孫曼霽

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京100850）

·科海鉤沉·

梭曼啊，梭曼！
——紀(jì)念周廷沖院士誕辰100周年

孫曼霽

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京100850）

編者按：周廷沖（1917.03-1996.10），生化藥理學(xué)家，曾任軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院原藥理毒理研究所副所長(zhǎng)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所所長(zhǎng)，1980年當(dāng)選中國(guó)科學(xué)院學(xué)部委員（院士）。周廷沖教授1941年畢業(yè)于原上海醫(yī)學(xué)院，1947年獲英國(guó)牛津大學(xué)博士學(xué)位，1948-1949年先后在美國(guó)康乃爾大學(xué)、波士頓麻省理工學(xué)院從事生物化學(xué)研究。中華人民共和國(guó)成立后，他和妻子黃翠芬院士懷著滿(mǎn)腔愛(ài)國(guó)熱情，毅然決定回國(guó)為祖國(guó)建設(shè)貢獻(xiàn)力量，但受到美國(guó)移民局的阻撓和刁難。他們冒著被搜捕的危險(xiǎn)，乘坐舊金山開(kāi)往天津的貨船，漂洋過(guò)海，歷時(shí)56天回到祖國(guó)。謹(jǐn)此在周廷沖院士誕辰100周年之際，本刊特發(fā)此文，以茲紀(jì)念。

1949年建國(guó)初期，我國(guó)軍事醫(yī)學(xué)研究是一片空白，核化生武器及其醫(yī)學(xué)防護(hù)一無(wú)所有。當(dāng)時(shí)世界大戰(zhàn)和局部戰(zhàn)爭(zhēng)威脅著年輕的共和國(guó)。1951年，中央決定組建軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，研究戰(zhàn)時(shí)大規(guī)模特種武器傷害的醫(yī)學(xué)防護(hù)。1953年，周廷沖教授奉命調(diào)入軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院原藥理毒理研究所，創(chuàng)建藥理系。1955年，周廷沖教授與蘇聯(lián)專(zhuān)家凱林開(kāi)辦了我國(guó)第一個(gè)防化醫(yī)學(xué)訓(xùn)練班。學(xué)員們后來(lái)都成長(zhǎng)為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所及各軍醫(yī)大學(xué)的防化骨干。

神經(jīng)性毒劑是一類(lèi)強(qiáng)烈的速殺性膽堿酯酶抑制劑，乙酰膽堿酯酶失活導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿在突觸間隙大量積聚，持續(xù)地作用于下一級(jí)神經(jīng)元或效應(yīng)器，引起膽堿能系統(tǒng)反應(yīng)極度亢進(jìn)，造成嚴(yán)重的神經(jīng)功能紊亂，甚至死亡。神經(jīng)性毒劑是美軍的制式裝備，其中毒機(jī)制及防治藥物的研究就成為迫切的任務(wù)。

20世紀(jì)50年代末期，周廷沖教授開(kāi)創(chuàng)了神經(jīng)性毒劑生化藥理學(xué)研究方向。當(dāng)時(shí)，文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了丙氟磷和沙林磷（膦）?；阴Ｄ憠A酯酶老化的脫烷基現(xiàn)象，磷（膦）?；阴Ｄ憠A酯酶的重活化劑（酶的復(fù)活劑）也已發(fā)現(xiàn)。奇怪的是，重活化劑只要有足夠劑量并給得及時(shí)，對(duì)丙氟磷及沙林抑制的乙酰膽堿酯酶均顯示良好的重活化作用，而對(duì)梭曼膦酰化乙酰膽堿酯酶的重活化作用卻怎么也測(cè)不來(lái)，藥物防治研究遇到了極大的困惑。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，梭曼是神經(jīng)性毒劑中最難防治的一種毒劑，梭曼的防治是化學(xué)戰(zhàn)劑醫(yī)學(xué)防護(hù)中國(guó)際上公認(rèn)的尖端課題。藥物合成組千方百計(jì)地改構(gòu)重活化劑，藥物過(guò)篩組努力地篩選中草藥，但幾年下來(lái)，梭曼的重活化劑卻始終未能發(fā)現(xiàn)。梭曼防治向何處去？一時(shí)困擾著大家。周廷沖教授決定從梭曼膦酰化乙酰膽堿酯酶不能被重活化的機(jī)制來(lái)開(kāi)展研究。那時(shí)國(guó)內(nèi)外對(duì)梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶不能被重活化的原因有多種猜測(cè)，如轉(zhuǎn)膦?；鶎W(xué)說(shuō)、空間障礙學(xué)說(shuō)、脫烷基學(xué)說(shuō)和酶變性學(xué)說(shuō)等。國(guó)外許多實(shí)驗(yàn)室也都為闡明梭曼膦酰化乙酰膽堿酯酶老化機(jī)制而積極地探索著。我們于1961年掌握了同位素示蹤技術(shù)并提純了高比活性乙酰膽堿酯酶之后，也向梭曼沖刺。

