付建平 王雪 張羽 徐彬 張慧晶 鄭群

(哈勵遜國際和平醫(yī)院 1心內(nèi)科，河北 衡水 053000；2制劑室；3科教科)

心肌細胞的凋亡與多種心血管疾病的病理進展相關，如冠狀動脈粥樣硬化心臟病、心力衰竭和糖尿病心肌病〔1，2〕。高同型半胱氨酸血癥(HHcy)，即血清中同型半胱氨酸(Hcy)濃度升高，是通過促進心肌損傷構(gòu)成心血管疾病的一個新的獨立危險因素，與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關〔3〕。Hcy每升高5 μmol/L，心肌梗死的危險度就增加3～4倍〔4〕。高Hcy患者與冠心病的發(fā)病也呈正相關性〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)，Hcy可能通過誘導細胞程序性死亡和氧化應激引起心肌細胞功能障礙〔6〕。氧化應激可進一步增加活性氧(ROS)的生成，加重心血管疾病的發(fā)展。心肌細胞因其工作特性，氧消耗相對較大，含有更多的線粒體，而氧化應激和ROS生成都在線粒體中完成，所以當心肌細胞的線粒體功能受到損傷后更易于發(fā)生氧化應激。白藜蘆醇(RSV)是一種天然多酚化合物，目前被認為是最強的去乙?；?SIRT)1激活劑之一，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和調(diào)節(jié)葡萄糖/脂質(zhì)代謝等生物學功能〔7〕。RSV可通過上調(diào)SIRT1促進線粒體生物合成功能減輕線粒體損傷〔8〕。然而RSV是否能通過保護心肌細胞線粒體功能逆轉(zhuǎn)Hcy對心肌細胞的損傷目前還沒有報道。本研究通過建立HHcy模型和選取新生大鼠心肌細胞作為研究對象，在體內(nèi)外探討RSV對HHcy心肌細胞的保護作用。

1 材料和方法

1.1實驗試劑 蘇木素-伊紅(HE)染料、戊巴比妥鈉、磷酸鹽緩沖液(PBS)、免疫放射沉淀法(RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒和線粒體蛋白提取試劑盒購自中國碧云天生物科研公司；RSV購自中國伊奧生物科技有限公司；TUNEL試劑盒購自美國羅氏公司；同型免疫球蛋白(Ig)G二抗和Triton X-100購自美國Invitrogen公司；5%牛血清白蛋白購自美國Sigma公司；凋亡相關因子(NOX)4、細胞色素C、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3和GAPDH抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購自美國Cell Signaling Technology公司；Mitotracker試劑盒和JC-1試劑盒購自美國Abcam公司。

1.2HHcy模型的建立和實驗分組 選取18只體重250～280 g健康成年Wistar大鼠隨機分為對照組、HHcy組和HHcy+RSV組各6只，均自由進食。HHcy組大鼠予以溶解在2.5%淀粉的2 g/(kg·d)的L-蛋氨酸溫水溶液灌胃，對照組予以同等劑量的2.5%淀粉灌胃處理。L-蛋氨酸灌胃后，每周測量血清總Hcy水平，超過16.0 mmol/L時可認為HHcy。連續(xù)灌胃8 w后測量血清Hcy濃度超過16.0 mmol/L，提示HHcy造模成功。而HHcy+RSV組在HHcy組基礎上每天腹腔注射濃度為80 mmol/L的RSV。

1.3超聲心動圖對心功能的分析 采用超聲心動圖系統(tǒng)(VIVID710S，GE公司，美國)評估大鼠心臟功能。通過腹腔注射0.3 ml/100 g的10%水合氯醛麻醉下對自主呼吸的大鼠進行超聲心動圖檢查。測量收縮末期容積(ESV)、收縮分數(shù)(FS)、射血分數(shù)(EF)、早期跨室舒張峰值流速(E)和早期舒張峰值組織速度(E′)。計算E與E′的比值來分析心臟舒張功能。所有參數(shù)代表6個連續(xù)心動周期的平均值。

1.4組織形態(tài)學分析 處死大鼠，把左心室的心臟組織固定于4%多聚甲醛并包埋在石蠟中進行組織學研究。石蠟包埋組織被切成約5 μm厚的切片，分別予以HE和Masson染色，在熒光顯微鏡(IX71，Olympus公司，日本)下觀察心臟形態(tài)學變化。

