王婭丹++楊雅梅++強敏++朱新生++王云

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.103

摘要：通過N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）法，將半抗原達氟沙星（danofloxacin，DAN）與載體蛋白牛血清白蛋白（BSA）偶聯，制備完全抗原DAN-BSA。對所制備的完全抗原通過FT-IR光譜、紫外光譜和SDS-PAGE進行分析確證，并通過測定免疫血清的效價和IC50對其免疫原性進行檢測。結果表明，DAN-BSA的FT-IR光譜較BSA和DAN均有變化；紫外光譜掃描中，DAN-BSA的最大吸收波長較BSA和DAN有所偏移；SDS-PAGE電泳中DAN-BSA的條帶較BSA條帶上移，說明DAN-BSA的分子量大于BSA；免疫原性檢測中，血清的效價達到256 000，IC50值為 28.84 μg/L，說明所制備的完全抗原具有免疫原性。綜上可知，完全抗原DAN-BSA成功合成，可以用來免疫動物制備抗體，這為后續(xù)免疫學檢測方法的建立奠定了良好的基礎。

關鍵詞：達氟沙星；完全抗原；N-羥基琥珀酰亞胺法；免疫原性

中圖分類號： Q812文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0354-03

收稿日期：2016-03-07

基金項目：國家科技支撐計劃（編號：2015BAK45B01）；江蘇省鎮(zhèn)江市農業(yè)科技支撐計劃（編號：NY2014024）；江蘇省普通高校研究生科研實踐計劃（編號：SJLX_0483）。

作者簡介：王婭丹（1990—），女，河南平頂山人，碩士，主要從事食品安全研究。E-mail：w_yadan@163.com。

通信作者：王云，博士，教授，從事食品生物技術研究。E-mail：wangy1974@ujs.edu.cn。達氟沙星（danofloxacin，簡稱DAN）是一種氟喹諾酮類抗菌藥物（圖1），具有抗菌譜廣、殺菌作用強、與其他抗菌藥物無交叉耐藥性等優(yōu)點，因而被廣泛用于動物疫病的預防和治療[1]；但是，達氟沙星會在動物組織中累積，通過食物鏈進入人體，進而威脅人體健康。已有研究表明達氟沙星會損傷人體器官，使人體免疫力下降，并且具有潛在的致癌性[2]。FAO /WHO 食品添加劑聯合專家委員會（ JCEFA）、歐盟及我國都制定了達氟沙星在肉制品中嚴格的殘留限量。由于達氟沙星在畜牧業(yè)中的加量使用和濫用現象普遍存在，因而需要建立一種針對達氟沙星的快速篩查技術。

目前，農獸藥殘留檢測以儀器分析法為主，如高效液相色譜法、氣相色譜-質譜法、高效液相色譜-質譜法、毛細管電泳法、高效薄層色譜法等[3-5]。儀器分析方法檢測準確，但是樣品前處理復雜，儀器設備價格昂貴，需要專業(yè)的實驗室和操作人員，這些缺點限制了儀器分析法在大規(guī)模快速篩查中的應用。免疫學檢測是基于抗原和抗體的特異性結合反應建立起來的一種快速分析方法，具有快速、簡便、特異性高等優(yōu)點，適合大量樣品的快速篩查和現場檢測[6]。免疫學檢測方法主要包括酶聯免疫法（ELISA）、膠體金試紙條、免疫親和柱等方法[7]。

免疫學檢測的關鍵是獲得對應的抗體。達氟沙星屬于小分子化合物，本身不具有免疫原性，必須先和載體蛋白偶聯獲得完全抗原，再進行動物免疫制備抗體。本試驗通過NHS法合成了達氟沙星的完全抗原，免疫動物制備獲得了相應的多抗，為達氟沙星的免疫學快速檢測奠定基礎。

1材料與方法

1.1試劑

達氟沙星，購自上海圣克魯斯生物技術公司；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1-乙基-3-（3-二甲基胺丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（EDAC）、二甲基甲酰胺（DMF）、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、弗氏佐劑均購自Sigma公司；HRP-山羊抗兔IgG購自上海生工生物工程公司；其他所涉及的試劑均為國產分析純，購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2試驗動物

新西蘭純系大白兔，雄性，體質量1.5～2 kg，購自江蘇大學動物中心。

1.3DAN完全抗原的制備

采用N-羥基琥珀酰亞胺法（NHS法）制備完全抗原[8]。稱取20 mg DAN、12.5 mg EDAC、10 mg NHS，充分溶解于 1 mL DMF中，并將其滴加到含有25 mg BSA的PBS（0.01 mmol/L，pH值7.4）溶液中，室溫攪拌3 h；將上述反應好的溶液裝入透析袋中，對PBS溶液4 ℃條件下透析3 d后，4 000 r/min離心20 min，收集上清液，冷凍干燥后，分裝保存。用 OVA代替BSA，制備包被原（DAN-OVA）。

1.4完全抗原DAN-BSA的FT-IR光譜掃描鑒定

取1 mg凍干的完全抗原DAN-BSA、BSA和DAN分別與KBr研磨壓片，進行FT-IR掃描分析。

1.5完全抗原DAN-BSA的紫外光譜掃描鑒定

在200～400 nm波長范圍內分別對完全抗原DAN-BSA、載體蛋白BSA和達氟沙星進行紫外掃描分析，以PBS溶液為空白對照。

1.6完全抗原DAN-BSA的SDS-PAGE電泳鑒定

SDS-PAGE電泳鑒定參照文獻[9]進行，濃縮膠和分離膠濃度分別為5%和12%。

1.7完全抗原DAN-BSA的免疫原性鑒定

1.7.1動物免疫完全抗原用生理鹽水配成1 g /L的溶液。首次免疫0.4 mg/只，用弗氏完全佐劑將完全抗原乳化后，采用背部皮下多點注射方式；加強免疫使用不完全佐劑進行抗原乳化。三免后第7天，耳緣靜脈取血，測定其效價和IC50值。

