熱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)TasHSP16.9擬南芥幼苗生長(zhǎng)生理特性的影響

李靜婷++趙旭耀++劉超凡++秦永興

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.027

摘要：首先研究小麥16.9 ku小分子熱激蛋白（small heat shock protein，簡(jiǎn)稱sHSP）基因（sHSP16.9）3′-UTR中微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件（miniature inverted-repeat transposable elements，簡(jiǎn)稱MITE）插入對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的影響，結(jié)果顯示：熱脅迫下，具有MITE插入的基因型中sHSP16.9基因轉(zhuǎn)錄水平較無(wú)MITE插入的基因型明顯提高，而MITE是一類特殊的DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座子，推測(cè)其參與基因表達(dá)調(diào)控。隨后研究MITE參與基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制，構(gòu)建2種不同的植物表達(dá)載體pCAMBIA Super-1300+sHSP16.9、pCAMBIA Super-1300+sHSP16.9+MITE轉(zhuǎn)化擬南芥，結(jié)果顯示：sHSP16.9+MITE超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥中，sHSP16.9基因表達(dá)量較sHSP16.9超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥明顯提高；高溫脅迫下，sHSP16.9+MITE超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥中種子發(fā)芽率、幼苗存活率、游離脯氨酸含量均較sHSP16.9超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥明顯提高，而丙二醛含量升高的幅度明顯低于sHSP16.9超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥。由結(jié)果可知，sHSP16.9+MITE超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥耐熱性水平較sHSP16.9超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥高，推測(cè)sHSP16.9基因3′-UTR中MITE插入增強(qiáng)該基因的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：MITE；TasHSP16.9；3′-UTR；擬南芥；基因調(diào)控；小麥；耐熱性；生理指標(biāo)

中圖分類號(hào)： S188；Q786文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）10-0113-03

收稿日期：2016-03-28

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31501310）；平頂山學(xué)院高層次人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目（編號(hào)：2011015G）。

作者簡(jiǎn)介：李靜婷（1983—），女，內(nèi)蒙古包頭人，博士，講師，主要從事小麥遺傳育種學(xué)研究。E-mail：jingting_lee@163.com。在熱脅迫條件下，高等植物中誘導(dǎo)合成大量熱激蛋白，最豐富的為小分子熱激蛋白（small heat shock protein，簡(jiǎn)稱sHSP）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，高等植物中的sHSP還可在其他環(huán)境脅迫條件（如低溫、重金屬、高鹽、干旱等）下誘導(dǎo)合成，而在正常生長(zhǎng)環(huán)境條件下表達(dá)量很低，表明sHSP可能在植物耐脅迫方面發(fā)揮重要作用[1-2]。同時(shí)，大量研究表明，將sHSP基因轉(zhuǎn)入植物體后，可以顯著提高植物的耐熱性。Sanmiya等將番茄線粒體sHSPs基因轉(zhuǎn)化煙草，顯著提高了煙草的耐熱性[3]；張路等用灰?guī)r皺葉報(bào)春sHSP17-1基因轉(zhuǎn)化擬南芥，轉(zhuǎn)基因擬南芥耐熱能力明顯提高[4]。熱脅迫影響植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能，發(fā)芽率、幼苗存活率、丙二醛（MDA）含量、游離脯氨酸含量等指標(biāo)均能在一定程度上反映植物對(duì)高溫的抗性水平。

微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件（miniature inverted-repeat transposable elements，簡(jiǎn)稱MITE）是一類特殊的DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座子，經(jīng)常插入到基因的編碼區(qū)、內(nèi)含子、啟動(dòng)子、非翻譯區(qū)（UTR）而與基因緊密相關(guān)。但是，關(guān)于MITE插入與基因表達(dá)二者之間本質(zhì)關(guān)系的研究還比較少[5-9]。筆者所在課題組前期研究中通過單倍體分析發(fā)現(xiàn)，小麥中存在2種單倍型的sHSP16.9基因，即在sHSP16.9基因3′-UTR存在1個(gè) 276 bp MITE的插入/缺失?？寺?種單倍型小麥的sHSP169基因全長(zhǎng)進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子區(qū)僅有單堿基突變差異，對(duì)關(guān)鍵順式作用元件并無(wú)影響，主要差異在于3′-UTR內(nèi) 276 bp MITE的插入/缺失。在高溫、低溫脅迫條件下，具有MITE插入的基因型中sHSP16.9基因轉(zhuǎn)錄水平較無(wú)MITE插入的基因型顯著提高[10]。進(jìn)一步分別構(gòu)建2種不同的植物表達(dá)載體pCAMBIA Super-1300+sHSP16.9、pCAMBIA Super-1300+sHSP16.9+MITE轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)潮霉素篩選和PCR檢測(cè)，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代純系[11]。

