張 平 張俊波 賀志昊

(1.畢節(jié)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,貴州畢節(jié) 551700; 2.銅仁學(xué)院,貴州銅仁 554300)

盤羊肺炎支原體感染的PCR檢測

張 平1張俊波2賀志昊1

(1.畢節(jié)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,貴州畢節(jié) 551700; 2.銅仁學(xué)院,貴州銅仁 554300)

目的：建立盤羊肺炎支原體（MO）感染的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測方法，為盤羊肺炎支原體感染的檢測提供參考依據(jù)；方法：對(duì)所選取的盤羊進(jìn)行肺炎衣原體菌種的培養(yǎng)與檢測；結(jié)果：研究成功分離出MO標(biāo)準(zhǔn)株Y98、MO141分離株、絲狀支原體山羊亞種（MMC）和大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌的DNA；結(jié)論：本次研究方案的成功建立，能夠快速檢測出盤羊支原體感染的情況，進(jìn)而為治療和疾病預(yù)防及時(shí)開展提供了科學(xué)的依據(jù)。

盤羊 肺炎支原體 PCR

羊支原體肺炎是一種由支原體感染所引發(fā)的具有高度接觸性的傳染性疾病，病程可持續(xù)數(shù)月甚至是數(shù)年之久，對(duì)養(yǎng)羊業(yè)造成了極大的危害。盤羊作為我國野生動(dòng)物保護(hù)的一個(gè)重要物種，近年來有報(bào)道發(fā)現(xiàn)盤羊陸續(xù)出現(xiàn)羊支原體肺炎感染后癥狀[1]，為快速診斷出相應(yīng)病原體，本次研究對(duì)近年來常用的PCR檢查方法進(jìn)行對(duì)比，為疾病快速診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 送檢材料

本次研究選取某地送檢的1歲左右盤羊2只，兩只均為雄性盤羊，送檢時(shí)羊體明顯消瘦，并伴有氣喘、咳嗽等癥狀。

1.2 菌種與設(shè)備

本次研究中所用綿羊肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株（Y98）為中國獸藥監(jiān)察所所提供，其他菌種由本市獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。培養(yǎng)基為改良Hayflick培養(yǎng)基1%HLH47.5ml，牛肉湯30ml、豬血清共計(jì)20ml，酵母浸出液為1ml、5%醋酸鉈為0.5ml，青霉素為200u/ml。

研究所用MO間接血凝抗體檢測試劑盒為美國ADL公司所生產(chǎn)，其他相關(guān)試劑及工具酶均來自上海生工生物工程有限公司。

1.3 引物合成及DNA合成

參考標(biāo)準(zhǔn)MO168rDNA基因序列，應(yīng)用Primer5.0設(shè)計(jì)MO特異性引物1對(duì)，引物由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成。DNA提取時(shí)，取相應(yīng)菌種、顏色變黃的支原體培養(yǎng)液1.5ml，離心30min（12000r/min）后，收集沉淀物，應(yīng)用PBS洗滌重懸后，重復(fù)洗滌2次，采用200μl的TE緩沖液進(jìn)行重懸浮。熱水浴10min后快速冰浴5min，采用分光光度計(jì)對(duì)上清液的濃度進(jìn)行測定，其濃度為40/75μg/ml時(shí)，將其直接用于PCR反應(yīng)。

1.4 PCR反應(yīng)

應(yīng)用所提取的核酸作為模板進(jìn)行PCR的擴(kuò)增，以50μl體系：10*Buffer5μl，2.5mmol/LdNTPs5μl，上、下游引物各2μl，Taq DNA聚合酶0.2μl以及DNA模板2μl，加入去離子水共計(jì)50μl，預(yù)變性95℃5min，循環(huán)：94℃1min，57℃1min，72℃1min，循環(huán)30次后，72℃延伸10min，結(jié)束后應(yīng)用1%瓊脂糖膠進(jìn)行電泳，檢查實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 PCR敏感性檢測

DNA進(jìn)行10-5倍稀釋后，將其作為模板，用以上實(shí)驗(yàn)所確定的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測PCR敏感性。

