莖直黃芪化學(xué)成分分離與結(jié)構(gòu)鑒定

劉忠艷++趙寶玉++王建軍++朱洪云

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.105

摘要：采用D101大孔樹脂、聚酰胺和硅膠柱層析等色譜技術(shù)分別對西藏有毒植物莖直黃芪石油醚部位、正丁醇部位和水部位化學(xué)成分進行分離純化，并利用理化常數(shù)和波譜等數(shù)據(jù)進行化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果從莖直黃芪中共分離得到9個化合物，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定分別為β-谷甾醇（1）、胡蘿卜苷（2）、氧化氮苦馬豆素（3）、1-羥基吲哚里西啶（4）、斑莢素（5）、山奈酚-4′-甲基醚（6）、鼠李檸檬素-3-氧-β-D-半乳糖苷（7）、角鯊烯（8）和苦馬豆素（9），除化合物9外，其他化合物均首次從莖直黃芪中分離得到。

關(guān)鍵詞：莖直黃芪；化學(xué)成分；苦馬豆素；吲哚里西啶生物堿；角鯊烯

中圖分類號： R284.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0360-03

收稿日期：2015-10-25

基金項目：西藏自治區(qū)自然科學(xué)基金（編號：2015ZR-13-31）；西藏自治區(qū)教育廳重點實驗室建設(shè)項目。

作者簡介：劉忠艷（1982—），男，四川鄰水人，碩士，講師，主要從事有毒植物化學(xué)成分分析研究。E-mail：yjkdhqc@163.com。

通信作者：朱洪云，碩士，教授，主要從事疾病診療研究。E-mail：xizangzhy2004@sina.com。莖直黃芪（Astragalus strictus Grah. ex Benth）藏語稱通查、通扎，屬瘋草類豆科黃芪屬有毒植物，主要分布于西藏東部及南部、云南西北部（德欽）等地，是我國西部草地瘋草主要優(yōu)勢種之一[1-2]。瘋草（locoweed）是指含有苦馬豆素，能引起動物慢性中毒，并出現(xiàn)典型神經(jīng)學(xué)癥狀和病理學(xué)變化的一類豆科棘豆屬和黃芪屬有毒植物的總稱，因分布廣泛，成為我國乃至世界范圍內(nèi)危害最為嚴重的毒草[3]。近年來，瘋草的綜合防控措施研究較多，但主要集中于瘋草脫毒利用方面，而瘋草化學(xué)成分表明，瘋草中含有多類吲哚里西啶生物堿，除此之外還含有其他類別生物堿、酚類、黃酮及苷類、甾體、三萜類物質(zhì)等多種活性成分，具備天然產(chǎn)物開發(fā)潛力。植物源天然產(chǎn)物尤其是植物源藥物是天然產(chǎn)物資源研究的重要組成部分，60%以上的藥物直接或間接來源于天然產(chǎn)物，除人工化學(xué)合成外，植物次生代謝產(chǎn)物是人類藥物的重要來源，從高等植物的次生代謝物中開發(fā)新藥已成為當今世界性的課題[4]。目前，對瘋草類植物進行化學(xué)成分提取分離未見報道，因此本研究以分布廣泛的莖直黃芪為材料，通過柱色譜對莖直黃芪化學(xué)成分提取分離并進行鑒定，為莖直黃芪資源的藥理活性研究與開發(fā)，以及家畜瘋草中毒病防治的深入研究提供一些理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1植物材料莖直黃芪地上部分，于2005年8月采自西藏拉薩，陰干、粉碎備用。具體植株由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)院張躍進研究員鑒定。

1.1.2主要試劑主要試劑為D101大孔樹脂（天津市海光化工有限公司）、柱層析用聚酰胺30～60目[中國醫(yī)藥（集團）上海化學(xué)試劑公司]、薄層層析用硅膠GF254、柱層析用硅膠100～200目（青島海洋化工有限公司）。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3主要儀器主要儀器有RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、X-6顯微熔點測定儀（溫度未校正，北京泰克儀器有限公司）、ZF-2型三用紫外儀（上海安亭電子儀器廠）、NICOLET AVATAR 360FT-IR分光亮度計（美國Nicolet公司）、Agilent 1100 Series LC/MSD Trap 質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）、BRU KER-500F T-NMR光譜儀（以四甲基硅烷為內(nèi)標，德國Bruker公司）。

