高 慧， 李 昂， 陳雙越， 齊海軍， 楊 陽， 金東淳*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002;2.吉林省中玉農(nóng)業(yè)有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130000)

番茄花粉發(fā)育時(shí)期與花蕾大小關(guān)系的研究

高 慧1， 李 昂1， 陳雙越1， 齊海軍1， 楊 陽2， 金東淳1*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002;2.吉林省中玉農(nóng)業(yè)有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130000)

以“賊不偷”番茄品種為材料，采用DAPI染色方法研究了番茄花粉發(fā)育時(shí)期與花蕾長(zhǎng)度的關(guān)系。結(jié)果表明：同一朵花的不同花藥中花粉粒的發(fā)育時(shí)期基本一致,并且番茄花的長(zhǎng)度與花粉粒的發(fā)育時(shí)期也有著較嚴(yán)格的對(duì)應(yīng)關(guān)系。當(dāng)花蕾長(zhǎng)度小于0.4 cm時(shí)，花粉基本處于小孢子母細(xì)胞時(shí)期；長(zhǎng)度為0.4～0.6 cm時(shí)，為花粉發(fā)育的二分體時(shí)期；長(zhǎng)度為0.6～0.7 cm時(shí),為四分體時(shí)期；長(zhǎng)度為0.7～0.8 cm時(shí)，為單核居中期；長(zhǎng)度為0.8～0.9 cm時(shí)，為單核靠邊期；長(zhǎng)度為0.9～1.1 cm時(shí)，為二核花粉期；長(zhǎng)度大于1.1 cm時(shí)，基本為成熟的小孢子。

番茄；花蕾長(zhǎng)度；花粉粒；發(fā)育時(shí)期

植物花藥培養(yǎng)中，花粉的發(fā)育時(shí)期是影響花藥(花粉)培養(yǎng)效果的重要因子之一[1-11]。很多花藥培養(yǎng)研究結(jié)果表明，不同發(fā)育時(shí)期的花粉粒對(duì)花粉培養(yǎng)的效果有很大差異，選擇適宜發(fā)育時(shí)期的花粉粒是決定花粉培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵，一般認(rèn)為單核中期或單核靠邊期是花粉培養(yǎng)的最佳時(shí)期。而花粉培養(yǎng)需從許多花或花藥當(dāng)中取花粉粒，對(duì)每一朵花或花藥進(jìn)行鏡檢并確定其花粉發(fā)育時(shí)期既費(fèi)時(shí)費(fèi)力，又會(huì)對(duì)小孢子活力造成一定的損傷。所以針對(duì)某一植物進(jìn)行花粉培養(yǎng)時(shí)接到一些能夠準(zhǔn)確判斷其花粉發(fā)育時(shí)期形態(tài)等標(biāo)記是非常有必要的。植物中有許多關(guān)于花(或花蕾)長(zhǎng)度與花粉發(fā)育時(shí)期關(guān)系的相關(guān)研究，表明花(或花蕾)的長(zhǎng)度與花粉發(fā)育階段存在密切關(guān)系[12-13]。關(guān)于番茄曾有過花粉發(fā)育時(shí)期與花藥培養(yǎng)效應(yīng)的研究[14]，但尚無花粉發(fā)育時(shí)期與花粉培養(yǎng)的相關(guān)研究。本試驗(yàn)篩選出對(duì)花粉培養(yǎng)響應(yīng)較好的、適合番茄花粉培養(yǎng)的“賊不偷”番茄品種為試驗(yàn)材料，著重研究小孢子各發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞學(xué)特征以及不同發(fā)育時(shí)期與花蕾大小的相關(guān)性，以便直接從花(或花蕾)的長(zhǎng)度來推斷小孢子的發(fā)育時(shí)期，為番茄花藥或小孢子培養(yǎng)提供簡(jiǎn)單易行的小孢子發(fā)育時(shí)期鑒定方法。對(duì)進(jìn)一步優(yōu)化花粉培養(yǎng)條件及提高胚狀體的誘導(dǎo)效率、以及建立番茄花粉培養(yǎng)體系等諸方面也具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

