高 潔，賀爭(zhēng)鳴

(中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 100050)

小鼠諾如病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

高 潔，賀爭(zhēng)鳴

(中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 100050)

目的建立小鼠諾如病毒(murine norovirus，MNV)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，為建立MNV規(guī)范化檢測(cè)方法提供依據(jù)。方法根據(jù)NCBI公布的60個(gè)MNV病毒株核酸序列設(shè)計(jì)特異性引物，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)控品，建立MNV實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，并進(jìn)行特異性、靈敏度、重復(fù)性及穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。用該方法對(duì)766只送檢小鼠的盲腸內(nèi)容物樣品進(jìn)行檢測(cè)，初步了解北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)小鼠MNV感染狀況。結(jié)果成功建立MNV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，該方法特異性好，與同種屬人類諾如病毒(HuNoVs)、貓杯狀病毒(FCV)均無(wú)交叉反應(yīng)，檢測(cè)靈敏度可達(dá)101copies/μL。批內(nèi)及批間CT值變異系數(shù)均小于2%。應(yīng)用該方法在766份小鼠盲腸內(nèi)容物樣品中檢出301份MNV核酸陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率39.3%。結(jié)論建立的MNV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法特異性好，靈敏度高，重復(fù)性好，可以用于MNV的快速定量檢測(cè)。

鼠諾如病毒MNV;實(shí)時(shí)熒光定量PCR;檢測(cè)

【Key words】Murine norovirus;Fluorescent quantitative PCR;Detection

諾如病毒(murine norovirus，MNV)屬杯狀病毒科諾如病毒屬，是無(wú)囊膜的單股正鏈RNA病毒，核酸大小為7.4～7.6 kb。其原型MNV-1最早從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)與重組體激活基因2(RAG2)缺陷(RAG2-/-/STAT1-/-)小鼠中分離得到。MNV-1可致免疫缺陷(STAT1-/-，STAT1-/-/PKR-/-，RAG-/-/STAT1-/-)小鼠腹瀉或死亡，也可致干擾素受體缺失(IFNαβγ-/-)小鼠出現(xiàn)高致死性［1］。MNV感染正常小鼠無(wú)明顯臨床癥狀［2］，其感染小鼠后主要侵染免疫細(xì)胞［3］(樹突狀細(xì)胞核巨噬細(xì)胞)。有研究表明 MNV感染可提高小鼠細(xì)小病毒 (mouse parvovirus，MPV)含量并延長(zhǎng)其排毒時(shí)間［4］。此外，MNV感染可使腸道固有層(lamina propria，LP)、腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric lymph node，MLN)等處的樹突狀細(xì)胞cDCs (conventional dendritic cells)數(shù)量下降［5］。

MNV是目前唯一能在體外有效增殖的諾如病毒［3］，其可在鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)并引起細(xì)胞病變效應(yīng)，為諾如病毒分子機(jī)制的研究提供了細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，也使得MNV成為研究人類諾如病毒(human norovirus，HuNoVs)生物學(xué)特征的最佳替代模型［6，7］。

小鼠是目前廣泛使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，其微生物狀況是影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有效性和重現(xiàn)性的重要因素。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān) MNV感染機(jī)制和檢測(cè)方法的研究迅速發(fā)展，全球多項(xiàng)研究表明MNV在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施中有很高的感染率［8，9］。歐洲實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)聯(lián)合會(huì)(FELASA)、國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)協(xié)會(huì)(ICLAS)、美國(guó)Charles River實(shí)驗(yàn)室等已將MNV列入實(shí)驗(yàn)小鼠常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，我國(guó)尚未將MNV列入實(shí)驗(yàn)小鼠質(zhì)量控制的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)旨在建立特異、靈敏、快速、定量精準(zhǔn)的 MNV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，為我國(guó)建立MNV規(guī)范化檢測(cè)方法提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒及檢測(cè)樣品

