王秀麗，張 媛，李 建，彭國瑞，劉 博，辛凌翔，蔣玉文

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.10.04

豬霍亂沙門氏菌C79102株的制備與檢定

王秀麗，張 媛，李 建，彭國瑞，劉 博，辛凌翔，蔣玉文*

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

為研究豬霍亂沙門氏菌C79102株的菌種特性，制備了一批豬霍亂沙門氏菌C79102株，并對菌種的真空度、純粹、剩余水分、培養(yǎng)特性、形態(tài)及生化特性、血清學(xué)特性、特異性、毒力等進(jìn)行檢定，重點(diǎn)對菌種的毒力進(jìn)行研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，該凍干菌種的真空度、純粹、剩余水分、培養(yǎng)特性、形態(tài)及生化特性、血清學(xué)特性均符合《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》二〇〇〇版質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，特異性檢驗(yàn)結(jié)果顯示C79102在含1%醋酸鉈的普通肉湯中不生長，毒力試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同制備方法獲得的肉肝胃消化湯培養(yǎng)的菌液毒力差異明顯。本研究可以為豬霍亂沙門氏菌的制備和檢定提供參考依據(jù)。

豬霍亂沙門氏菌C79102株；特異性；毒力

仔豬副傷寒又稱豬沙門氏菌病，是由豬霍亂沙門氏菌引起的仔豬高熱性傳染病，該病分布廣泛，主要感染斷奶期仔豬，臨床上以急性敗血癥、慢性壞死性腸炎、頑固性下痢等為特征，當(dāng)并發(fā)或繼發(fā)感染其它疾病或治療不及時(shí)時(shí)，死亡率較高，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重困擾著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[1]。在我國，豬沙門氏菌感染率很高，在屠宰中往往污染豬肉，引起人沙門氏菌感染發(fā)病。接種疫苗是主要的預(yù)防手段。

豬霍亂沙門氏菌C79102株為仔豬副傷寒活疫苗效力檢驗(yàn)用強(qiáng)毒菌種，也是仔豬副傷寒沙門氏菌C500株菌種檢定免疫原性試驗(yàn)的攻毒菌種，分離自江蘇淮陰豬，血清型為6，7：C：1，5[2-3]，對仔豬副傷寒活疫苗免疫效果的評價(jià)有重要意義?！吨腥A人民共和國獸用生物制品規(guī)程》中規(guī)定本菌種在2～8 ℃保存期為10 年[3]。新制備的菌種需滿足《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》二〇一〇版中的該菌種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本文詳細(xì)報(bào)告C79102株豬霍亂沙門氏菌的制備和檢定方法及結(jié)果，以期為將來菌種的溯源和檢定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種 豬霍亂沙門氏菌CVCC79102株，1990年3月16日凍干，F(xiàn)5，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心提供。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 普通瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、硫鹽(TG)、酪胨瓊脂(GA)、葡萄糖蛋白胨湯(GP)、生理鹽水、5% 蔗糖脫脂牛奶、肉肝胃膜消化湯、肉肝胃酶消化湯、肉肝胃消化湯(干粉)均購自北京中海生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌生化鑒定試紙條，購買自biomerieux.sa公司，革蘭氏染色液購自山東奧博星生物技術(shù)有限公司，沙門氏菌O7因子血清購自丹麥國家血清研究所(SSI)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)兔購自北京隆安實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；健康易感豬，菌種復(fù)壯用健康易感豬購自河北某養(yǎng)殖場，毒力試驗(yàn)用健康易感豬購自山東某養(yǎng)殖場。

1.4 菌種復(fù)壯，凍干 開啟1990年3月16日凍干的豬霍亂款沙門氏菌C79102株，用普通肉湯溶解后，取少量菌液劃線接種2付普通瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h。