從市場(chǎng)購買“賊不偷”番茄品種的種子，育苗后移栽至溫室大棚栽培，在盛花期采集新鮮的、不同長(zhǎng)度的花蕾為材料。

1.2 方法

采摘生長(zhǎng)健壯的第1花序中的花,從花蕾基部到頂部測(cè)量長(zhǎng)度,并根據(jù)花的大小分為7種不同長(zhǎng)度:A(0～4 mm)，B(4～6 mm),C(6～7 mm),D(7～8 mm),E(8～9 mm),F(9～11 mm ),G(11 mm以上)(圖1)。取不同長(zhǎng)度的花蕾(各5個(gè))，分離花藥(一朵花蕾中通常有5～6個(gè)花藥)，于卡諾固定液(乙醇∶冰乙酸=3∶1)中固定24 h。取出后,用檸檬酸/磷酸緩沖液(pH值為4)中和固定2 h。用鑷子取出花藥并用解剖刀切開,輕輕壓片。先在載玻片上滴1滴2 mg/L(2 mgDAPI溶于1 L蒸餾水)的DAPI染色液,置花藥于此液體中進(jìn)行簡(jiǎn)易壓片,置于黑暗中10 min。用Olympus落射式熒光顯微鏡，分別在10×10、10×20、10×40(目鏡×物鏡)倍鏡下，每片觀察3個(gè)視野確定花藥小孢子的發(fā)育時(shí)期并照相。其中，熒光激發(fā)光λ=358 nm[15]。

注：A(0～4 mm)、B(4～6 mm)、C(6～7 mm)、D(7～8 mm)、E(8～9 mm)、F(9～11 mm)、G(11 mm 以上)

圖1 “賊不偷”番茄品種不同發(fā)育時(shí)期花蕾的外觀形態(tài)

Fig.1 The exterior forms in different development periods of buds in “zeibutou” tomato

2 結(jié)果與分析

通過對(duì)不同大小番茄花蕾花粉發(fā)育的顯微觀察，發(fā)現(xiàn)番茄花蕾的大小與小孢子發(fā)育時(shí)期有一定的關(guān)系。根據(jù)不同時(shí)期花粉的形態(tài)特征，番茄花粉粒的發(fā)育可分為小孢子母細(xì)胞時(shí)期、二分體時(shí)期、四分體時(shí)期、單核居中期和單核靠邊期、二核花粉期、成熟小孢子等7個(gè)階段。

該試驗(yàn)主要采用DAPI熒光染色劑對(duì)番茄不同發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞進(jìn)行觀察，而沒有選用植物花粉研究中最常用的醋酸洋紅染色劑，主要是因其特異性差，在清晰觀察花粉細(xì)胞核的動(dòng)態(tài)變化中存在局限性。DAPI是能夠與核物質(zhì)(DNA)特異性結(jié)合的熒光染料，是觀察、研究細(xì)胞核動(dòng)態(tài)變化的理想染色劑，已廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞分子生物學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域, 其中較多地應(yīng)用于動(dòng)物癌細(xì)胞、胚胎細(xì)胞以及植物染色體帶型、異染色質(zhì)等研究[16-17]。但它在檢測(cè)花粉粒發(fā)育時(shí)期的應(yīng)用報(bào)道較少, 有關(guān)檢測(cè)番茄花粉粒發(fā)育的文獻(xiàn)就更少，這主要是由于厚而堅(jiān)硬的花粉壁阻礙染色劑的滲透。該試驗(yàn)通過有效的固定以及中和固定等前處理, 在保證維持花粉粒正常形態(tài)的同時(shí),有效地軟化花粉壁,使 DAPI 能夠滲透進(jìn)入到花粉粒中, 并準(zhǔn)確、清晰地觀察到了花粉母細(xì)胞、四分體、單核花粉粒和二核花粉粒等不同發(fā)育時(shí)期細(xì)胞核的動(dòng)態(tài)變化。這一染色方法也為番茄游離小孢子培養(yǎng)以及胚狀體發(fā)育過程的動(dòng)態(tài)變化研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