1.2化學(xué)成分提取與分離

1.2.1化學(xué)成分提取10 kg莖直黃芪同時采用乙醇冷浸和熱回流法分別提取、回收得到莖直黃芪總浸膏888.5 g，取439.5 g于2倍體積蒸餾水中制成懸浮液，用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇分段萃取，回收得到各極性段萃取部位。

1.2.2化學(xué)成分分離石油醚萃取部位（46 g）經(jīng)石油醚-丙酮硅膠柱層析梯度洗脫，薄層色譜（thin layer chromatogra phy，簡稱TLC）檢測合并得到片段1～12（簡稱Fr1～Fr12，以下類推），F(xiàn)r2經(jīng)硅膠柱層析，V石油醚 ∶V三氯甲烷=10 ∶1洗脫，重結(jié)晶得到無色針晶狀化合物1（7 mg）。Fr5～Fr7經(jīng)丙酮溶解、沉淀，得到白色粉末狀化合物2（13 mg）。

將莖直黃芪正丁醇萃取部位（50 g）溶解于水中，上樣于D101大孔樹脂，蒸餾水-乙醇梯度洗脫，TLC檢測合并后得到Fr1～Fr5。Fr1（4 g）經(jīng)制備性薄層色譜，V乙酸乙酯 ∶V乙醇 ∶V氨水 ∶V水=4 ∶16 ∶1 ∶1二次展開后刮板，重結(jié)晶得到化合物3（12 mg）。Fr1（8 g）經(jīng)三氯甲烷-甲醇-氨水柱層析梯度洗脫，得到化合物4（17 mg）、化合物5（8 mg）。Fr3（7 g）采用聚酰胺柱，乙醇-水梯度洗脫，得到化合物6（23 mg）、化合物7（18 mg）。

莖直黃芪水部位（43 g）經(jīng)硅膠柱層析，乙酸乙酯-工業(yè)酒精-濃氨水梯度洗脫，TLC檢測合并得到Fr1～Fr15。Fr6經(jīng)V三氯甲烷 ∶V甲醇 ∶V氨水=6 ∶1 ∶0.5硅膠柱層析梯度洗脫，重結(jié)晶后得到化合物8（26 mg）。Fr8經(jīng)堿性三氯甲烷處理，減壓升華得到化合物9（33 mg）。

1.2.3化合物結(jié)構(gòu)鑒定借助于紫外-可見光譜（UV）、紅外光譜（IR）、質(zhì)譜（MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）、核磁共振1H譜（1H-NMR）、核磁共振13C譜（13C-NMR）、二維核磁共振（2D-NMR）等化合物結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)，對分離得到的化合物1至9的結(jié)構(gòu)進行鑒定。

2化學(xué)成分結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為無色針晶狀（無水乙醇），熔點136.3～138.1 ℃。Liebermann-Burchard反應(yīng)、α-萘酚反應(yīng)均呈陽性。電子轟擊質(zhì)譜（EI-MS）顯示其[M]+m/z=414.4。紅外光譜（固體溴化鉀壓片法）[IR（KBr）]：3 423、2 935、2 872、2 855、1 467、1 382、1 061、1 053 cm-1，表示其含有羥基（3 423 cm-1）和醚鍵（1 061、1 053 cm-1）。13C-NMR（200 MHz，CDCl3）δ（ppm）：140.69（s，C-5），121.71（d，C-6），71.82（d，C-3），56.66（d，C-14），55.80（t，C-17），49.98（d，C-9），45.76（t，C-4），42.30（s，C-13），39.73（t，C-12），37.22（t，C-1），36.53（s，C-10），36.12（d，C-20），33.90（s，C-7），31.89（d，C-8），31.86（t，C-22），31.63（t，C-2），29.69（t，C-24），29.07（d，C-25），28.23（d，C-16），25.97（t，C-28），24.28（t，C-15），23.01（t，C-27），21.05（t，C-11），19.82（q，C-26），19.39（q，C-19），18.99（q，C-27），18.75（q，C-21），11.96（q，C-29），11.84（q，C-l8）。以上數(shù)據(jù)與文獻[5-6]基本一致。結(jié)合化合物1的理化數(shù)據(jù)，確定該化合物為β-谷甾醇（β-sitosterol），分子式：C29H50O。