小鼠諾如病毒(MNV)BJ10-2062［10］由本實(shí)驗(yàn)室分離保存;MNV-1(CW1)、RAW264.7細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，編號(hào)分別為 PTA-5935，TIB-71;貓杯狀病毒(feline calicivirus，F(xiàn)CV)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供;人諾如病毒(human norovirus，HuNoVs)由中國(guó)食品藥品檢定研究院腸道病毒室提供;pMD19-T simple vector質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品委托寶生物工程(大連)有限公司合成;766份小鼠盲腸內(nèi)容物樣品來(lái)源于北京9個(gè)送檢單位。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

SPF級(jí)KM小鼠，SPF級(jí)BABL/c小鼠，SPF級(jí)C57BL/6小鼠，SPF級(jí) NIH小鼠(實(shí)驗(yàn)單位使用許可證號(hào):SYXK(京)2011-0008，生產(chǎn)許可證號(hào): SCXK(京)2014-0013，質(zhì)量檢測(cè)單位:國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)中心)。

1.3 主要試劑及儀器

RNA提取試劑盒(RNeasy Mini Kit、Cador? Pathogen 96 QIAcube? HT Kit)購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司;100 bp DNA marker、Taq HS酶、脫氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP)、10 x PCR buffer及 SYBR@Premix Ex TaqTMGC(Perfect Real Time)均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。PCR 儀:美國(guó) ABI公司 Veriti 96 well Thermal cycler;全自動(dòng)核酸提取儀:德國(guó) Qiagen公司QIAcubeHT;核酸瓊脂糖凝膠電泳儀:美國(guó) Bio-Rad公司 PowerPac Basic;凝膠成像分析儀:美國(guó) Kodak公司 GL212Pro;熒光定量 PCR儀:美國(guó) ABI公司7500 Fast Real-Time PCR System。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)控品的制備

將MNV BJ10-2062基因保守區(qū)域(5018-5450 nt)連接至 pMD19-T simple vector構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)控品，該片段包含引物所要擴(kuò)增的片段并可進(jìn)行熔解曲線分析。連接完成后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大腸桿菌DH5α，挑取陽(yáng)性克隆并測(cè)序鑒定。提取質(zhì)粒，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260nm和A280nm A值，計(jì)算質(zhì)粒濃度，并分裝保存于 -20℃。

1.5 引物的設(shè)計(jì)

將NCBI公布的60個(gè)MNV分離株全基因組序列進(jìn)行比對(duì)，分析其共有的保守序列，采用 ABI PrimerExpress 3.0實(shí)時(shí)熒光定量 PCR引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)擴(kuò)增用引物4對(duì)，從擴(kuò)增效率、特異性、靈敏度等方面分析，選擇最佳引物MNV-4F、MNV-4R。引物由美國(guó) ABI公司合成。序列如下(表1):

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR擴(kuò)增體系的建立

分析擴(kuò)增效率、熔解曲線等數(shù)據(jù)，優(yōu)化熒光定量PCR反應(yīng)體系中使用的引物、模板、PCR MIX濃度，確定最佳反應(yīng)體系(表2)。設(shè)定不同退火溫度，確定最佳反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30 s;然后95℃10 s，60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)延伸結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)，最后進(jìn)行熔解曲線分析。在反應(yīng)管中按表2體系加樣，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。

用含有目的片段的質(zhì)粒pMD19-T vector作為標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)控品，根據(jù)公式 copies/μL=(6.02×1023) ×(ng/μL×10-9)/(base pairs×660)，計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)。將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板梯度稀釋為1.1 ×108copies/μL～1.1×101copies/μL，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 MNV熒光定量PCR引物Tab.1 The sequences of primers used for amplification of MNV gene

表2 MNV熒光定量PCR反應(yīng)體系Tab.2 Real-time PCR reaction system of MNV

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)評(píng)價(jià)

以貓杯狀病毒(FCV)、人諾如病毒(HuNoVs)及RAW264.7細(xì)胞作為對(duì)照，檢測(cè) MNV實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法的特異性;用本方法對(duì) 106copies/ μL，105copies/μL，104copies/μL 3個(gè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)控品進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)檢測(cè)3個(gè)次批，每批次做5個(gè)重復(fù)，計(jì)算試驗(yàn)內(nèi)、試驗(yàn)間變異系數(shù)，評(píng)價(jià)本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法的靈敏度實(shí)驗(yàn)

