李代軍 （山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 262200）

兔皮膚真菌病常見(jiàn)檢測(cè)方法

李代軍 （山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 262200）

兔皮膚真菌病是一種由病原真菌通過(guò)侵入動(dòng)物表皮及毛囊引起動(dòng)物皮屑增多，脫毛等相關(guān)癥狀的疾病。近年來(lái)，兔皮膚真菌病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，對(duì)養(yǎng)兔業(yè)發(fā)展造成了極其嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在美國(guó)、意大利等國(guó)家都有兔皮膚真菌病的發(fā)生。在國(guó)內(nèi)，黑龍江、山東青島地區(qū)也有該病的發(fā)生。

目前，用于兔皮膚病原真菌的鑒定方法主要包括傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法和分子生物學(xué)方法?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)室常用的檢測(cè)方法闡述如下。

1 傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法

1.1 直接鏡檢法

臨床標(biāo)本的直接顯微鏡檢查是最簡(jiǎn)單也是最有用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。方法是將淺部感染真菌病變標(biāo)本置于載玻片上，滴加10%的KOH，覆蓋玻片后用吸水紙吸去多余液體，顯微鏡下觀察可見(jiàn)皮屑中有菌絲、毛發(fā)內(nèi)部或外部有成串孢子，即可初步診斷為真菌感染。該方法對(duì)淺部皮膚病原真菌感染的檢測(cè)有較大幫助，其優(yōu)點(diǎn)在于可以在幾分鐘內(nèi)完成診斷，簡(jiǎn)便、快速，陽(yáng)性結(jié)果可以確定為真菌感染。但直接鏡檢陽(yáng)性率較低，陰性結(jié)果亦不能排除診斷；缺乏種特異性，敏感性低；易與能形成假菌絲的真菌混淆。要確診應(yīng)同時(shí)采用多種方法進(jìn)行綜合性診斷。

1.2 分離培養(yǎng)

通常用沙堡弱葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中事先加入氯霉素等抗生素，以防止細(xì)菌和其他霉菌生長(zhǎng)。病料培養(yǎng)于25～28℃，逐日觀察，根據(jù)培養(yǎng)基上形成的真菌菌落形態(tài)并結(jié)合鏡檢進(jìn)行種屬鑒定。該方法根據(jù)真菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)形態(tài)、菌落性狀、色澤、生化實(shí)驗(yàn)和菌絲及孢子形態(tài)等來(lái)鑒定病原性真菌的種屬，是國(guó)內(nèi)外學(xué)者一致認(rèn)同的兔皮膚真菌病確診依據(jù)，已廣泛應(yīng)用于該病病原的分離與鑒定。但是該方法消耗時(shí)間較長(zhǎng)，一般需要1～2周；有些非典型分離病菌還需要特殊培養(yǎng)基培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)費(fèi)用高，而且需要多年的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)，更重要的是皮膚真菌在培養(yǎng)過(guò)程中易受外界因素影響，如：溫度變化、化學(xué)藥物等，可引起菌種的代謝變化及表型特征的改變，干擾真菌菌種的檢測(cè)。

2 分子生物學(xué)方法

近年來(lái)，核酸分析技術(shù)也逐漸運(yùn)用到真菌鑒定中，因病原體的基因型比形態(tài)特征更具特異性及精確性，不會(huì)因外界影響因素 （如溫度改變、化學(xué)藥物）影響而改變，并且敏感度高、快速、簡(jiǎn)便。而且它不僅能檢測(cè)出活的致病菌，而且也能檢測(cè)出死亡的和難以培養(yǎng)的真菌。這些技術(shù)包括限制性酶切片斷多態(tài)性 （RFLP）、DNA序列分析、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD或AP-PCR)等，已運(yùn)用到真菌的鑒別、分類學(xué)及種系發(fā)生學(xué)等研究中，其中包括對(duì)皮膚病原真菌的研究。

2.1 序列分析

DNA序列測(cè)定能夠獲得DNA分子變異最為本質(zhì)的信息，對(duì)于了解基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)及分子進(jìn)化等具有重要意義。以DNA為研究對(duì)象是建立在基因序列差異的基礎(chǔ)上，所以序列分析是分子生物學(xué)研究中最根本的方法。DNA序列分析要求DNA含量及純度均較高，儀器設(shè)備昂貴，操作技術(shù)要求高，限制了它在醫(yī)學(xué)真菌研究中的廣泛應(yīng)用。近年來(lái)隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人員素質(zhì)的提高，測(cè)序已成為醫(yī)學(xué)真菌分類的常用手段。DNA序列分析被認(rèn)為是真菌鑒定最直接、最明確的指標(biāo)之一。以往由于DNA序列測(cè)定的工作量巨大和放射性危害等缺陷，獲得大量的序列資料絕非易事。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