化合物2為白色粉末（三氯甲烷），熔點280.5～281.7 ℃。IR（KBr）γmax：3 400、2 970、2 850、1 460、1 370、1 070、1 020 cm-1。EI-MSm/z：576（M+）、396、329、307、275、255、213、161。EI-MS顯示[M]+m/z為576。13C-NMR（C5D5N）δ（ppm）：140.97（C-5），121.93（C-6），102.58（C-1），78.62（C-3），78.70（C-3′），78.20（C-5′），75.40（C-2′），71.65（c-4′），62.90（C-6′），56.82（C-14），56.23（C-17），50.33（C-9），46.02（C-24），42.47（C-13），3993（C4），39.33（C-12），37.47（C-1），36.92（C-10），36.40（C-20），34.19（C-22），32.18（C-8），32.04（C-7），30.26（C-2），29.44（C-25），28.55（C-16），26.34（C-23），24.51（C-15），23.37（C-28），21.28（C-11），20.00（C-27），19.42（C-19），19.21（C-26），19.01（C-21），1217（C-29），11.98（C-18）。其光譜數(shù)據(jù)與文獻[6]報道的基本一致。結(jié)合化合物2理化數(shù)據(jù)，確定該化合物為胡蘿卜苷（daucosterol），分子式：C35H60O6。

化合物3為淡黃色菱形結(jié)晶（丙酮），極易吸潮。V三氯甲烷 ∶V甲醇 ∶V氨水 ∶V水=70 ∶26 ∶2 ∶2展開，H2O2/10%醋酐乙醇/Ehrlichs試劑顯色，Rf值為0.12（紅色）。IRmax（KBr，cm-1）：3 438（—OH），2 918（C—H），2 850（Bohlman帶）。化合物3的紅外光譜圖存在羥基、Bohlman帶，同時與苦馬豆素標準品顯色特性相同，分析其為苦馬豆素類似物；根據(jù)Molyneux等提供的瘋草中氧化氮苦馬豆素標準品Rf值（0.12），結(jié)合Molyneux等報道的氧化氮苦馬豆素的理化特性及其光譜數(shù)據(jù)[7]，確定化合物3為氧化氮苦馬豆素（swainsonine N-oxide），分子式：C8H15NO4。

化合物4為無色油狀液體（甲醇）。EI-MS質(zhì)核比（m/z）：141（M+），122，97（100%），82，69，55，41，28。IRmax（KBr，cm-1）：2 800（Bohlmann帶）。1H-NMR（400 MHz，D2O）δ（ppm）：6.00（m，1H），3.47（s，1H），3.00（m，2H），177（m，10H）。通過質(zhì)譜圖分析發(fā)現(xiàn)，分子離子峰（M+）為141，即分子量與斑莢素相差16（結(jié)構(gòu)相差1個—OH），且主要碎片離子相同。結(jié)合1H-NMR以及文獻[8]確定化合物4是1-羥基吲哚里西啶（l-hydroxyindolizidine），分子式：C8H15NO。