將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板梯度稀釋為1.1×109copies/μL ～1.1×100copies/μL，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品做3個(gè)重復(fù)。所能檢測(cè)的最小濃度的循環(huán)閾值(CT)≤ 35，據(jù)此得出該方法的檢測(cè)靈敏度。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法的初步應(yīng)用

利用該方法檢測(cè)來(lái)自北京9個(gè)送檢單位的766份小鼠樣品。取小鼠盲腸內(nèi)容物樣品于 500 μL PBS溶液中，渦旋振蕩，12 000 r/min離心5 min，取上清液，用全自動(dòng)核酸提取儀提取 RNA，逆轉(zhuǎn)錄后以 cDNA為模板檢測(cè)小鼠盲腸內(nèi)容物。每次設(shè)108～101copies/μL標(biāo)準(zhǔn)品及 RAW264.7細(xì)胞陰形對(duì)照。標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照及樣品做3個(gè)重復(fù)。

以 MNV BJ10-2062細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)口感染8周齡雌性 KM、BABL/c、C57BL/6、NIH四個(gè)品系的小鼠，自染毒24 h起每間隔24 h取其糞便，用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。于染毒10、21、56 d后取小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、小腸、大腸、盲腸、卵巢、子宮、胸腺組織及盲腸內(nèi)容物進(jìn)行檢測(cè)。此外，將正常小鼠與陽(yáng)性小鼠同籠飼養(yǎng)，并檢測(cè)正常小鼠糞便樣品。

判斷標(biāo)準(zhǔn):建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù) slope在 -3～-3.5之間、R2大于0.99、擴(kuò)增效率在90% ～110%之間，可以判定實(shí)驗(yàn)成立，建立的方法可用于定量檢測(cè)［11］。

陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn):樣品循環(huán)閾值(CT)＜35，判定該樣品檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性;循環(huán)閾值(CT)≥35，不能確定被檢樣品是陽(yáng)性樣品，結(jié)果判定為陰性。

1.10 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法與ELISA檢測(cè)方法的比較

采集同一只小鼠的盲腸內(nèi)容物與血清666份，分別進(jìn)行熒光定量 PCR核酸檢測(cè)和重組抗原ELISA抗體篩查，比較兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性檢出率。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)控品的制備

陽(yáng)性克隆載體經(jīng)測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果與 MNV BJ10-2062分離株核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，符合率為100%。表明標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)控品構(gòu)建成功，可作為MNV熒光定量PCR檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。

根據(jù)公式 copies/μL=(6.02×1023)×(ng/μL ×10-9)/(DNA length×660)，計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為7.9×1010copies/μL，取出部分樣品稀釋至1.1× 109copies/μL，分裝保存于-20℃。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR擴(kuò)增體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

對(duì)反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到 MNV擴(kuò)增曲線結(jié)果(圖1)。其循環(huán)閾值(CT)為20.03，拷貝數(shù)為2.59×105copies/μL，分析其熔解曲線(圖2)，可知熔解曲線為單峰，無(wú)非特異性反應(yīng)。

用含有目的片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，梯度稀釋為1.1×108～1.1×101copies/μL，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，得到陽(yáng)性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。擴(kuò)增曲線(圖3)各稀釋梯度間距均等，擴(kuò)增效率為98.32%。標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)的線性范圍是1.1 ×107～1.1×102copies/μL，線性相關(guān)系數(shù) slope為-3.216，R2值為0.998，表明線性明相關(guān)性高，定量結(jié)果有效、可靠。建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)符合標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定范圍，可用于定量檢測(cè)。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)方法的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)評(píng)價(jià)