從河北某養(yǎng)殖場采集4 份12 kg以上健康斷奶仔豬的血液，分離血清，56 ℃滅能30 min，冷卻至室溫后備用；將其中1付普通瓊脂平板上的培養(yǎng)物用生理鹽水洗下，用分光光度計(jì)調(diào)濃度至OD600mm為1.5左右，煮沸30 min，冷卻至室溫備用；4份血清分別取100 uL 2倍系列稀釋至2～4稀釋度，每孔分別加入100 uL的滅活抗原，用封板膜封板后置于37 ℃孵育24 h，未出現(xiàn)凝集的判定為健康易感豬。

挑取另1付普通瓊脂平板上的單菌落接種于20 mL普通肉湯中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，取10 mL靜脈注射篩選出的12 kg以上的健康易感斷奶仔豬，豬死亡后剖解，無菌取肝臟和心血，用接種環(huán)分別取少量肝臟、心血接種普通瓊脂平板各1付，分別接種10 mL普通肉湯，37 ℃培養(yǎng)24 h。

若普通瓊脂平板和普通肉湯中的細(xì)菌純粹生長，挑取平板上的若干個(gè)單菌落接種普通瓊脂斜面小管若干支，37 ℃培養(yǎng)24 h后，接種預(yù)培養(yǎng)24 h無菌生長的普通瓊脂斜面中管，37 ℃培養(yǎng)24 h。用含5%蔗糖的10%脫脂牛奶將菌體洗下，收集于含玻璃珠的滅菌分裝瓶中，充分振蕩混勻后，用16號長針頭注射器分裝至安瓿瓶中，按照特定的凍干曲線凍干后封口。

1.5 菌種的檢定

1.5.1 真空度測定、純粹檢驗(yàn)及剩余水分測定 按現(xiàn)行《中國獸藥典》[4]進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.5.2 培養(yǎng)特性 用接種環(huán)取少量菌體在普通瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)18～20 h，觀察菌落形態(tài)。

1.5.3 形態(tài)和生化特性 取新鮮培養(yǎng)的普通瓊脂平板上的菌體參照試劑盒的說明書進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌落形態(tài)，用生化鑒定試紙條參照使用說明書進(jìn)行生化特性檢查。

1.5.4 血清學(xué)特性 用無菌棉拭子在普通瓊脂平板培養(yǎng)物上取適量菌苔，在生理鹽水中混勻，用分光光度計(jì)測定菌液濃度，調(diào)整菌液濃度至OD600mm為1.5左右，取50 uL菌液與等體積的沙門氏菌O7因子血清進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，3 min內(nèi)觀察結(jié)果。

1.5.5 特異性 用接種環(huán)取普通瓊脂平板上的單菌落接種含1% 醋酸鉈的普通肉湯10 mL，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察C79102的生長情況。

1.5.6 毒力測定 從山東某養(yǎng)殖場采集12 份12 kg以上健康斷奶仔豬的血清，56 ℃滅能30 min，冷卻至室溫后備用；篩選方法同1.4菌種復(fù)壯中健康易感仔豬的篩選。

挑取新鮮培養(yǎng)的普通瓊脂平板上的單菌落接種肉肝胃膜消化湯，37 ℃培養(yǎng)24 h后(肉肝胃消化湯1代培養(yǎng)物)分別取0.1 mL接種于10 mL肉肝胃膜消化湯、10 mL肉肝胃酶消化湯和10 mL肉肝胃消化湯(干粉)，接種完后將肉肝胃消化湯1代培養(yǎng)物置于2～8 ℃保存?zhèn)溆茫髮⒔臃N物置于37 ℃培養(yǎng)24 h(肉肝胃消化湯2代培養(yǎng)物)；分別對肉肝胃消化湯2代培養(yǎng)物進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，再取2～8 ℃保存的肉肝胃消化湯1代培養(yǎng)物0.1 mL分別接種于10 mL肉肝胃膜消化湯、10 mL肉肝胃酶消化湯和10 mL肉肝胃消化湯(干粉)，置于37 ℃培養(yǎng)24 h；參照初次培養(yǎng)的肉肝胃消化湯2代培養(yǎng)物的計(jì)數(shù)結(jié)果，分別用肉肝胃膜消化湯將3種后接種培養(yǎng)物稀釋到20 CFU/mL、25 CFU/mL，每個(gè)濃度的菌液分別皮下注射2只兔子，每只注射1.0 mL。將后接種肉肝胃膜消化湯2代培養(yǎng)物分別用肉肝胃膜消化湯稀釋至1.5×108CFU/mL、2.0×108CFU/mL、2.5×108CFU/mL，每個(gè)濃度的菌液分別靜脈注射3頭12 kg以上的健康易感斷奶仔豬，每頭豬注射菌液2.0 mL。然后對攻毒的菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，確定實(shí)際的攻毒菌數(shù)。家兔和豬攻毒后均觀察21 d，家兔應(yīng)全部死亡，豬應(yīng)至少死亡2頭[3]。