本試驗(yàn)利用已篩選獲得的2種不同植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的擬南芥純系進(jìn)行熱脅迫處理，測(cè)定種子發(fā)芽率、幼苗存活率、丙二醛和游離脯氨酸含量等生長(zhǎng)生理指標(biāo)，分析2種類型轉(zhuǎn)基因植株的耐熱能力，進(jìn)而推測(cè)MITE對(duì)sHSP16.9基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料

供試品種是轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥純系、轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥純系，由筆者所在課題組前期篩選獲得；此外還有哥倫比亞野生型擬南芥（WT）。

1.2方法

1.2.1轉(zhuǎn)基因擬南芥植株熱脅迫條件的設(shè)定將轉(zhuǎn)基因擬南芥種子用5%次氯酸鈉溶液（含體積分?jǐn)?shù)0.1%的 TritonX-100）處理5 min進(jìn)行表面消毒，用蒸餾水沖洗6遍。4 ℃春化處理3 d后，將轉(zhuǎn)基因擬南芥種子播種于含 25 μg/mL 潮霉素的MS培養(yǎng)基上，在溫室中培養(yǎng)，光—暗周期為16 h—8 h，晝—夜溫度周期為22 ℃—18 ℃，濕度60%。培養(yǎng)10 d后選取長(zhǎng)勢(shì)好的幼苗移栽到營(yíng)養(yǎng)土中，培養(yǎng)4周后，選取生長(zhǎng)一致的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行42 ℃高溫脅迫處理，處理時(shí)間分別為2、4、8、12、24 h，光—暗周期為16 h—8 h。分別以2種供試類型的正常生長(zhǎng)條件轉(zhuǎn)基因擬南芥植株為對(duì)照，每個(gè)處理組進(jìn)行3次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.2種子萌發(fā)的熱脅迫處理將消毒處理后的轉(zhuǎn)基因、野生型擬南芥種子春化處理3 d后，在48 ℃水浴中處理2、3、4、5 h，分別播種在含25 μg/mL潮霉素及普通MS培養(yǎng)基上，于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2周后觀察種子的萌發(fā)情況，拍照并統(tǒng)計(jì)種子的萌發(fā)率。

1.2.3幼苗的熱脅迫處理將消毒、春化處理后的轉(zhuǎn)基因、野生型擬南芥種子分別播種在含25 μg/mL潮霉素及普通MS培養(yǎng)基上，在組培瓶中培養(yǎng)3周后，對(duì)轉(zhuǎn)基因、野生型擬南芥幼苗進(jìn)行獲得耐熱性檢測(cè)，即首先在38 ℃預(yù)處理2 h，隨后轉(zhuǎn)移至45 ℃致死高溫下分別處理1、2、3 h。處理后的擬南芥仍放回光照培養(yǎng)箱中恢復(fù)生長(zhǎng)6 d，觀察表型并且拍照統(tǒng)計(jì)成活率。

1.2.4生理指標(biāo)測(cè)定取上述熱脅迫處理的轉(zhuǎn)基因、野生型擬南芥植物的葉片進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，取平均值。MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法[12-13]測(cè)定；游離脯氨酸含量采用磺基水楊酸提取比色法[12-13]測(cè)定。試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel 2007、SPSS 18.0進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)基因擬南芥中sHSP16.9的表達(dá)模式

對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代純系進(jìn)行半定量分析發(fā)現(xiàn)，sHSP16.9+MITE超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥中sHSP16.9基因表達(dá)量較sHSP16.9超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥明顯提高（圖1）。推測(cè)sHSP16.9基因3′-UTR中MITE插入增強(qiáng)了sHSP16.9基因的表達(dá)。

2.2熱脅迫對(duì)種子萌發(fā)的影響

分別統(tǒng)計(jì)處理不同時(shí)間點(diǎn)的種子萌發(fā)率，由表1可以看出：在48 ℃熱脅迫下，擬南芥種子的萌發(fā)受到破壞或抑制，隨著熱激處理時(shí)間延長(zhǎng)，種子萌發(fā)率逐漸下降，在熱激處理5 h后，2種類型轉(zhuǎn)基因、野生型擬南芥種子都未萌發(fā)；在同一熱激處理時(shí)間點(diǎn)，轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥種子萌發(fā)率最高，轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥次之，WT的萌發(fā)率最低。本試驗(yàn)結(jié)果表明，sHSP16.9超表達(dá)能明顯提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐熱性，而且sHSP16.9+MITE超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥較sHSP16.9超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥耐熱性高。結(jié)果同時(shí)也表明，轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥中sHSP16.9基因表達(dá)量較轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥明顯提高。