2.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)方法特異性檢測(cè)結(jié)果:分別以MNV BJ10-2062、HuNoVs、FCV 及RAW267.4細(xì)胞核酸提取物為模板進(jìn)行熒光定量 PCR反應(yīng)，結(jié)果如圖5所示，可以看出以 HuNoVs、FCV、RAW264.7細(xì)胞為模板，擴(kuò)增曲線為直線無(wú)擴(kuò)增，而以MNV BJ10-2062為模板的擴(kuò)增曲線明顯。說(shuō)明建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法具有良好的特異性。

2.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)方法重復(fù)性和穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果:以起始濃度分別為 1.1×106copies/ μL、1.1×105copies/μL、1.1×104copies/μL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，分別進(jìn)行五次試驗(yàn)內(nèi)重復(fù)和三次試驗(yàn)間重復(fù)，計(jì)算試驗(yàn)內(nèi)和試驗(yàn)間CT值、定量拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，三個(gè)濃度的最終實(shí)測(cè)定量拷貝數(shù)分別為 1.074×106copies/μL、1.118×105copies/μL、1.092×104copies/μL，單次試驗(yàn)內(nèi)循環(huán)閾值(CT)的變異系數(shù)(CV)分別為0.3%、0.3%、0.05%，試驗(yàn)間循環(huán)閾值(CT)的變異系數(shù)(CV)分別為 1.1%、0.6%、0.8%，變異系數(shù)均小于2%，表明此方法精密度高，具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)方法靈敏度檢測(cè)結(jié)果

以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，10倍梯度稀釋為109copies/μL～100copies/μL，進(jìn)行熒光定量 PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示擴(kuò)增曲線(圖6)各稀釋度間距均勻，標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖7)線性范圍良好?？梢钥闯鰳?biāo)準(zhǔn)品稀釋到1.1×101copie/μL時(shí)有明顯擴(kuò)增曲線，CT值為33.871，拷貝數(shù)為1.08×101copie/μL，在可檢測(cè)范圍之內(nèi);標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到1.1×100copie/μL時(shí)擴(kuò)增曲線為水平直線無(wú)擴(kuò)增，超出可信范圍。因此，認(rèn)為該法的最低檢測(cè)限度為10 copies/μL，具有良好的靈敏度。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用

將所建立的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法應(yīng)用于北京市9個(gè)送檢單位的766份小鼠盲腸內(nèi)容物樣品的檢測(cè)。出現(xiàn)疑似陽(yáng)性的樣品進(jìn)行復(fù)檢，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，對(duì)部分拷貝數(shù)較高的樣品進(jìn)行普通 PCR反 應(yīng) (MNVCF: CAGATCACATGCTTC CCAC; MNVCR:AGACCACAAAAGACTCATCAC)并測(cè)序驗(yàn)證。在766份小鼠盲腸內(nèi)容物樣品中檢出陽(yáng)性樣品301份，陽(yáng)性率39.3%，測(cè)序結(jié)果顯示檢出樣本與MNV BJ10-2062序列同源性高達(dá)97%以上。

以MNV BJ10-2062經(jīng)口感染8周齡雌性 KM、BABL/c、C57BL/6、NIH四個(gè)品系的小鼠，結(jié)果顯示各品系小鼠自染毒24 h即開始排毒，排毒時(shí)間約為30 d。染毒10 d、21 d后取小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、小腸、大腸、盲腸、卵巢、子宮、胸腺組織及盲腸內(nèi)容物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示染毒10 d、21 d的小鼠其脾臟、大腸、小腸、盲腸及盲腸內(nèi)容物均有陽(yáng)性檢出，其中，以盲腸和盲腸內(nèi)容物病毒拷貝數(shù)最高(圖 8，9)。有文獻(xiàn)［12］報(bào)道在肝臟中也可檢出MNV，本次實(shí)驗(yàn)未在肝臟中檢出，可能與病毒株感染能力差異、感染劑量及個(gè)體差異有關(guān)。正常小鼠與陽(yáng)性小鼠同籠飼養(yǎng)48 h后糞便中有陽(yáng)性檢出。