2.1 番茄花粉發(fā)育特性

番茄小孢子的形成和花粉粒的發(fā)育與黃瓜[18]、辣椒[19]花粉粒的發(fā)育相似。在小孢子母細(xì)胞時(shí)期，細(xì)胞核大，無明顯的液泡，表現(xiàn)為細(xì)胞著色較深，在小孢子母細(xì)胞的四周沉積1層胼胝質(zhì)物質(zhì)。小孢子母細(xì)胞第1次減數(shù)分裂后產(chǎn)生分隔壁，將母細(xì)胞分為2個(gè)子細(xì)胞，即二分體，2個(gè)核同步進(jìn)行第2次分裂，分裂后在4個(gè)核之間產(chǎn)生細(xì)胞壁形成四面體型的四分體和兩側(cè)對(duì)稱型四分體。制片觀察到四分體四周的胼胝質(zhì)壁并非完全規(guī)則地包裹著四分體。包裹在四分體四周的胼胝質(zhì)被分解后，小孢子從中游離出來彼此分開，小孢子釋放出來,此時(shí)在花粉壁上可觀察到3個(gè)呈凸透鏡形狀的萌發(fā)孔。剛游離出來的小孢子細(xì)胞質(zhì)濃厚，細(xì)胞核位居中央，此期為單核中期，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)液泡不明顯，細(xì)胞壁呈收縮狀態(tài)為小孢子收縮期。隨著小孢子從四周汲取養(yǎng)料，細(xì)胞體積逐漸增大，液泡逐漸發(fā)育為大液泡，并將細(xì)胞核擠到邊上，此期為單核靠邊期。而后細(xì)胞質(zhì)逐漸充滿整個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞核進(jìn)行1次不均等有絲分裂，形成雙核，靠花粉壁的為生殖細(xì)胞，占據(jù)細(xì)胞中央的為營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。番茄成熟的花粉粒為二細(xì)胞花粉粒，在花粉壁上可觀察到明顯的3個(gè)呈凹透鏡形狀的萌發(fā)孔,這與朱麗萍[20]的結(jié)果基本相似。

2.2 番茄花粉發(fā)育時(shí)期與花蕾大小的關(guān)系

按花蕾大小觀察每個(gè)等級(jí)番茄花蕾的花粉粒發(fā)育特性，結(jié)果表明：花蕾小于0.4 cm時(shí)，花粉粒處在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期(圖2-A)，此期可觀察到番茄(2n=2x=24)有12對(duì)染色體(圖2-B)?；ɡ俅笮?.4～0.6 cm 時(shí)，花粉母細(xì)胞均等的分裂成2個(gè)子細(xì)胞，此期為花粉粒二分體時(shí)期(圖2-C,D)?；ɡ俅笮?.6～0.7 cm時(shí)，花粉粒處在四分體時(shí)期(圖2-E,F)。這一時(shí)期的花蕾中可以觀察到被胼胝質(zhì)包圍的單核的四分體。花蕾大小為0.7～0.9 cm時(shí)，花粉粒處在單核花粉期。熒光顯微鏡下可觀察到從四分體四周胼胝質(zhì)分解后游離出來的核位居中央的小孢子，此期為花粉粒單核居中期(圖2-G,H)。隨著花粉粒的不斷發(fā)育膨大，可觀察到小孢子中的大液泡把細(xì)胞核擠到一邊，此期為花粉粒單核靠邊期(圖2-I)?；ɡ俅笮?.9～1.1 cm時(shí)，熒光顯微鏡下可觀察到2個(gè)大小不一、亮度不同的細(xì)胞核。由于有絲不均等分裂，形成的細(xì)胞核一個(gè)大一個(gè)小。體積大的為營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞核(V)，核大，顏色較淺；體積小的為生殖細(xì)胞核(G)，核小，顏色較亮；此時(shí)期為花粉粒二核花粉期(圖2-J)?；ɡ俅笮?.1 cm以上時(shí)，番茄花粉粒趨于成熟，屬發(fā)育后期。此時(shí)期用油鏡(10×100)能明顯觀察到3個(gè)呈凹透鏡形狀的萌發(fā)孔(圖2-K,L)。

3 討論與結(jié)論

很多相關(guān)植物游離小孢子的研究結(jié)果一致認(rèn)為，很多因素影響單倍體的誘導(dǎo)效果，如基因型、花粉發(fā)育時(shí)期、脅迫處理、激素、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件等。其中，選擇適當(dāng)?shù)幕ǚ郯l(fā)育時(shí)期是能否成功誘導(dǎo)單倍體的前提與關(guān)鍵，普遍認(rèn)為單核靠邊期是花粉培養(yǎng)的最佳時(shí)期。而對(duì)每一朵花粉粒都鑒定其發(fā)育時(shí)期，不僅耗時(shí)耗力，又損傷花粉粒。為此本文探討了“賊不偷”番茄品種花蕾大小與花粉發(fā)育時(shí)期間的關(guān)系。以期能夠直接從花(或花蕾)的長(zhǎng)度來推斷小孢子的發(fā)育時(shí)期，為番茄花藥或小孢子培養(yǎng)提供簡(jiǎn)單易行的小孢子發(fā)育時(shí)期鑒定方法，從而提高花粉或花藥培養(yǎng)的誘導(dǎo)率。

