裴端卿

皮膚細(xì)胞如何成為神經(jīng)細(xì)胞？

裴端卿

如何把皮膚細(xì)胞變成神經(jīng)細(xì)胞？這是2005年《Science》 125周年慶時(shí)提出的125個(gè)科學(xué)前沿問題中的一個(gè)重大問題。在對這個(gè)問題的描述中，作者把細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化比作中世紀(jì)煉金術(shù)士的點(diǎn)金術(shù)，并且在文章結(jié)束時(shí)說：“搞清楚大約25000個(gè)人類基因是如何共同工作形成組織，以及如何正確地引導(dǎo)未成熟細(xì)胞的培養(yǎng)，將會(huì)花費(fèi)研究者們數(shù)十年的時(shí)間，但一旦成功，這個(gè)成果將比黃金珍貴得多”。

神經(jīng)系統(tǒng)包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)和植物神經(jīng)系統(tǒng)，許多因素如感染、中毒、免疫損傷、營養(yǎng)障礙、內(nèi)分泌紊亂以及遺傳因素等都可使神經(jīng)系統(tǒng)受損，神經(jīng)細(xì)胞的變性、凋亡或者壞死，會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙或者缺失。由于神經(jīng)細(xì)胞的不可再生性，神經(jīng)損傷的修復(fù)是一個(gè)世界性難題，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)，曾經(jīng)很長一段時(shí)期被認(rèn)為是無法修復(fù)的。神經(jīng)元廣泛丟失或者脫髓鞘以后，神經(jīng)系統(tǒng)很難自我修復(fù)，臨床上一直缺乏有效的治療手段。利用干細(xì)胞（胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞）研究神經(jīng)的修復(fù)一直是干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。其中包括胚胎干細(xì)胞或成體干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)、誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)以及成體細(xì)胞的細(xì)胞譜系轉(zhuǎn)換獲得神經(jīng)細(xì)胞等多種方法。其中，成體細(xì)胞的細(xì)胞譜系轉(zhuǎn)換即將皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)換成神經(jīng)細(xì)胞相對來說，誘導(dǎo)效率更高，分化更完全，有效地降低了成瘤性，是一種更高效和更安全的誘導(dǎo)方法。

1 神經(jīng)元的誘導(dǎo)

2010年，斯坦福大學(xué)的Wernig研究組，用類似Yamanaka的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的技術(shù)，用Ascl1，Brn2/4和Myt1L（ABM）3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子成功地把小鼠（Mus musculus）的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為了誘導(dǎo)神經(jīng)元（induced neurons，iNs）。這是在這個(gè)領(lǐng)域的一次開創(chuàng)性成果，以后的許多研究都是追隨著這個(gè)研究。Wernig研究組用的是直接轉(zhuǎn)分化的方法，這種方法繞過了多潛能細(xì)胞或前體細(xì)胞，將一種類型的成體細(xì)胞直接跨譜系轉(zhuǎn)化成了另一種成體細(xì)胞。這種方法縮短了誘導(dǎo)時(shí)間，操作比較簡單，致瘤性和免疫原性也比較小。用這種方法可以成功地誘導(dǎo)多種神經(jīng)元細(xì)胞。

帕金森病是嚴(yán)重危害老年人的一種退行性神經(jīng)疾病，多巴胺能神經(jīng)元是帕金森病的關(guān)鍵細(xì)胞，在帕金森病人的中腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元變性壞死，使得紋狀多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞顯著減少，如果能修復(fù)或者再生可以持續(xù)分泌多巴胺的神經(jīng)元就能治療這個(gè)疾病。2011年，Ding研究組用miR-124和兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子MYT1L和BRN2成功地用胎兒成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)出了多巴胺能神經(jīng)元。2014年，Dell’Anno和她的同事們用Ascl1，Nurr1和Lmx1a誘導(dǎo)出了有功能的誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元，并把它們移植到了帕金森病模型大鼠（Rattus norvegicus）的體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)這些誘導(dǎo)出來的小鼠可以長期存活，并且確實(shí)改善了這些大鼠的運(yùn)動(dòng)功能。