表3 MNV qPCR檢測(cè)試驗(yàn)內(nèi)及試驗(yàn)間重復(fù)性Tab.3 Repeatability of the intra-assay and inter-assay of MNV real-time PCR detection

圖1 MNV擴(kuò)增曲線Fig.1 Amplification curve of the MNV

圖2 MNV擴(kuò)增熔解曲線Fig.2 The melting curve of MNV

圖3 1.1×108～1.1×101copies/μL標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒擴(kuò)增曲線Fig.3 Amplification curves of 1.1×108to 1.1×101copies/μL standard

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)方法與ELISA檢測(cè)方法的比較

對(duì)同一只小鼠的盲腸內(nèi)容物和血清分別進(jìn)行熒光定量PCR核酸檢測(cè)和重組抗原ELISA抗體篩查，結(jié)果顯示，在 666份小鼠樣品中，熒光定量PCR檢測(cè)方法檢出陽(yáng)性樣品 291份，陽(yáng)性率為44%，ELISA檢測(cè)方法檢出陽(yáng)性樣品224份，陽(yáng)性率為33%，熒光定量PCR陽(yáng)性檢出率較高。兩種檢測(cè)方法均為陽(yáng)性的樣品為198份，占樣品總數(shù)的30%。

圖4 1.1×108～1.1×103copies/μL標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of 1.1×108to 1.1×103copies/μL standard

圖5 MNV特異性實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增曲線Fig.5 The amplification curve of MNV specificity experiment

圖6 1.1×109～1.1×100copies/μL標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒擴(kuò)增曲線Fig.6 Amplification curves of the 1.1×109to 1.1×100copies/μL standard

3 討論

MNV是小鼠中傳播最廣泛的感染因子之一，國(guó)外多項(xiàng)研究表明MNV在動(dòng)物設(shè)施中都有很高的感染率［8，9］。有研究表明［9］日本和美國(guó)小鼠群體中MNV抗體陽(yáng)性率分別高達(dá)67.3%和62.5%。西歐對(duì)多個(gè)設(shè)施中的大、小鼠微生物狀況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示在小鼠群體中，MNV感染率最高，陽(yáng)性率為31.8%［8］。我國(guó)廣東［13，14］、北京［15］、上海［16］均有MNV感染相關(guān)報(bào)道，袁文首次報(bào)道我國(guó)廣東省實(shí)驗(yàn)小鼠中有MNV陽(yáng)性檢出，采用RT-PCR方法檢測(cè)得小鼠 MNV陽(yáng)性率為37.38%(77/206)［14］，熒光定量 PCR方法測(cè)得 MNV陽(yáng)性率為 29.94%(103/ 344)［13］。隨后，醫(yī)科院動(dòng)物所對(duì)北京地區(qū)600多只小鼠進(jìn)行 ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示 MNV感染率為11.67%，其中，陽(yáng)性小鼠主要來(lái)自實(shí)驗(yàn)設(shè)施(30.94%)［15］。向丹丹等［16］對(duì)上海地區(qū)80份自然感染的小鼠糞便樣本進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示MNV陽(yáng)性率為13.75%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法與ELISA相比，可定量檢測(cè)小鼠MNV在體感染狀況，且與RT-PCR相比，其靈敏度更高。

目前國(guó)外已有關(guān)于MNV熒光定量PCR方法的文獻(xiàn)報(bào)道［17，18］，國(guó)內(nèi)有根據(jù) MNV-1序列設(shè)計(jì)引物構(gòu)建Taqman探針?lè)ǖ南嚓P(guān)報(bào)道［13］。前兩種方法均比對(duì)了44個(gè)MNV分離株核酸序列，國(guó)內(nèi)報(bào)道的方法主要以MNV-1序列為參考設(shè)計(jì)引物，現(xiàn)NCBI上公布的MNV分離株全基因組序列已有60株，MNV作為高突變率和增殖周期短的RNA病毒，其原有的保守序列有個(gè)別堿基發(fā)生變異，各分離株間核酸序列差異更加顯著，因此，有必要建立更為廣譜、高效的方法檢測(cè) MNV在小鼠中的感染情況。此外，Kitajima等［17］建立的 Taqman探針?lè)z測(cè)限為1.0 ×102copies/μL，本次建立的檢測(cè)方法與其相比靈敏度更高。

