并以3倍信噪比時(shí)的進(jìn)樣濃度計(jì)算出了方法的檢出限如表1所示。

表1 11種合成色素的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)以及線性范圍和檢出限

2.6 回收率

以同一個(gè)空白奶酪樣品為實(shí)驗(yàn)材料，加入一定量的合成色素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，平行測(cè)定3次，以平均測(cè)定值計(jì)算回收率，結(jié)果如表2所示。

2.7 方法的精密度

以同一個(gè)空白奶酪樣品為實(shí)驗(yàn)材料，稱取樣品后加入10 ug/mL的11種合成色素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液1.0 mL，進(jìn)行平行8次重復(fù)性實(shí)驗(yàn),計(jì)算測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。這11種合成色素的RSD在1.89%～3.96%。由此可以看出，測(cè)定結(jié)果的較為穩(wěn)定，方法的重復(fù)性較好。

2.8 實(shí)際樣品的測(cè)定

按照本方法對(duì)市售的調(diào)味乳、乳飲料、酸奶、雪糕、冰激淋和奶酪樣品中著色劑進(jìn)行測(cè)定，其中配料表沒有標(biāo)示著色劑的樣品例如調(diào)味乳、乳飲料、酸奶等，沒有檢出這11種人工合成色素，在配料表標(biāo)明著色劑的樣品中，雪糕、冰激淋檢出檸檬黃和日落黃，總質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為5～15 mg/kg；奶酪樣品也有檢出胭脂紅，含量為5 mg/kg～10 mg/kg，所檢樣品著色劑的添加均符合規(guī)范要求。圖2為檢出人工合成色素的冰激凌和奶酪樣品色譜圖。在食品中使用限用著色劑的目的是為產(chǎn)品賦色，為達(dá)到理想的賦色效果，著色劑的添加量一般不會(huì)很低。從實(shí)際樣品的分析結(jié)果來看，所有檢出的著色劑的含量除個(gè)別在定量限附近，其他均遠(yuǎn)高于定量限，這也說明該方法的靈敏度完全可以滿足實(shí)際測(cè)試的需求。圖2中，峰1～峰3分別為：1檸檬黃，2日落黃，3胭脂紅。

表2 11種合成色素的回收率（n=3）

圖2 檢出人工合成色素樣品色譜

3 結(jié) 論

本文重點(diǎn)研究了樣品的提取條件、固相萃取的選擇與優(yōu)化以及色譜分離條件，建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定乳制品中11種合成色素的方法。該方法測(cè)定結(jié)果重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，簡(jiǎn)單易操作，適合乳制品中合成色素的日常檢測(cè)。

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Simultaneous determination of various synthetic colorants in dairy products

SONG Ge,KANG Mei-juan,M IAO Jing

(National Dairy Testing Center,Northeast Agriculture University,Harbin 150086,China)

A method for Simultaneous determination of 11 kinds synthetic colorants in milk and dairy products by high-performance liquid chromatography(HPLC)was established.Protein in milk and dairy products were mostly eliminated by the precipitators,extracted with ammonia-methanol,purified and enriched by WAX extraction cartridges,separated on C18 column with amixed solution of acetonitrile-0.02 mol/L ammonium acetate as mobile phase by gradient elution,and detected with a photo-diode array detector.The recovery were 92.0%～103.5%,the relative standard deviations(RSD)were 1.89%～3.96%,the minimum detectable values were 2.0～15.0 ug/kg.This method can be used for the routine analysis of synthetic colorants in milk and dairy products.

synthetic colorants;dairy products;HPLC

TS252.7

A

1001-2230（2016）05-0043-05

2015-10-30

宋戈（1982-），男，工程師，從事乳制品檢測(cè)與研究。