“賊不偷”番茄品種是我實(shí)驗(yàn)室篩選出的、對(duì)花粉培養(yǎng)響應(yīng)較好的、適合番茄花粉培養(yǎng)相關(guān)研究的好材料，在預(yù)備試驗(yàn)中曾誘導(dǎo)出較高頻率的胚狀體(相關(guān)結(jié)果將在后續(xù)論文中發(fā)表)。結(jié)果表明，“賊不偷”番茄品種的花蕾長(zhǎng)度小于0.4 cm時(shí)，花粉基本處于小孢子母細(xì)胞時(shí)期；長(zhǎng)度為0.4～0.6 cm時(shí)，為二分體時(shí)期；長(zhǎng)度為0.6～0.7 cm時(shí),為四分體時(shí)期；長(zhǎng)度為0.7～0.8 cm時(shí)，為單核居中期；長(zhǎng)度為0.8～0.9 cm時(shí)，為單核靠邊期；長(zhǎng)度為0.9～1.1 cm時(shí)，為二核花粉期；當(dāng)長(zhǎng)度大于1.1 cm時(shí)，基本為成熟的小孢子?；ɡ俅笮∨c花粉發(fā)育時(shí)期間存在高度相關(guān)性。這一結(jié)果為本實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)行的番茄花粉離體培養(yǎng)研究提供了重要的參考。

目前，在擬南芥、水稻、油菜等模式植物中已建立了成熟的花粉培養(yǎng)體系。而番茄的單倍體誘導(dǎo)研究多集中在花藥培養(yǎng)，吳志蘋[21]曾通過番茄小孢子離體培養(yǎng)獲得胚狀體，但至今尚無相關(guān)通過游離小孢子培養(yǎng)獲得番茄單倍體植株的報(bào)道，這有待我們進(jìn)一步的研究。植物單倍體的誘導(dǎo)主要采用花藥和花粉培養(yǎng)方法，而通過游離小孢子培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體的方法有著可排除單倍體誘導(dǎo)過程中其他體細(xì)胞的干擾、可獲得大量的單倍體等很多優(yōu)勢(shì)。通過植物花粉培養(yǎng)可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的純合的雙單倍體(HD)來加快育種進(jìn)程，同時(shí)也在構(gòu)建遺傳圖譜群體以及植物細(xì)胞全能性研究等很多理論性研究中有著廣泛的應(yīng)用前景。

A,B為小孢子母細(xì)胞時(shí)期；C,D為花粉粒二分體時(shí)期；E,F為花粉粒四分體時(shí)期；G,H為花粉粒單核居中期；I為花粉粒單核靠邊期；J為花粉粒二核期；K,L為成熟的小孢子。A～J倍率為10×40(Bar=15 μm);K,L倍率為10×100(Bar=18 μm)。

圖2 番茄“賊不偷”不同發(fā)育時(shí)期細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果

Fig.2 The results of cytology observation in different development periods of “zeibutou” of tomato

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Studies on the relationship between bud size and pollen development stage in tomato

GAO Hui1, LI Ang1, CHEN Shuangyue1, QI Haijun1, YANG Yang2, JIN Dongchun1*

(1.AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China;2.ZhongyuagricultureCo.,Ltd.ofJilin,ChangchunJilin130000,China)

In present study, the buds with different sizes of tomato variety of “zeibutou” as material, the relationship between bud length and pollen development stage were investigated using DAPI staining method. The results showed that the pollens in different anthers of the same flower were at the identical pollen development stage and, the bud length was strictly corresponding to the pollen development stage. When the bud was shorter than 0.4 cm, most of the pollens were at the microsporocyte stage; the buds were from 0.4 to 0.6 cm, the pollens were at the dispore stage; the buds were 0.6 to 0.7 cm, the pollens were at the trispore stage. When the buds were 0.7 to 0.8 cm, the pollens were at the early uninuclear stage; the buds were 0.8 to 0.9 cm, the pollens were at the late uninuclear stage; the buds were 0.9 to 1.1 cm, the pollens were at the binuclear stage. When the bud was greater than 1.1 cm, the pollens were at the mature microspore stage.

tomato; bud length; pollen; development stage

2016-10-21 基金項(xiàng)目：國(guó)際合作研究項(xiàng)目(延邊大學(xué)—韓國(guó)農(nóng)村振興廳國(guó)立園藝特作研究院)

高慧(1992—),女，山西大同人，在讀碩士，研究方向?yàn)橹参锘ǚ郯l(fā)育機(jī)理研究。金東淳為通信作者，

E-mail:jdc1200@ybu.edu.cn

1004-7999(2016)04-0346-05

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.04.012

S641.2

A