本實(shí)驗(yàn)所建立的MNV熒光定量PCR檢測(cè)方法特異性好，不與同種屬其他病毒產(chǎn)生非特異性反應(yīng)，線性范圍廣，可快速精準(zhǔn)定量。批間及批內(nèi)實(shí)驗(yàn)CT值變異系數(shù)均小于2%，表明其重復(fù)性和穩(wěn)定性好，可以用于MNV核酸的定量檢測(cè)。用該方法對(duì)北京市9個(gè)送檢單位的766只小鼠盲腸內(nèi)容物樣品檢測(cè)，其陽(yáng)性率為39.3%，6個(gè)送檢單位有陽(yáng)性檢出。對(duì)送檢樣品分析，發(fā)現(xiàn) MNV感染呈集中趨勢(shì)，不同批次的陽(yáng)性樣品多來(lái)自同一送檢單位，且MNV感染以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施為主，其原因可能與MNV傳播途徑及持續(xù)性感染有關(guān)。小鼠感染MNV后主要經(jīng)糞口途徑傳播，如污染的食物、水或墊料等，也有文獻(xiàn)報(bào)道MNV可經(jīng)空氣傳播［19］，相同飼養(yǎng)間的小鼠均可能感染，污染設(shè)施很難通過(guò)檢測(cè)和淘汰清除MNV［20］。人工染毒實(shí)驗(yàn)表明 MNV的主要靶器官是腸道組織及脾臟，排毒時(shí)間為30 d左右。對(duì)同一只小鼠的盲腸內(nèi)容物和血清分別進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)和 ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示熒光定量PCR陽(yáng)性檢出率為44%(291/666)，高于ELISA陽(yáng)性檢出率(224/666)。

本實(shí)驗(yàn)建立了特異、高效的 MNV熒光定量PCR檢測(cè)方法，為保障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物質(zhì)量和加強(qiáng)進(jìn)出口動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫提供技術(shù)支撐，也為MNV分子機(jī)制、感染特征等研究提供了依據(jù)。

圖7 1.1×109～1.1×101copies/μL標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve of the 1.1×109to 1.1×101copies/μL standard

圖8 盲腸擴(kuò)增曲線(10 d)Fig.8 The amplification curve of cecum

圖9 盲腸內(nèi)容物擴(kuò)增曲線(10 d)Fig.9 The standard curve of caecum content

［1］Karst SM，Wobus CE，Lay M，et al.STAT1-dependent innate immunity to a Norwalk-like virus［J］.Science，2003，299(5612):1575-1578.

［2］Fischer AE，Wu SK，Proescher JB，et al.A high-throughput drop microfluidic system for virus culture and analysis［J］.J Virol Methods，2015，213:111-117.

［3］Wobus CE，Karst SM，Thackray LB，et al.Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages［J］.PLoS Biol，2004，2(12):e432.

［4］Compton SR，Paturzo FX，Macy JD.Effect of murine norovirus infection on mouse parvovirus infection［J］.J Am Assoc Lab Anim Sci，2010，49(1):11-21.

［5］Chen X，Leach D，Hunter DA，et al.Characterization of intestinal dendritic cells in murine norovirus infection［J］.Open Immunol J，2011，4:22-30.

［6］Papafragkou E，Hewitt J Park GW，et al.Challenges of culturing human norovirus in three-dimensional organoid intestinal cell culture models［J］.PLoS One，2013，8(6):e63485.

［7］Herod MR，Salim O，Skilton RJ，et al.Expression of the murine norovirus(MNV) ORF1 polyprotein is sufficient to induce apoptosis in a virus-free cell model［J］.PLoS One，2014，9 (3):e90679.

［8］M?hler M， K?hl W. A serological survey to evaluate contemporary prevalence of viral agents and Mycoplasma pulmonis in laboratory mice and rats in Western Europe［J］. Lab Anim(NY)，2009，38(5):161-165.