運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受損會(huì)引起一些外周性神經(jīng)疾病，例如，折磨著著名理論物理學(xué)家霍金的肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）等，修復(fù)和再生運(yùn)動(dòng)性神經(jīng)元就是治療這一類疾病的關(guān)鍵，Son等人用ABM加上了一些特異性的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的因子把人和大鼠的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成了誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（induced motor neurons，iMNs），這些iMNs具有神經(jīng)電生理特性并能形成突觸，把它們移植到肌萎縮側(cè)索硬化癥的模型小雞（Gallus domesticus）的脊髓中后，發(fā)現(xiàn)有80%存活的iMNs從神經(jīng)根向周圍的肌肉組織伸出了突觸。

2 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)

除了神經(jīng)元細(xì)胞，成纖維細(xì)胞還可以轉(zhuǎn)分化成為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，如星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和施旺細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的細(xì)胞，在神經(jīng)回路的發(fā)育和維持中有重要作用，有一定的再生功能。星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞受損會(huì)引起類似ALS這樣的神經(jīng)退行性疾病，甚至有報(bào)道星形膠質(zhì)細(xì)胞與自閉癥和精神分裂癥有關(guān)。少突膠質(zhì)細(xì)胞形成了包繞神經(jīng)元軸突的“電線”外皮，功能異常會(huì)導(dǎo)致像多發(fā)性硬化癥這樣的脫髓鞘病變。施旺細(xì)胞的作用也是包繞髓鞘，對周圍神經(jīng)的再生意義重大。

2015年，Caiazzo等人在眾多轉(zhuǎn)錄因子中篩選出了NFIA，NFIB和SOX93個(gè)因子，可以把人和大鼠的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成有功能的誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞。Wernig研究組則篩選出Sox10，Olig2和Zfp5363個(gè)因子，制備出了高效率的誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞，當(dāng)把它們移植到髓鞘堿性蛋白基因敲除小鼠的胼胝體和小腦后，它們可以分化成為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞，并且還可以形成包裹了軸突的髓鞘。Thoma等人則僅用一種化合物—多激酶抑制劑化合物B，就將包皮成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成了施旺細(xì)胞，這些施旺細(xì)胞可以形成髓鞘，而且還具有電生理功能。這些研究為治療周圍神經(jīng)損傷帶來了新的希望。

3 其他誘導(dǎo)方法

3.1 小分子誘導(dǎo)

在所有的重編程轉(zhuǎn)分化的策略中，小分子誘導(dǎo)具有無基因組整合，操作簡單，劑量易控與可逆性等優(yōu)點(diǎn)，受到了廣泛的關(guān)注。小分子可以通過調(diào)控表觀遺傳修飾，信號(hào)通路與代謝激酶等多種途徑來影響細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變過程，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)重編程效率的提升并替代相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。第一次完全由小分子誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞是2015年Dai等人用6個(gè)確定的化合物完成的，他們的轉(zhuǎn)化效率能達(dá)到80%，而且不受細(xì)胞來源的年齡和培養(yǎng)代數(shù)的影響。3個(gè)月后，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院裴剛實(shí)驗(yàn)室也發(fā)表文章，表明他們用了7個(gè)化合物將正常人和阿爾茨海默病患者的皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)成了神經(jīng)元細(xì)胞。同時(shí)，同濟(jì)大學(xué)仁濟(jì)醫(yī)院的Xu等人在神經(jīng)營養(yǎng)因子3基因修飾的嗅鞘細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中加入SB431542，GDNF和RA 3種小分子化合物，經(jīng)過3周的培養(yǎng)，成功地將小鼠的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變成為了氨基丁酸能神經(jīng)元。這種神經(jīng)元的損傷或缺乏可以導(dǎo)致癲癇和自閉癥譜系神經(jīng)障礙。

3.2 microRNA誘導(dǎo)

microRNA作為內(nèi)源基因編碼的非編碼單鏈分子，不翻譯成蛋白質(zhì)，但參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，在細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)控中起著重要作用，可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。Yoo等人的研究表明，miR-9/9*-124在神經(jīng)元細(xì)胞命運(yùn)決定中起重要作用，過表達(dá)它們可以使人的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)換成為神經(jīng)元細(xì)胞，NEUROD2，ASCL1和MYT1L可以促進(jìn)這個(gè)過程。Zhou等人發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)多能性干細(xì)胞特異性miRNA簇miRNA-302/367和另外兩個(gè)神經(jīng)特異性miRNA，包括miRNA-9/9*和miRNA-124可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。Xue等人則發(fā)現(xiàn)，通過miR-124抑制單個(gè)RNA結(jié)合多聚嘧啶序列結(jié)合蛋白（polypyrimidine tract binding protein，PTB）可以誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為功能性神經(jīng)元。