我們?cè)O(shè)想，如果梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶老化也是脫烷基反應(yīng)，酶分子上的梭曼膦酰殘基應(yīng)該是甲膦酸，而不是特己基甲膦酸。我們將梭曼與乙酰膽堿酯酶在37℃，pH 7.2的條件下相互作用5 min，94%膦酰殘基顯示以甲膦酸形式存在，只有6%為特己基甲膦酸，大家十分興奮。進(jìn)而設(shè)想假如分子上確有膦?；霓D(zhuǎn)變，就必然有一個(gè)過(guò)程存在，那么其堿水解的降解產(chǎn)物中應(yīng)該找到殘基轉(zhuǎn)化過(guò)程的痕跡。我們又想到，一切酶反應(yīng)都是溫度依賴(lài)性的，降低反應(yīng)溫度使酶反應(yīng)過(guò)程變慢是否就能夠找到這一痕跡？果然，當(dāng)我們將溫度降至20℃時(shí)，特己基甲膦酸5 min的相對(duì)量達(dá)到22%，而0℃時(shí)，竟然高達(dá)73%。膦?；霓D(zhuǎn)變?cè)?種溫度條件下的時(shí)間進(jìn)程顯示了良好的時(shí)效性。

以上實(shí)驗(yàn)中梭曼膦酰化乙酰膽堿酯酶分子上膦?；拿撏榛?yīng)是從膦酰殘基的相對(duì)百分率判斷推定的，我們推想溫度效應(yīng)也應(yīng)該在膦?；阴Ｄ憠A酯酶活性的重活化率上得到反映。氯磷啶是沙林膦酰化乙酰膽堿酯酶活性的有效重活化劑，但實(shí)驗(yàn)證明它在37℃，pH 7.2條件下對(duì)梭曼膦酰化乙酰膽堿酯酶完全沒(méi)有重活化作用?？墒钱?dāng)我們將溫度降低至0℃時(shí)，氯磷啶對(duì)梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶竟然也顯現(xiàn)出重活化作用，實(shí)驗(yàn)證實(shí)了預(yù)先的設(shè)想。進(jìn)而我們又設(shè)想，如果老化的脫烷基學(xué)說(shuō)是正確的，那么氯磷啶對(duì)任何毒劑的未老化的磷（膦）?；阴Ｄ憠A酯酶都應(yīng)該有重活化作用，而對(duì)任何毒劑的老化的磷（膦）?；阴Ｄ憠A酯酶均應(yīng)無(wú)重活化效果，無(wú)論這種毒劑是丙氟磷、沙林、梭曼或者其他。實(shí)驗(yàn)完全證實(shí)了我們的推斷。