1.5TUNEL法檢測細胞凋亡 按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書步驟對心肌組織進行染色并在熒光顯微鏡下觀察，凋亡細胞的百分比計算為TUNEL染色陽性細胞與細胞總數(shù)的比率。

1.6Western印跡檢測蛋白表達水平 把取自各組的心肌細胞接種于細胞培養(yǎng)皿中，利用線粒體蛋白試劑盒萃取線粒體蛋白和細胞質(zhì)蛋白。然后采用BCA法將各組蛋白樣品定量至相同濃度后，取20 μg樣品蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉。封閉后以1∶1 000的稀釋比例孵育一抗[NOX4，細胞色素(Cyt)C，Caspase-3和GAPDH抗體]，4℃過夜。次日用TBST洗滌后室溫孵育相應的HRP標記的二抗1 h，再次洗滌，最后采用電化學發(fā)光成像儀顯影。

1.7透射電鏡觀察線粒體形態(tài) 樣品細胞通過乙酸鈾酰和檸檬酸鉛染色后制成切片，并用透射電子顯微鏡(Hitachi H-7650，日立公司，日本)對細胞線粒體形態(tài)進行觀察。顯微照片以2×104放大倍數(shù)拍攝。

1.8熒光共聚焦顯微鏡 把各組的樣品細胞接種在細胞培養(yǎng)皿中并用PBS洗滌3次。根據(jù)TUNEL、Mitotracker和JC-1試劑盒中各自說明書對樣品細胞進行染色孵育和4%多聚甲醛固定。最后在熒光共聚焦顯微鏡(FV3000，Olympus公司，日本)下對細胞熒光位置和熒光強度進行觀察分析。

1.9統(tǒng)計學方法 采用Graphpad Prism軟件進行正態(tài)分布和方差齊性檢驗、t檢驗和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1RSV對HHcy大鼠心功能的影響 HHcy組ESV和E/E′較對照組明顯升高(P<0.01)，而FS和EF較對照組顯著降低(P<0.05)。HHcy+RSV組ESV和E/E′較HHcy組顯著降低，而FS和EF則較HHcy組顯著升高(均P<0.05)。見表1。

表1 各組心功能指標、NOX4、CytC、Caspase-3蛋白表達及線粒體檢測相對強度及線粒體膜電位比值比較

2.2RSV減少HHcy對心臟組織的損傷作用 如圖1顯示，HHcy組心臟組織中的心肌細胞數(shù)量較對照組明顯減少，并伴有心肌纖維化。HHcy組心肌細胞凋亡〔(14.0±2.5)%〕較對照組〔(1.8±0.6)%〕顯著增加(P<0.001)。HHcy+RSV組心肌細胞數(shù)量較HHcy組明顯增加，心肌纖維化程度較HHcy組降低，伴心肌細胞凋亡數(shù)量的顯著減少〔(5.0±2.1)%，P<0.01〕。見圖1。

圖1 HHcy對心臟損傷程度的影響(×200)

2.3RSV通過減輕HHcy導致線粒體損害發(fā)揮抗凋亡作用 HHcy組的心肌細胞的線粒體NOX4蛋白含量明顯高于對照組(P<0.05)，伴隨下游的CytC和Caspase-3的蛋白含量顯著升高(P<0.05)，提示HHcy可能通過升高線粒體NOX4蛋白，使更多的CytC蛋白滲漏到細胞質(zhì)中，最終使細胞質(zhì)Caspase-3表達明顯升高，發(fā)揮促凋亡作用。而HHcy+RSV組NOX4-CytC-Caspase-3通路活性較HHcy組顯著降低。見圖2、表1。HHcy組細胞的線粒體體積明顯增大，線粒體結(jié)構(gòu)損害嚴重，而HHcy+RSV組細胞線粒體體積顯著減少，線粒體結(jié)構(gòu)相對正常。見圖3。

圖2 Western印跡檢測各組NOX4、CytC、Caspase-3蛋白表達

圖3 透射電子顯微鏡中線粒體圖像(×20 000)

2.4RSV抑制HHcy的促凋亡作用 如圖4所示，與對照組〔(8.2±5.4)%〕比較，HHcy組心肌細胞凋亡數(shù)量〔(59.1±4.8)%〕顯著增多(P<0.001)，HHcy+RSV組心肌細胞的促凋亡作用明顯減弱，心肌細胞凋亡數(shù)量〔(25.4±5.3)%〕較HHcy組顯著減少(P<0.01)。