［9］Ohsugi T，Matsuura K，Kawabe S，et al.Natural infection of murine norovirusin conventionaland specificpathogen-free laboratory mice［J］.Front Microbiol.2013，4:12.

［10］王吉，衛(wèi)禮，付瑞，等.貓皰疹病毒 I型實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法的建立及初步應(yīng)用［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2014，24 (12):47-54.

［11］李曉波，付瑞，岳秉飛，等.鼠諾如病毒的體外分離與鑒定［J］.中國(guó)病毒學(xué)雜志，2011，1(5):293-296.

［12］Goto K，Hayashimoto N，Yasuda M，et al.Molecular detection ofmurine norovirus from experimentally and spontaneously infected mice［J］.Exp Anim，2009，58(2):135-140.

［13］袁文，王靜，趙維波，等.結(jié)合內(nèi)標(biāo)的小鼠諾如病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2015，23(1):49-56.

［14］袁文，張鈺，劉忠華，等.廣東省實(shí)驗(yàn)小鼠自然感染鼠諾如病毒的調(diào)查［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2010，20(2):78-82.

［15］Xiang Z，Tian S，Tong W，et al.MNV primarily surveillance by a recombination VP1-derived ELISA in Beijing area in China［J］.J Immunol Methods，2014，doi.org/10.1016/j.jim. 2014.05.007.

［16］向丹丹.RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠自然和實(shí)驗(yàn)感染鼠諾瓦克病毒及病毒株分離［D］.東華大學(xué)，2013.

［17］Kitajima M，OkaT，TakagiH，etal.Developmentand application of a broadly reactive real-time reverse transcription-PCR assay for detection of murine norovirus［J］. J Virol Methods，2010，169(2):269-273.

［18］Hanaki K，Ike F，Kajita A，et al.A broadly reactive one-step SYBR green I real-time RT-PCR assay for rapid detection of murine norovirus［J］.PLoS One，2014，9(5):e98108

［19］Wobus CE，Thackray LB，Virgin HW 4th.Murine norovirus:a model system to study norovirus biology and pathogenesis［J］.J Virol，2006，80(11):5104-5112.

［20］Hsu CC，Riley LK，Wills HM，et al.Persistent infection with and serologic cross-reactivity of three novel murine novoviruses［J］.Comp Med，2006，56(4):247-251.

Establishment and preliminary application of a real-time fluorescent quantitative PCR assay for detection of murine norovirus

GAO Jie，HE Zheng-ming
(Laboratory Animal Institute，National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 10050，China)

ObjectiveTo establish a real-time fluorescent quantitative PCR(FQ-PCR)method for detection of murine norovirus(MNV)in laboratory mouse and provide the basis for establishment of a standard detection method for MNV.MethodsSpecific primers were designed and MNV DNA standards were prepared according to the MNV genome sequences published on NCBI.The specificity，sensitivity，repeatability and stability of the established Q-PCR method were tested.The established Q-PCR method was applied to detect 766 mouse caecum content samples to explore preliminarily the infection status of laboratory mice in Beijing.ResultsNo cross reaction showed in human norovirus and feline calicivirus with the established Q-PCR method.The sensitivity was up to 10 copies/μL.The coefficient of variation (CV)of intra-assay and inter-assay was less than 2%.There were 301 positive cases detected in the 766 samples of laboratory mice.ConclusionsThe established FQ-PCR method is accurate and effective with high specificity，sensitivity and repeatabiliy in the quantitative detetion of nucleic acid，and can be applied to rapidly and quantitatively screen MNV in laboratory mice.

R-33

A

1671-7856(2016)12-0070-07

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.12.014

2016-06-16

國(guó)家科技支撐課題(2013BAK11B01)。

高潔(1990-)，女，碩士，研究方向:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒學(xué)，E-mail:gaojieru@163.com。

賀爭(zhēng)鳴(1957-)，男，研究員，博士，研究方向:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)，E-mail:hezm@nifdc.org.cn。