在有機(jī)磷（膦）毒劑抑制乙酰膽堿酯酶的反應(yīng)中，膦?；c乙酰膽堿酯酶活力中心酯解部位中被三聯(lián)體共軛效應(yīng)活化了的絲氨酸的羥基相結(jié)合，其化學(xué)鍵是C-O-P，而膦酰基的烷氧基與磷原子間的化學(xué)鍵也是CO-P。因而從方法學(xué)上可以提出這樣的質(zhì)疑，即堿水解處理樣品時(shí)，既然可以使前者的C-O-P鍵高效地?cái)嗔?，?huì)不會(huì)使后者的C-O-P鍵也被斷裂？如果那樣，烷基的脫落就可能是人工操作的假象。首先，我們證明用堿處理梭曼膦酰化乙酰膽堿酯酶時(shí)98%的膦?；撀?，說(shuō)明堿水解對(duì)結(jié)合在活力中心的C-O-P鍵是非常有效的。進(jìn)而我們用不同濃度、不同時(shí)程的堿水解反應(yīng)處理梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶樣品。結(jié)果顯示，均獲得了相似的甲膦酸和特己基甲膦酸比率，從而證明了實(shí)驗(yàn)方法的可靠性。

我們又注意到，梭曼膦酰化乙酰膽堿酯酶的膦?；缟纤鲈趶?qiáng)堿處理?xiàng)l件下不能發(fā)生脫烷基反應(yīng)，而在37℃，pH 7.2生理?xiàng)l件下卻能在瞬間脫去烷基，而且這種脫烷基反應(yīng)在0～37℃范圍內(nèi)隨溫度的升高而加快，這似乎意味著脫烷基反應(yīng)是乙酰膽堿酯酶的一種自家酶催化反應(yīng)，可能是靠近酶活力中心酯解部位的一個(gè)酸性基團(tuán)在起作用。因此，我們又設(shè)計(jì)了一組實(shí)驗(yàn)，測(cè)試梭曼膦酰化乙酰膽堿酯酶在0℃、不同pH條件下被氯磷啶重活化的效率。結(jié)果顯示，酸性條件可以加速脫烷基反應(yīng)，而堿性環(huán)境則可顯著地延遲反應(yīng)的進(jìn)程。這也完全符合酶催化反應(yīng)的性質(zhì)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)了我們的預(yù)想。

我們得出結(jié)論，膦?；阴Ｄ憠A酯酶隨著時(shí)間的進(jìn)程，由一種可以被親核試劑重新活化的狀態(tài)轉(zhuǎn)變成不能被重活化的狀態(tài)的現(xiàn)象叫做老化。老化的實(shí)質(zhì)是膦酰化乙酰膽堿酯酶分子上膦酰殘基的脫烷基反應(yīng)。它是一種單分子裂解反應(yīng)，即烷氧基團(tuán)C-O鍵的斷裂。梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶在生理?xiàng)l件下不能被重活化的原因，是由于老化發(fā)生太快致使重活化劑來(lái)不及發(fā)揮其作用的緣故，而梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶老化反應(yīng)的實(shí)質(zhì)是酶分子上毒劑殘基中特己氧基的去烷基反應(yīng)。烷基脫落后，氧原子上的負(fù)電荷排斥重活化劑的親核性使之不能進(jìn)行親核攻擊。

膦?；阴Ｄ憠A酯酶中膦酰殘基烷氧基團(tuán)對(duì)于重活化劑的親核攻擊的確存在著空間障礙，但它只是未老化的膦?；阴Ｄ憠A酯酶活性難以被重活化的原因，而不是老化的原因，因?yàn)樗荒芙忉尷匣臅r(shí)間依賴(lài)性。從而我們否定了空間障礙學(xué)說(shuō)是老化反應(yīng)的機(jī)制。

經(jīng)過(guò)3年的努力，我們對(duì)梭曼膦酰化乙酰膽堿酯酶的老化機(jī)制有了一個(gè)比較清晰完整的描述。這一成果比國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道早2年。梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶老化機(jī)制的闡明是防化醫(yī)學(xué)中的重大發(fā)展，其理論意義在于揭示了梭曼膦酰化乙酰膽堿酯酶老化的分子基礎(chǔ)，其實(shí)用意義在于指出重活化劑研究對(duì)老化的梭曼膦酰化乙酰膽堿酯酶將是徒勞的，梭曼中毒的防治應(yīng)從中毒過(guò)程的其他環(huán)節(jié)加以解決，梭曼抗毒藥物研究的方向不是重活化劑，而是抗膽堿藥和可逆性乙酰膽堿酯酶抑制劑，從而給藥物設(shè)計(jì)及梭曼中毒的防治指明了方向。至今，梭曼中毒防治藥物均嚴(yán)格遵循這一原則，藥物類(lèi)型均限定在這一基礎(chǔ)框架內(nèi)。