圖4 RSV抑制高同型半胱氨酸對心肌細胞的促凋亡作用(×400)

2.5RSV逆轉(zhuǎn)HHcy的心肌細胞線粒體膜電位抑制作用 與對照組比較，HHcy組的心肌細胞的Mitotracker紅色熒光顯著減弱，提示線粒體膜電位明顯下降(P<0.001)。HHcy組心肌細胞的JC-1不能聚集在線粒體基質(zhì)中，提示為JC-1單體 (顯示為綠色熒光)，HHcy組心肌細胞的線粒體膜電位明顯降低(P<0.001)。HHcy+RSV組Mitotracker和JC-1熒光顯微鏡下均觀察到線粒體膜電位的升高，顯著高于HHcy組(P<0.01)。見圖5、圖6、表1。

圖6 RSV升高HHcy導致的心肌細胞低線粒體膜電位(×400)

3 討 論

流行病學研究表明，血清Hcy濃度升高與心血管疾病的風險增加有關，且與經(jīng)典的心血管危險因素無關〔3〕。研究表明HHcy參與心肌損傷的主要機制包括通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激增加ROS的形成和細胞凋亡〔9〕。ROS的增加可能導致線粒體解耦聯(lián)，引起HHcy時心肌細胞能量代謝的破壞〔10〕。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)線粒體ROS的產(chǎn)生局限于線粒體復合物Ⅰ和Ⅲ〔11〕，而另外有研究表明Hcy誘導的ROS的增加與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶相關，而且NOX4表達升高可能在Hcy引起的線粒體相關凋亡機制中占有重要作用〔12〕。線粒體NOX4是最普遍的氧化酶之一，也是許多細胞類型和組織中ROS的主要來源〔13〕。然而，對于HHcy介導的線粒體損傷的具體機制卻知之甚少。本研究發(fā)現(xiàn)HHcy的心肌細胞中線粒體NOX4表達明顯升高，增加線粒體細胞色素C向細胞質(zhì)的滲漏，激活下游的Caspase-3引起細胞凋亡反應。另外，HHcy還可通過降低心肌細胞線粒體膜電位作用破壞線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，進一步加重心肌細胞的凋亡。表明Hcy誘導的心肌細胞凋亡可能與心肌細胞NOX4升高和線粒體膜電位下降相關。

近年來對RSV的研究日益增多，發(fā)現(xiàn)其具有多種的藥理作用，主要包括抗氧化、抗炎、細胞保護、抗腫瘤和調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝等。被應用治療多種疾病，如心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌疾病和腫瘤等〔14～17〕。然而關于RSV介導的心肌線粒體保護在HHcy心肌損傷中的作用卻未有相關研究報道。本研究發(fā)現(xiàn)RSV通過減輕HHcy對心肌細胞線粒體膜電位的抑制作用，減少線粒體中NOX4的表達，減輕線粒體細胞色素C的滲漏，最后抑制下游Caspase級聯(lián)反應，減少心肌細胞的凋亡，在一定程度上逆轉(zhuǎn)HHcy對心肌細胞的損傷作用。

盡管線粒體是氧化反應的中心，但線粒體相關的凋亡通路不是細胞損傷的唯一途徑。還有其他的凋亡途徑，如Caspase-8依賴性死亡受體途徑和Caspase-12相關內(nèi)質(zhì)網(wǎng)反應通路參與細胞死亡和氧化應激損傷進展〔18,19〕。然而，這些相關機制是否在HHcy介導心肌細胞凋亡中起作用仍不清楚，需要開展相關的實驗進一步探討和證明。

綜上，HHcy通過升高線粒體氧化酶NOX4表達，增加線粒體細胞色素C向細胞質(zhì)的滲透，激活下游的Caspase凋亡通路，促進心肌細胞的凋亡。此外HHcy能通過降低心肌細胞線粒體膜電位，增加線粒體膜通透性，進一步加重心肌細胞的損傷。而RSV通過抑制上述兩方面的損傷作用在一定程度上逆轉(zhuǎn)HHcy對心肌細胞的損傷作用，對心肌細胞發(fā)揮保護作用，為其未來臨床應用提供理論依據(jù)。