2.3熱脅迫對(duì)幼苗的影響

分別統(tǒng)計(jì)處理不同時(shí)間點(diǎn)的幼苗存活率，由表2、圖2可以看出：隨著45 ℃熱激處理時(shí)間延長(zhǎng)，擬南芥植株成活率逐漸下降；45 ℃致死高溫處理3 h，野生型擬南芥幼苗已完全白化、死亡，轉(zhuǎn)基因擬南芥部分幼苗也出現(xiàn)白化，部分幼苗葉片大面積出現(xiàn)黃綠色，但仍然能夠生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥幼苗成活率最高。本試驗(yàn)結(jié)果表明：sHSP16.9超表達(dá)能明顯提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐熱性，而且轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥耐熱性較轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥明顯提高；同時(shí)表明，轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥中sHSP16.9基因表達(dá)量較轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥明顯提高。

2.4熱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥生理指標(biāo)的影響

2.4.1高溫脅迫下丙二醛含量的變化由圖3可以看出，在高溫脅迫下，2種類型轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中MDA含量均明顯增加，都明顯高于相應(yīng)對(duì)照；但是轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥中葉片MDA含量在各處理時(shí)間點(diǎn)都低于轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥，表明轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥的膜脂過氧化作用較小，因而具有更強(qiáng)的耐熱能力。

在熱脅迫前4 h，2種類型轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片MDA含量均升高，可能是由于高溫造成植物體內(nèi)的自由基代謝平衡失調(diào)、MDA積累；熱脅迫8 h，MDA含量均迅速下降，可能是擬南芥內(nèi)源熱激蛋白被誘導(dǎo)大量表達(dá)，協(xié)助熱變性的蛋白進(jìn)行正確折疊，并保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，導(dǎo)致MDA含量均迅速下降；隨后MDA含量均迅速上升，可能由于擬南芥誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源熱激蛋白開始降解，膜脂過氧化程度加劇，膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量迅速上升。

2.4.2高溫脅迫下游離脯氨酸含量的變化由圖4可以看出，高溫脅迫會(huì)使擬南芥葉片游離脯氨酸含量明顯提高，都明顯高于對(duì)照水平，但轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥中葉片游離脯氨酸含量在各處理時(shí)間點(diǎn)上都高于轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥。可見轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥對(duì)高溫脅迫有更積極的響應(yīng)和應(yīng)對(duì)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐熱性。在前4 h的熱處理中，轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥葉片游離脯氨酸含量緩慢提高，2種類型轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥差異不明顯；但是在熱處理4 h以后，2種類型轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥葉片游離脯氨酸含量迅速提高，且差異明顯，可能是擬南芥內(nèi)源熱激蛋白被誘導(dǎo)大量表達(dá)，提高了細(xì)胞穩(wěn)定性，促使合成大量游離脯氨酸，從而提高了細(xì)胞的耐熱性。

3討論與結(jié)論

小麥?zhǔn)俏覈?guó)重要的糧食作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要地位，但是隨著工業(yè)經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，溫室氣體大量排放，全球溫度逐漸上升，嚴(yán)重影響了小麥的正常生長(zhǎng)發(fā)育。由于干熱風(fēng)的影響，一般年份小麥減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重年份減產(chǎn)30%以上。為此，我國(guó)育種學(xué)家一直致力于小麥耐熱品種的選育和相關(guān)耐熱基因的功能研究。

在逆境下，植物細(xì)胞內(nèi)氧自由基平衡遭到破壞，發(fā)生膜脂過氧化作用，而丙二醛是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，可以反映細(xì)胞膜的損傷程度，丙二醛含量越高，說(shuō)明質(zhì)膜受損越嚴(yán)重。因此，逆境下的丙二醛含量可以顯示質(zhì)膜受損程度，反映植物的耐性大小。大量研究表明，在高溫脅迫下，植物體內(nèi)丙二醛含量顯著增加，但是耐熱品種中丙二醛含量低于熱敏感品種[14-15]。在熱脅迫下，報(bào)春PFsHSPs17-1轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中丙二醛含量上升幅度低于野生型對(duì)照，表現(xiàn)出較高的抗膜脂過氧化能力，因而具有更強(qiáng)的高溫適應(yīng)能力[4]。