1.7.2免疫血清效價的測定采用間接ELISA法測定血清的效價，具體步驟如下：用DAN-OVA作為包被原，100 μL/孔，4 ℃包被過夜，PBST洗板3次；用含有0.2%明膠的PBS溶液作為封閉液，200 μL/孔，37 ℃封閉2 h，PBST洗板3次；用含有質量濃度0.1%明膠的PBST溶液作為抗體稀釋液，將免疫血清在稀釋2 000倍的基礎上做2倍倍比稀釋，100 μL/孔，37 ℃溫育1 h；將HRP-山羊抗兔IgG稀釋3 000倍作為酶標二抗，100 μL/孔，37℃溫育1 h；加入TMB顯色液，100 μL/孔，37 ℃溫育15 min；加入終止液，50 μL/孔，終止反應后，用酶標儀測定450 nm下的吸光度（D450 nm）。

1.7.3免疫血清IC50值的測定采用間接競爭ELISA法測定免疫血清的IC50值。將酶標板包被封閉后，每孔加入50 μL不同濃度的達氟沙星標準品溶液，再加入50 μL合適稀釋倍數的免疫血清，其他步驟同效價測定。

2結果與分析

2.1完全抗原DAN-BSA的紅外圖譜

如圖2所示，在1 700～1 600 cm-1處三者的吸收峰強度有很大不同，這是因為羧基極性強，在1 850～1 600 cm-1之間會出現非常強的吸收峰。達氟沙星有羧基，此處的吸收峰強度最大，完全抗原此處吸收峰強度變弱，說明達氟沙星和載體蛋白發(fā)生酰胺反應。達氟沙星相對分子質量遠遠小于載體蛋白BSA，其結構信息容易被掩埋在載體蛋白的結構信息中[10]，但圖譜顯示兩者的指紋區(qū)（1 300～670 cm-1）差別很大，指紋區(qū)對分子結構的微小變化表現很敏感，這里通過羧基吸收峰和指紋區(qū)的差別初步判定DAN和BSA發(fā)生反應合成完全抗原DAN-BSA。

2.2完全抗原DAN-BSA的紫外圖譜

圖3的紫外掃描圖譜表明，載體蛋白BSA在277 nm處有特征吸收峰，DAN在274 nm和326 nm處有2個特征吸收峰，完全抗原DAN-BSA在276 nm和325 nm處有2個特征吸收峰。紫外吸收具有加合性，完全抗原DAN-BSA的紫外圖譜保留了BSA在277 nm處的紫外特征吸收峰，也有DAN在326 nm處的特征吸收峰，但又有所遷移，說明BSA和DAN發(fā)生反應，另外透析過程中未反應的半抗原DAN已經除去，完全抗原在326 nm處仍有半抗原DAN的特征吸收峰并有所遷移，充分說明完全抗原的成功合成。

2.3完全抗原DAN-BSA的SDS-PAGE鑒定

凝膠電泳分析中樣品的遷移率只與分子質量有關，圖4顯示偶聯后產物DAN-BSA的相對分子質量大于BSA，并且條帶清晰，純度比較高，進一步說明完全抗原偶聯成功。

2.4完全抗原的免疫原性鑒定

2.4.1免疫血清的效價免疫血清的效價是指將免疫血清做倍比稀釋后與對應的配體相作用，出現反應的最大稀釋倍數，一般以陽性血清與陰性血清比值大于2.1倍時的稀釋倍數作為血清的效價。由圖5可以看出，隨著稀釋倍數的增加，陰性血清的D值無顯著變化，陽性血清的D值隨著稀釋倍數的增加而降低，ELISA測定的免疫血清的效價達到256 000。

2.4.2免疫血清的IC50值免疫血清的間接競爭ELISA曲線如圖6所示，根據擬合結果，得出3次免疫后免疫血清的IC50值為28.84 μg/L，最低檢測限IC15值為0.18 μg/L。所制備的完全抗原DAN-BSA具有免疫原性，可以制備針對DAN的特異性抗體。免疫血清的抑制性可以通過加強免疫和抗體純化進一步提高。

3結論

本試驗以BSA、OVA作為載體蛋白，采用NHS法，將DAN進行活化，生成中間產物，再與載體蛋白通過酰胺反應生成完全抗原，這樣可以防止載體蛋白對半抗原的包埋，使抗原決定簇完全外露，增加所產生抗體的特異性。

完全抗原的鑒定中，FT-IR圖譜、紫外圖譜和SDS-PAGE這3種方法檢測表明偶聯成功。雖然物理及化學方法的檢驗是必要的，但只有特異抗體的出現才是對完全抗原及其合成步驟的最好檢驗[11]，本試驗所獲免疫血清效價高、具有抑制性，可以通過加強免疫及純化進一步提高。

綜合完全抗原的鑒定，DAN-BSA偶聯成功并且具有良好的免疫原性，可以用來免疫動物進行DAN抗體的制備，為后續(xù)ELISA檢測、免疫親和柱和膠體金試紙條等免疫學檢測產品的制備奠定良好的基礎。

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