1.6 PCR特異性試驗(yàn)

分別應(yīng)用培養(yǎng)的綿羊MOY98、綿羊MO分離株MO141、盤羊鼻拭子標(biāo)本所提取DNA作為模板，同時(shí)提取盤羊絲狀支原體山羊亞種（MMC）、大腸桿菌、金色葡萄球菌等DNA作為對(duì)照樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過相關(guān)步驟進(jìn)行產(chǎn)物擴(kuò)增，檢測PCR的特異性。

2 結(jié)果

2.1 PCR反應(yīng)條件及敏感性

由于不同的退火穩(wěn)定所擴(kuò)增出的片段兩對(duì)有所不同，因此應(yīng)選擇最亮的片段所有本次研究最合適的退火穩(wěn)定為56℃。而Taq DNA聚合酶的濃度應(yīng)為0.3u/μl。PCR檢測敏感性為0.4075 ng。

2.2 PCR特異性試驗(yàn)

本次研究層高分離提取出MO標(biāo)準(zhǔn)株Y98、MO141分離株、鼻拭子、絲狀支原體山羊亞種和大腸桿菌、金黃色葡萄球的DNA。通過應(yīng)用所建立的方法對(duì)各標(biāo)本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，近在Y98、MO141分離株和鼻拭子三組標(biāo)本中出現(xiàn)406bp特異性片段，其余標(biāo)本及陰性對(duì)照標(biāo)本中均未檢測到與陽性條目類似的條帶，重復(fù)試驗(yàn)時(shí)結(jié)果相同。

2.3 樣本檢測

對(duì)25份盤羊鼻拭子標(biāo)本應(yīng)用PCR檢測法見相關(guān)檢測，其中陽性7例，陽性率為28%。2例送檢樣本盤羊鼻咽黏膜沖洗液檢測陽性2例，陽性率為100%。采用支原體分離培養(yǎng)法對(duì)全部27份樣本進(jìn)行培養(yǎng)，其陽性檢出率為14.81%，采用簡潔血凝抗體檢測試劑盒對(duì)27份樣本進(jìn)行檢驗(yàn)，共計(jì)檢出陽性樣本7份，陽性率為

25.93%。

3 討論

目前臨床中對(duì)傳染疾病進(jìn)行確診時(shí)，多采用病原菌分離和體外培養(yǎng)法進(jìn)行鑒定，但實(shí)踐證實(shí)，由于支原體生長對(duì)于培養(yǎng)基、環(huán)境、血清濃度等諸多因素的要求極為嚴(yán)格，病原菌分離培養(yǎng)成功率較低，一般的實(shí)驗(yàn)室難以完成，同時(shí)由于體外培養(yǎng)的生長周期較長，因此難以用于臨床中的快速檢驗(yàn)工作[2]。但臨床中由于支原體分布范圍較廣，而部分健康動(dòng)物體內(nèi)也含有微量的抗體，因此需多次檢驗(yàn)才可確定檢測結(jié)果，同時(shí)試劑盒的成本較高，限制了該方法在臨床中大規(guī)模檢測時(shí)的應(yīng)用。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測技術(shù)是近年來新興的生物醫(yī)學(xué)技術(shù)，其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作方法簡便等諸多優(yōu)點(diǎn)，適應(yīng)用于快速檢驗(yàn)和抗原性較為復(fù)雜的細(xì)菌鑒定。本次研究所建立的PCR檢測方法，較傳統(tǒng)分離培養(yǎng)更加簡便，無須進(jìn)行分離和培養(yǎng)，僅從鼻拭子、咽喉拭子、胸腔積液、咽喉沖洗液等標(biāo)本中，即可快速檢測出MO，且檢驗(yàn)方法的敏感性極高。

4 結(jié)語

本次研究方案的成功建立，能夠快速檢測出盤羊支原體感染的情況，進(jìn)而為治療和疾病預(yù)防及時(shí)開展提供了科學(xué)的依據(jù)。

[1] 李媛，陶岳，阿依吐拉·肉孜，等.從湖羊肺臟中分離綿羊肺炎支原體的鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，28（4）：375-379.

[2] 屈勇剛，剡根強(qiáng)，陳宏偉，等.綿羊肺炎支原體 PCR 檢測方法的建立[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，23（6）：687-689.

貴州省科技合作計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合LH字〔2015〕7238號(hào)）