在高溫脅迫下，植物為防止細(xì)胞脫水而受害，會(huì)生成并積累大量滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，提高原生質(zhì)親水性，有助于細(xì)胞持水，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性。游離脯氨酸便是一類重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，因此可作為植物抗逆性的一項(xiàng)生化指標(biāo)。大量研究表明，在高溫脅迫下，細(xì)胞內(nèi)游離脯氨酸含量會(huì)明顯增加，以增強(qiáng)植物的耐熱性[15-16]。在高溫脅迫下，報(bào)春PFsHSPs17-1轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中游離脯氨酸含量明顯高于野生型對(duì)照，轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)高溫脅迫有更積極的響應(yīng)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐熱性[4]。

在本試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥葉片中丙二醛含量上升幅度低于轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥，而前者游離脯氨酸含量、種子發(fā)芽率和幼苗成活率均明顯高于后者，表明轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥具有更強(qiáng)的耐熱性。同時(shí)研究表明，將sHSP轉(zhuǎn)基因超表達(dá)后，可以顯著提高植物的耐熱性[3-4]。也證明轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥中sHSP16.9表達(dá)量高于轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥，進(jìn)而推測(cè)sHSP16.9基因3′-UTR中MITE插入增強(qiáng)了sHSP16.9 基因的表達(dá)。同時(shí)，本試驗(yàn)中轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥種子發(fā)芽率、幼苗成活率均明顯高于野生型擬南芥，證明sHSP對(duì)提高植物耐熱性具有重要的作用，為小麥耐熱性育種研究提供了新思路。

參考文獻(xiàn)：

[1]Sato Y，Yokoya S. Enhanced tolerance to drought stress in transgenic rice plants overexpressing a small heat-shock protein，sHSP17.7[J]. Plant Cell Reports，2008，27（2）：329-334.

[2]Mahmood T，Safdar W，Abbasi B H，et al. An overview on the small heat shock proteins[J]. African Journal of Biotechnology，2009，8（25）：7290-7302.

[3]Sanmiya K，Suzuki K，Egawa Y，et al. Mitochondrial small heat-shock protein enhances thermos tolerance in tobacco plants[J]. FEBS Letters，2004，557（1/2/3）：265-268.

[4]張路，胡偉娟，張啟翔，等. 報(bào)春PF sHSP 17-1基因轉(zhuǎn)化擬南芥及耐熱鑒定[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2011（11）：177-181.

[5]Yang G，Dong J，Chandrasekharan M B，et al. Kiddo，a new transposable element family closely associated with rice genes[J]. Molecular Genetics and Genomics，2001，266（3）：417-424.

[6]Patel M，Jung S，Moore K，et al. High-oleate peanut mutants result from a MITE insertion into the FAD2 gene[J]. Theoretical and Applied Genetics，2004，108（8）：1492-1502.

[7]Yang G，Lee Y H，Jiang Y，et al. A two-edged role for the transposable element Kiddo in the rice ubiquitin2 promoter[J]. The Plant Cell，2005，17（5）：1559-1568.

[8]Magalhaes J V，Liu J，Guimares C T，et al. A gene in the multidrug

and toxic compound extrusion （MATE） family confers aluminum tolerance in sorghum[J]. Nature Genetics，2007，39（9）：1156-1161.

[9] Hou J N，Long Y，Raman H，et al. A Tourist-like MITE insertion in the upstream region of the BnFLC.A10 gene is associated with vernalization requirement in rapeseed （Brassica napus L.）[J]. BMC Plant Biology，2012，12（1）：463-480.

[10]Li J T，Wang Z Z，Peng H R，et al. A MITE insertion into the 3′-UTR regulates the transcription of TaHSP16.9 in common wheat[J]. Crop Journal，2014，2（6）：381-387.

[11]李靜婷，王健勝，楊風(fēng)玲.小麥MITE轉(zhuǎn)座子對(duì)sHSP基因的表達(dá)調(diào)控研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（12）：29-32.

[12]陳建勛，王曉峰.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 廣州：華南理工大學(xué)出版社，2002.

[13]侯福林.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M]. 北京：科學(xué)出版社，2004.

[14]葉凡，侯喜林，袁建玉.高溫脅迫對(duì)不結(jié)球白菜幼苗抗氧化酶活性和膜脂過氧化作用的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，23（2）：154-156.

[15]彭華婷，高悅，杜紅梅，等. 高溫脅迫對(duì)大花三色堇幼苗相關(guān)生理指標(biāo)的影響[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)科學(xué)版，2012，30（6）：66-71.

[16]萬(wàn)里強(qiáng)，李向林，何峰，等. 熱脅迫下兩種禾草抗性生理指標(biāo)的變化[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，25（4）：1468-1472.陳明輝，張志錄，楊雨華，等. 紅豆杉種質(zhì)資源遺傳多樣性的目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（SCoT）分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（10）：116-119.