段新華 廖治鋒

（深圳市南山區(qū)動物防疫監(jiān)督所，廣東深圳 518052）

淺談馬傳染性貧血病瓊脂凝膠免疫擴散試驗的操作

段新華 廖治鋒

（深圳市南山區(qū)動物防疫監(jiān)督所，廣東深圳 518052）

馬傳染性貧血病簡稱馬傳貧（EIA），又稱沼澤熱，是由反轉(zhuǎn)錄病毒科馬傳貧病毒引起的以間歇性發(fā)熱、貧血、黃疸及出血、進行性消瘦及浮腫為臨診特征的一種馬屬動物傳染性疾病，已分別被世界動物衛(wèi)生組織和我國農(nóng)業(yè)部列為B類疫病和二類動物疫病。瓊脂凝膠免疫擴散試驗具有操作簡便、特異性強、對設(shè)備和技術(shù)要求較低、適用于大量血清樣本檢測等特點，是目前國際貿(mào)易中的指定診斷試驗方法，也是我國農(nóng)業(yè)行業(yè)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 569-2002）?，F(xiàn)結(jié)合筆者多年馬傳染性貧血檢測經(jīng)驗對其試驗操作談幾點看法，以供參考。

馬傳貧 血清樣品 瓊脂板制備 打孔 加樣 結(jié)果判定

1 血清樣品

試驗要求待檢馬血清應(yīng)為無沉淀、無渾濁、無溶血的清涼液體，但是，在日常監(jiān)測中常常會發(fā)現(xiàn)有些馬血清樣本出現(xiàn)溶血或凝固成膠凍狀現(xiàn)象，而無法用于檢測。出現(xiàn)溶血現(xiàn)象大多是由采血不當(dāng)造成的，采血人員技術(shù)不熟練、馬匹不配合等都會造成采血困難、采血量少，造成溶血；另外，存放采好馬血的離心管在運輸或保存過程中出現(xiàn)搖晃和碰撞也會造成溶血。析出的血清出現(xiàn)凝固，大多與馬匹自身因素有關(guān)，血脂過高、營養(yǎng)不良、營養(yǎng)過剩及某些疾病都可能造成血清析出困難，因此，采樣前盡量減少對馬匹的刺激，不要在馬匹剛飼喂后或者過度勞累后立即采血。對于溶血的樣品，如果溶血不嚴(yán)重，實驗時盡量選擇清亮部分吸取，建議多做一次重復(fù)；如果溶血嚴(yán)重，則需重新采集血樣。對于出現(xiàn)果凍狀的血清樣品，可以在離心時適當(dāng)增加離心時間和離心轉(zhuǎn)速進行血清分離，如果仍無血清析出，可以用移液器吸頭向管壁輕壓，通常會有血清出現(xiàn)。

2 瓊脂板制備

2.1 瓊脂和PBS

瓊脂要選用優(yōu)質(zhì)純度高的瓊脂粉，因為其中礦物質(zhì)、金屬離子和一些不溶性雜質(zhì)都會對試驗結(jié)果造成影響。標(biāo)準(zhǔn)中要求PBS為加入萬分之一的硫柳汞的pH7.2的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液。硫柳汞主要是用來作為防腐劑和抑菌劑，但是其對人體健康具有一定的毒副作用。筆者通過試驗對比發(fā)現(xiàn)，無須加入硫柳汞同樣能達到好的實驗效果。瓊脂的濃度建議為1.2%～1.4%，試驗發(fā)現(xiàn)1%的瓊脂會偏稀，不利于打孔，而1.3%左右的瓊脂試驗效果較佳。瓊脂可以用微波爐進行加熱，將稱好的瓊脂粉和相應(yīng)磷酸緩沖液倒入錐形瓶中，搖勻，用錫紙封口，并用牙簽在瓶口扎幾個小洞，這樣不僅可以減少加熱時水分的揮發(fā)，同時也能防止瓊脂溶液沸騰時錫紙被沖開。瓊脂加熱時要使其多沸騰幾次，這樣能更好地除菌和除氣。