RT-qPCR是通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。該技術(shù)是對(duì)常規(guī)PCR技術(shù)的革新，其定量和擴(kuò)增同步進(jìn)行克服了PCR的平臺(tái)效應(yīng)；除加樣開(kāi)蓋外，其后完全是閉管操作，減少污染；不需PCR后處理，避免假陽(yáng)性；可直接監(jiān)測(cè)擴(kuò)增中熒光信號(hào)變化獲得定量結(jié)果，精確性和靈敏度高；檢測(cè)速度快，幾個(gè)反應(yīng)可同時(shí)進(jìn)行，多色熒光檢測(cè)；特異性和重復(fù)性強(qiáng)；應(yīng)用范圍廣，但該方法對(duì)DNA質(zhì)和量的要求較高，實(shí)驗(yàn)儀器、試劑價(jià)格昂貴，不適宜臨床和實(shí)驗(yàn)室大量樣品的使用。

2.3 核酸雜交技術(shù)

這是一個(gè)廣義的概念。與真菌分類學(xué)有關(guān)的包括DNADNA/RNA雜交再締合分析、核酸分子探針雜交等。然而，由于真菌基因組進(jìn)化方式的原因，使得不同種間DNA重新結(jié)合的程度忽高忽低，以至難以確定供試菌之間的相互關(guān)系，使得該方法在真菌系統(tǒng)分類研究中的應(yīng)用受到限制。最常見(jiàn)的結(jié)果就是同一真菌種內(nèi)個(gè)體間的DNA雜交百分率高達(dá)90%，而關(guān)系很密切的種間雜交百分率就極低 (小于20%)，很少有雜交百分率為中等的物種對(duì)。因此，DNADNA雜交方法被限制于研究關(guān)系很密切的種下類群?jiǎn)栴}，也常用于幫助劃定種的范圍。該方法的缺陷是結(jié)果不易分析，研究中需要兩兩比較，相關(guān)物種的不同研究結(jié)果不易比較，而且需要DNA樣品的量較大。

2.4 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (RFLP)分析

RFLP分析是將真菌基因組DNA用特定限制性內(nèi)切酶酶解后電泳分離從而獲得高度多態(tài)性的圖譜，原則上只要內(nèi)切酶選擇合適，便對(duì)所有真菌均能顯示任何分類水平上的多態(tài)性和特異性，這一方法己在多種真菌 (包括酵母菌和絲狀真菌)中得到應(yīng)用，方法簡(jiǎn)便，影響因素少，穩(wěn)定性高。核糖體ITS區(qū)PCR-RFLP分析是區(qū)分常見(jiàn)皮膚癬菌有價(jià)值的方法。

2.5 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)分析

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）方法是在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上第一次運(yùn)用隨機(jī)引物擴(kuò)增，尋找多態(tài)性DNA片段作為分子標(biāo)志。因其能迅速擴(kuò)增未知靶細(xì)胞基因片段，獲得大量多態(tài)性信息，被用于生物分類鑒定和群體生物學(xué)研究。RAPD用于醫(yī)學(xué)真菌分類和鑒定能從臨床標(biāo)本中一次性的鑒定到真菌種和型的水平，能清晰分析形態(tài)學(xué)與生理學(xué)相似而遺傳特征明顯不同的真菌，特別適用于不了解基因組DNA列的真菌，方法簡(jiǎn)便迅速，結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好。

2.6 微衛(wèi)星引物PCR

微衛(wèi)星引物PCR是以 (GACA)4等寡核苷酸重復(fù)序列為引物對(duì)真菌的全基因組進(jìn)行擴(kuò)增，不同的菌株有其明顯的DNA指紋，在真菌菌種鑒定和分類上具有高效、快速等特點(diǎn)，以上研究結(jié)果表明，該技術(shù)對(duì)于病原學(xué)診斷、判斷感染來(lái)源及了解菌種地區(qū)分布等流行病學(xué)特點(diǎn)具有重要價(jià)值。

由此可見(jiàn)，所有的方法都有其優(yōu)點(diǎn)，都有一定的鑒別皮膚真菌的能力，但又都有其不足。最直接最可靠的鑒別菌種的方法是對(duì)特征性擴(kuò)增條帶的序列分析，但這并不適合臨床及一般實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。目前真菌直接鏡檢、培養(yǎng)仍是臨床上檢測(cè)真菌感染的主要方法。RAPD因其高多態(tài)性及方法簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)具有較大的發(fā)展前景，但仍存在著缺點(diǎn)，需完善提高?，F(xiàn)在還不能利用分子性狀重建一個(gè)最為精確、最為客觀的真菌系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系?，F(xiàn)在分類多還是以形態(tài)學(xué)形狀和生理學(xué)形狀為主，以分子為輔的方法。