2 結(jié) 果

2.1 真空度測定 對凍干的150支菌種進(jìn)行檢驗(yàn)，2/150無輝光，148/150呈現(xiàn)白色或粉色或紫色輝光，2支無真空的菌種121 ℃高壓30 min處理。

2.2 純粹檢驗(yàn) 隨機(jī)抽取5支真空度測定良好的菌種進(jìn)行檢驗(yàn)，5/5純粹，符合規(guī)定。

2.3 剩余水分測定 隨機(jī)抽取16 支菌種，隨機(jī)分為4 組，測定剩余水分，結(jié)果為0.9%、0.2%、0.3%、0.7%，均小于4.0%，符合規(guī)定。

2.4 培養(yǎng)特性 C79102在普通瓊脂平板上37 ℃培養(yǎng)20 h，菌落為圓形、邊緣整齊、突起、半透明、略濕潤的光滑型，符合規(guī)定。

2.5 形態(tài)和生化特性 新鮮培養(yǎng)的普通瓊脂平板上的菌體參照試劑盒的說明書進(jìn)行革蘭氏染色，為革蘭氏陰性小桿菌，符合規(guī)定。生化鑒定結(jié)果符合細(xì)菌分類學(xué)中沙門氏菌的生化特性，生化特性檢查結(jié)果見表1。

2.6 血清學(xué)特性 C79102在普通瓊脂平板上的新鮮培養(yǎng)物與沙門氏菌O7因子血清出現(xiàn)典型的凝集反應(yīng)(呈片狀凝集)，符合規(guī)定。

2.7 特異性 在含1%的醋酸鉈的普通肉湯中不生長。

2.8 毒力 本試驗(yàn)選擇肉肝胃膜消化湯、肉肝胃酶消化湯、肉肝胃消化湯(干粉)3種培養(yǎng)基培養(yǎng)菌液對家兔進(jìn)行毒力試驗(yàn)，結(jié)果顯示，C79102以1% 的接種量(肉肝胃消化湯1代培養(yǎng)物0.1 mL接種10 mL肉肝胃消化湯)接種3種肉肝胃消化湯，37 ℃培養(yǎng)24 h(肉肝胃消化湯2代培養(yǎng)物)，在肉肝胃消化湯(干粉)培養(yǎng)基中菌液濃度最高，為2.9×109CFU/mL，但毒力最差，最小致死劑量大于25.2 CFU，在肉肝胃酶消化湯和肉肝胃膜消化湯中菌數(shù)相當(dāng)，分別為1.4×109CFU/mL，1.5×109CFU/mL，肉肝胃膜消化湯中毒力最強(qiáng)，最小致死劑量小于18.7 CFU，，在肉肝胃酶消化湯培養(yǎng)的菌液最小致死劑量大于19.4 CFU，結(jié)果見表2。因此選擇肉肝胃膜消化湯培養(yǎng)的菌液對健康易感仔豬進(jìn)行毒力試驗(yàn)，結(jié)果顯示，C79102株沙門氏菌對健康易感斷奶仔豬的最小致死劑量小于3.8×108CFU/mL，符合規(guī)定，結(jié)果見表3。