在弄清了梭曼膦酰化乙酰膽堿酯酶老化的分子機(jī)制后，我們又進(jìn)行了膦?；阴Ｄ憠A酯酶老化規(guī)律的研究。實(shí)驗(yàn)表明，有機(jī)磷（膦）毒劑是一類(lèi)強(qiáng)烈的乙酰膽堿酯酶抑制劑，膦?；阴Ｄ憠A酯酶的形成并不是反應(yīng)的終結(jié)，它可以繼續(xù)向2個(gè)方向轉(zhuǎn)化，即整個(gè)膦酰殘基的脫落（自動(dòng)復(fù)活）或膦?；糠謿埢拿撀洌ɡ匣?。膦酰化乙酰膽堿酯酶繼續(xù)轉(zhuǎn)化的多向性是就膦?；阴Ｄ憠A酯酶分子的群體而言的，對(duì)某一個(gè)膦?；阴Ｄ憠A酯酶分子來(lái)說(shuō)則只有一種可能。群體中哪些分子走向老化，哪些分子走向自動(dòng)復(fù)活是隨機(jī)的。在理想的體系中，所有膦酰化乙酰膽堿酯酶分子的機(jī)會(huì)是均等的。同系結(jié)構(gòu)中，膦?；阴Ｄ憠A酯酶分子朝哪個(gè)方向轉(zhuǎn)化主要取決于膦酰殘基上烷氧基團(tuán)的結(jié)構(gòu)，即膦酰化乙酰膽堿酯酶的內(nèi)部因素，而體系中的環(huán)境因素只是變化的條件。去膦?；磻?yīng)（自動(dòng)復(fù)活）及脫烷基反應(yīng)（老化）是兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立發(fā)展的過(guò)程。不同的膦?；阴Ｄ憠A酯酶發(fā)展的速度相差懸殊，發(fā)生頻率高的反應(yīng)是轉(zhuǎn)化的優(yōu)勢(shì)方向，發(fā)生頻率低的是劣勢(shì)方向。去膦?；磻?yīng)的優(yōu)勢(shì)可以接近100%，如甲氟膦酸正丁酯膦酰化乙酰膽堿酯酶，而劣勢(shì)者可趨于零，如梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶。多數(shù)有機(jī)膦毒劑則處于中間的地位。

我們系統(tǒng)地研究了梭曼及其類(lèi)似物與膦?；阴Ｄ憠A酯酶老化反應(yīng)間的規(guī)律性，揭示了毒劑殘基中烷氧基團(tuán)結(jié)構(gòu)在膦?；阴Ｄ憠A酯酶老化反應(yīng)中的獨(dú)特地位。發(fā)現(xiàn)氟甲膦酸酯系列中，烷氧基團(tuán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)老化速度影響甚大。α甲基取代促進(jìn)老化的效力大于β取代者，而α和β甲基同時(shí)取代則有顯著的協(xié)同效應(yīng)?？梢缘贸鼋Y(jié)論，α碳原子上1個(gè)甲基取代，β碳原子上3個(gè)甲基取代時(shí)，最易于老化的發(fā)生。特己氧基是促進(jìn)老化的最佳基團(tuán)，梭曼是此系列毒劑中利于老化發(fā)生的最佳結(jié)構(gòu)。進(jìn)而我們想到，如果這一結(jié)論是真實(shí)的，那么凡是有特己氧基的甲膦酸酯類(lèi)有機(jī)磷（膦）毒劑所形成的膦?；福谏?xiàng)l件下將都會(huì)迅速地發(fā)生老化，實(shí)驗(yàn)完全證實(shí)了這一推斷。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的理論意義在于闡明了神經(jīng)性毒劑化學(xué)結(jié)構(gòu)與膦?；阴Ｄ憠A酯酶老化之間的規(guī)律性，加深了對(duì)有機(jī)膦毒劑結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的認(rèn)識(shí)。其實(shí)用意在于，根據(jù)膦酰化乙酰膽堿酯酶老化的規(guī)律性預(yù)見(jiàn)一些像梭曼一樣迅速地使膦?；阴Ｄ憠A酯酶老化的未知神經(jīng)性毒劑，為新毒劑的追蹤提供線(xiàn)索。