4 間接轉(zhuǎn)分化

由于終末的或半終末的細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化存在一些缺陷，終末細(xì)胞擴(kuò)增能力有限，分化效率比較低，而且移植后的存活率以及功能性整合率都比較低，所以人們又傾向于采用間接轉(zhuǎn)分化的方法，就是將一種成熟細(xì)胞重編程成為一種具有可塑性的中間狀態(tài)，如干細(xì)胞或前體細(xì)胞，然后再誘導(dǎo)成所需要的功能細(xì)胞。

4.1 誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞

誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞（induced neural stem cells，iNSCs）具有很強(qiáng)的可塑性和分化再生的能力，并且可以抗炎抗凋亡，具有免疫調(diào)節(jié)的作用。Thier等人在小鼠成纖維細(xì)胞中通過先短暫表達(dá)Oct4，再持續(xù)高表達(dá)Sox2，Klf4和c-Myc，得到了可以在體外傳代超過50代的iNSCs，這些iNSCs與神經(jīng)干細(xì)胞NSCs有著類似的表型和基因型，并可以分化成為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。

4.2 誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞

中國科學(xué)院Pan課題組在人體的尿液上皮細(xì)胞中利用隨體過表達(dá)4個(gè)Yamanaka因子，Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc，并在誘導(dǎo)期間的不同時(shí)間段加入6個(gè)小分子化合物，結(jié)果得到了類似于神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)神經(jīng)祖細(xì)胞（induced neural progenitor cells，iNPCs），這些非轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)神經(jīng)祖細(xì)胞可以自我更新并在體外分化成多種神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，并可在新生小鼠的腦中移植成活和分化。

Lim等人在小鼠成纖維 細(xì)胞中過表達(dá)Bcl-xL和Myt1L可將其誘導(dǎo)成為誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞，這種iNPCs可以擴(kuò)增超過100倍，在過表達(dá)Nurr1和Foxa2后產(chǎn)生具有突觸前神經(jīng)元功能的成熟的中腦多巴胺能神經(jīng)元，并在帕金森氏病模型小鼠的治療上有一定的潛力。

4.3 神經(jīng)限制性前體細(xì)胞

鑒于誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞和誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞在移植后增殖能力有限、存活率低，而且主要分化方向是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，只有很少量的細(xì)胞可以分化為有功能的神經(jīng)元，Tian等人通過異位表達(dá)Brn2，Sox2和Foxa2將小鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成為神經(jīng)限制性前體細(xì)胞，這種細(xì)胞只向神經(jīng)元分化，并且有較強(qiáng)的再生和遷移能力，在帕金森病模型鼠大腦移植后可以緩解功能性運(yùn)動(dòng)障礙，并減少紋狀體DA神經(jīng)元軸突目的地的損失。而且最重要的是在移植后的小鼠大腦中檢測不到星形膠質(zhì)細(xì)胞和腫瘤。

5 結(jié)語

目前，皮膚細(xì)胞（成纖維細(xì)胞）已經(jīng)可以成功地被轉(zhuǎn)化成各種神經(jīng)細(xì)胞，而且這些細(xì)胞在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也可以產(chǎn)生一定的功能，但是要走向臨床還存在著不少的問題，如轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞的免疫原性，轉(zhuǎn)分化藥物（小分子化合物）的毒性，轉(zhuǎn)化效率以及移植的存活率，以及它們與機(jī)體原有的神經(jīng)細(xì)胞如何整合等，還有很多的研究工作需要進(jìn)行。其中導(dǎo)入特定基因的方法效率較高，但有較高的成瘤性危險(xiǎn)，引入合成mRNA誘導(dǎo)或用小分子誘導(dǎo)的方法可以避免病毒引起的基因組整合，可以提高轉(zhuǎn)化的安全性，是未來這一領(lǐng)域的發(fā)展趨勢。同時(shí)，對皮膚細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化的研究，也有助于了解細(xì)胞命運(yùn)決定以及生物發(fā)育的深層規(guī)律，為進(jìn)一步的研究工作打下基礎(chǔ)。?

【作者單位：中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院】

（摘自《科學(xué)通報(bào)》2017-09-14網(wǎng)絡(luò)版）

責(zé)任編輯：吳曉麗