"+"表示反應(yīng)結(jié)果陽性，"-"表示反應(yīng)結(jié)果陰性。

"0～2"表示家兔死亡的數(shù)量；"/"表示動(dòng)物全部死亡后無死亡記錄。

"0～2"表示健康易感仔豬死亡的數(shù)量，"/"表示動(dòng)物全部死亡后無死亡記錄。

3 討論與小結(jié)

豬霍亂沙門氏菌C79102株經(jīng)檢定其培養(yǎng)特性、形態(tài)及生化特性、血清學(xué)特性、毒力均符合《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》二〇〇〇年版標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。毒力試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同肉肝胃消化湯培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液濃度差異明顯，肉肝胃消化湯(干粉)培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液菌數(shù)最高但是毒力最弱，肉肝胃膜消化湯和肉肝胃酶消化湯培養(yǎng)的菌液濃度差異不明顯，肉肝胃膜消化湯培養(yǎng)的菌液毒力更強(qiáng)，最小致死劑量小于18.7 CFU。文獻(xiàn)報(bào)道的效力檢驗(yàn)中兔子的最小致死劑量為18～19 CFU[5～7]。但新鮮肉肝胃膜消化湯中的肉湯受動(dòng)物的年齡及肉、肝、胃的新鮮程度和消化程度影響較大[7]，不同批次的新鮮肉肝胃膜消化湯差異較大，導(dǎo)致測毒結(jié)果不穩(wěn)定，本次制備及檢定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以為將來C79102株的制備及檢定提供參考資料。

豬霍亂沙門氏菌C79102株的制備及檢定的依據(jù)為《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》二〇〇〇年版，但是在《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》二〇〇〇年版中未涉及到C79102株的制備依據(jù)，僅規(guī)定了C79102株的毒力標(biāo)準(zhǔn)，未涉及培養(yǎng)特性、形態(tài)及生化特性、血清學(xué)特性、特異性等的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，而以往中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的歸檔資料中對于C79102菌株的檢定參照C500株進(jìn)行，因C500株是在1% 醋酸鉈的壓力下篩選的弱毒菌株，所以在含1% 的醋酸鉈的普通肉湯中能夠均勻渾濁生長，而C79102株未經(jīng)過壓力篩選，在含醋酸鉈的普通肉湯中不生長，故C500株的特異性檢驗(yàn)結(jié)果與C79102株不同。綜上所述，建議對C79102株的制備及檢定依據(jù)進(jìn)行修訂。

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ThePreparationandCertificationofSalmonellacholeraesuisStrainC79102

WANG Xiu-li, ZHANG Yuan, LI Jian, PENG Guo-rui, LIU Bo, XIN Ling-xiang, JIANG Yu-wen*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

JIANGYu-wen,E-mail：jiangyuwen@ivdc.org.cn

In order to study the bacterial characteristics ofSalmonellacholeraesuisC79102 strain, a batch ofSalmonellacholeraesuisstrain C79102 was prepared, and then the vacuum degree, residual moisture, morphology, culture characteristics, biochemical properties, serological characteristics, virulence, and immunogenicity were tested. The results showed that the vacuum degree, purity test result, residual moisture, morphology, culture characteristics, biochemical properties, serological characteristics of C79102 conformed to the Veterinary Biological Products Regulations of the People's Republic of China, 2000 edition, Specificity test result showed that C79102 could not grow in common broth with 1% acetic acid thallium. The virulence test results showed that the virulence of C79102 obviously affected by meat liver stomach digested nmedium's quality. This research could provide some reference data to the preparation ofSalmonellacholeraesuisstrain C79102.

Salmonellacholeraesuisstrain C79102; specificity; virulence

2017-03-06

A

1002-1280 (2017) 10-0024-05

S852.61

王秀麗，助理研究員，主要從事獸用生物制品的檢驗(yàn)及研究工作。

蔣玉文。E-mail：jiangyuwen@ivdc.org.cn

(編輯：陳希)