我們?cè)谒舐Ⅴ；阴Ｄ憠A酯酶難以被重活化的研究中，還考慮到中毒機(jī)體內(nèi)存在“過(guò)剩的”游離毒劑的可能性。果如所料，大鼠在1個(gè)致死劑量以上中毒時(shí)，腦和膈肌中均有游離毒劑存在，表現(xiàn)在對(duì)外加乙酰膽堿酯酶的抑制。劑量愈大，游離毒劑愈多。梭曼中毒時(shí)的游離毒劑比等致死劑量的沙林及塔崩中毒時(shí)多，顯示了梭曼的特殊性。游離毒劑的發(fā)現(xiàn)，從作用機(jī)制上給神經(jīng)性毒劑毒理學(xué)增添了新的內(nèi)容，給中毒防治及解毒藥物的研究提出了新的啟示，乙酰膽堿酯酶的再抑制可能是膦?；阴Ｄ憠A酯酶難以恢復(fù)活性的又一原因。十多年后，國(guó)外文獻(xiàn)才提出了毒劑庫(kù)的概念。

根據(jù)酶的催化原理，酶具有同時(shí)催化正向和逆向反應(yīng)的性質(zhì)，我們又研究了神經(jīng)性毒劑酶促合成的可能性。發(fā)現(xiàn)G類(lèi)毒劑，如梭曼及沙林的水解產(chǎn)物氟離子和甲膦酸酯，在試管內(nèi)有外加乙酰膽堿酯酶存在的條件下，可被G類(lèi)毒劑水解酶催化重新合成毒劑，表現(xiàn)在對(duì)外加乙酰膽堿酯酶活性的嚴(yán)重抑制。我們?cè)趪?guó)外發(fā)表后，被認(rèn)為是G類(lèi)毒劑中毒機(jī)制研究中又一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，國(guó)外迄今沒(méi)有報(bào)道。

光陰荏苒，斗轉(zhuǎn)星移，與梭曼打拼的這一段歷史不覺(jué)已離去了幾十年。周廷沖院士已經(jīng)仙逝，那時(shí)一塊兒為梭曼膦?；阴Ｄ憠A酯酶老化機(jī)制研究戰(zhàn)斗拼搏的同志也都年逾古稀，你們還記得那些苦思冥想又興高采烈的時(shí)光嗎？今天，我們已經(jīng)能用生物藥物預(yù)防比格犬6個(gè)致死量的梭曼中毒，并將1個(gè)致死量梭曼中毒的預(yù)防時(shí)程提高到了7天。第二代生物藥物抗毒研究也在規(guī)劃之中。這是自1958年周廷沖教授提出A70生物制劑后，我們?nèi)〉玫淖钚逻M(jìn)展。如果周廷沖老師能聽(tīng)見(jiàn)這些喜訊該是多么地欣慰??！

今天，在這里寫(xiě)下這篇回憶性的科技散文，紀(jì)念周廷沖老師對(duì)我們的指導(dǎo)和引領(lǐng)，以及與大家建立的深厚的戰(zhàn)斗友誼，以寄托我們的懷念。

（本文編輯：齊春會(huì)）

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.03.001

：1000-3002-（2017）03-0207-03

2017-02-16接受日期：2017-03-16）