2.2 倒板

用直徑為90mm的玻璃平板或者一次性塑料平板，倒板建議在平整的超凈工作臺內(nèi)操作，這樣既能保證瓊脂表面平坦，又能加快平板冷卻，且也能減少空氣中細(xì)菌的污染。將熱瓊脂液15～18ml輕輕倒入平板，注意不要產(chǎn)生氣泡，如果產(chǎn)生小氣泡，可用移液器或一次性吸管將氣泡吸出。瓊脂板冷卻后要及時加蓋，防止水分蒸發(fā)，并將其翻轉(zhuǎn)放入4℃冰箱過夜。

2.3 打孔

反應(yīng)孔應(yīng)采用現(xiàn)用現(xiàn)打、按需打孔的原則，用七孔打孔器進行打孔。打孔最好用放置冰箱過夜后的平板，這樣瓊脂容易挑出。每塊平板建議打2～3組孔，孔組之間要有較寬的間隔，每個組有7孔，中間1孔，外圍6孔，每組孔可以檢測3個血清樣品，試驗中根據(jù)樣品數(shù)量確定所需孔組數(shù)。打孔時要水平輕輕壓下打孔器，不要太用力，以免破壞瓊脂板；然后用針頭或牙簽挑出孔內(nèi)切下的瓊脂，注意挑出時一定不能把瓊脂板凝膠挑破，使孔與孔之間出現(xiàn)裂痕，這樣會嚴(yán)重影響實驗結(jié)果。

2.4 封底

由于在打孔挑出孔內(nèi)瓊脂過程中會破壞瓊脂板底部的牢固性，甚至出現(xiàn)松動脫離，加樣后會導(dǎo)致陽性血清、待檢血清和抗原的相互混合，造成實驗失敗，因此瓊脂板在打孔后一定要經(jīng)過封底處理。試驗常采用酒精燈加熱的方法進行封底，但這常常造成加熱不均，封底效果欠佳，而且，對于塑料平板則更難控制溫度。筆者發(fā)現(xiàn)，用燒開的沸水進行封底，效果較好。只需將瓊脂板放入倒有沸水的器皿中，1min左右取出，冷卻即可。注意，當(dāng)需要封底的瓊脂板較多時，要增加沸水量，以保證水溫在90℃～100℃之間。

3 加樣

瓊脂板上每組梅花形7孔中，中間1孔加入抗原，四周孔間隔（按1、3、5）加入標(biāo)準(zhǔn)陽性，其余孔（2、4、6）加入待檢血清。加樣前要在瓊脂板上標(biāo)記日期和及編號。編號時可以用油性記號筆的細(xì)端直接在樣品孔對應(yīng)的平板底面進行標(biāo)記，只需標(biāo)記樣品序號即可，這樣在加樣中可以避免樣品加錯，而且能提高加樣操作效率，特別適用于大量樣本操作。加樣量大概是每孔25μl左右，因為每個平板瓊脂孔容量會有不同，建議加樣時將移液器調(diào)到30μl，然后緩慢加入孔中，當(dāng)加入液面與瓊脂孔周圍成水平時停止加樣，這樣不僅能避免加樣時產(chǎn)生氣泡，而且能保證每孔能剛好加滿。注意加入每個待檢血清樣品用一個吸頭，避免交叉污染，而且加樣時不要產(chǎn)生氣泡，如果有小氣泡可以先吸出氣泡，然后再加滿孔。樣品加完后靜置等待5min，使孔中液體吸干，再將平皿倒置放在濕盒內(nèi)，置于25℃～27℃恒溫箱進行反應(yīng)。

4 結(jié)果判定

通常反應(yīng)6h左右就開始出現(xiàn)沉淀線，12h沉淀線已經(jīng)比較明顯，已經(jīng)可以進行結(jié)果判定。判斷結(jié)果用時過久沉淀線會逐漸模糊甚至消失，可以在12h、24h做記錄，如結(jié)果無明顯差別，可作最終結(jié)果。

總之，每一個環(huán)節(jié)都有可能影響實驗結(jié)果的判定，這需要檢測工作者根據(jù)本實驗室具體情況進行操作總結(jié)，以制定出適合本實驗室的最優(yōu)檢測方案。

[1]盛曉輝.馬傳貧血病瓊脂凝膠免疫擴散試驗的方法[J].中國畜禽種業(yè)，2014，10（4）：105.