化合物5為無色油狀液體（甲醇）。IRmax（KBr，cm-1）：3 420（—OH），2 942（Bohlman帶）。EI-MS m/z：157（M+），140，123，97（100%），81，61，43，27。1H-NMR（400 MHz，D2O）δ（ppm）：4.06（1H，dd，H-2），3.62（1H，d，H-1），2.90（1H，dd，H-5β），2.84（1H，d，H-3β），2.64（1H，d，H-3α），2.03（1H，dd，H-5α），1.98（1H，dd，H-8α），1.22～1.90（6H，m）；13C-NMR（100 MHz，D2O）δ（ppm）：84.6（C-2），79.2（C-1），71.4（C-8α），62.2（C-3），54.3（C-5），29.4（C-6），25.8（C-8），24.8（C-7）。經(jīng)過對以上譜圖數(shù)據(jù)的綜合分析，結(jié)合文獻[9-10]確定化合物5是斑莢素（lentiginosine，1S，2S，8αS-1，2-dihydroxyindolizidine），分子式：C8H15NO2。

化合物6為黃色針狀結(jié)晶（三氯甲烷-丙酮）。熔點222～223 ℃。UV λmax（EtOH）：267、365 nm。ESI-MS：301[M+H]+，273。1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ（ppm）：12.47（1H，d，5-OH），10.18（1H，s，7-OH），9.55（1H，s，3-OH），8.08（2H，d，耦合常數(shù)J值=4.37，H-2′，6′），6.93（2H，d，J=4.37，H-3′，5′），6.74（1H，d，H-8），6.34（1H，d，H-6），3.85（3H，s，OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻[11-12]報道的3，5，7-三羥基-4′-甲氧基黃酮醇譜圖數(shù)據(jù)一致，故化合物6確定為3，5，7-三羥基-4′-甲氧基黃酮醇，即山奈酚-4′-甲基醚（kaempferol-4-methylether），分子式：C16H12O6。

化合物7為黃色片狀結(jié)晶（甲醇）。熔點255～256 ℃。UV λmax（EtOH）：266、349.5 nm。EI-MS m/z：300，271，257，167，150，136，121，105。1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ（ppm）：苷元部分8.08（2H，d，H-2′，6′），6.85（2H，d，H-3′，5′），673（1H，d，H-8），6.36（1H，d，H-6），3.65（3H，s，OCH3），糖上氫信號5.42（1H，d，H-1″），5.22～4.49（4H，d，H-2″，3″，4″，5″），3.64（2H，dd，H-6″）。H-2″與H-5″豎鍵偶合，H″為二重峰，故為β-糖苷。13C DMPT：（100 MHz，DMSO）δ（ppm）：苷元部分156.4（C，C-2），133.4（C，C-3），177.8（CO，C-4），160.2（C，C-5），98.0（C，C-6），165.2（C，C-7），92.4（C，C-8），161.0（C，C-9），105.0（C，C-10），120.9（C，C-1′），131.2（CH，C-2′，6′），115.2（CH，C-3′，5′），156.8（C，C-4′），56.2（OCH3），糖上碳信號101.6（CH，C-1″），73.2（CH，C-2″），75.9（CH，C-3″），68.0（CH，C-4″），71.3（CH，C-5″），60.3（CH2，C-6″）。將化合物7水解得到的6碳糖經(jīng)與標準品對照確定為D-半乳糖。經(jīng)過對以上譜圖數(shù)據(jù)和試驗現(xiàn)象的綜合分析，結(jié)合文獻[13-14]確定化合物7為鼠李檸檬素-3-氧-β-D-半乳糖苷（rhamnocitrin-3-O-β-D-galactoside），分子式：C22H22O11。

化合物8為淡黃色澄清油狀液體。EI-MS m/z：410（M+），137，121，95，82，69（100%），55，41。1H-NMR：5.11～5.18（m，6H），1.89～2.13（m，20H），1.71（s，6H），1.63（s，18H）。結(jié)合1H-NMR數(shù)據(jù)[15]，確定化合物8為2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯，俗稱角鯊烯（squalene），分子式：C30H50。

化合物9為白色針狀結(jié)晶。熔點144～145 ℃。V三氯甲烷 ∶V甲醇 ∶V氨水 ∶V水=70 ∶26 ∶2 ∶2展開，H2O2/10%醋酐乙醇/Ehrlichs試劑顯色，Rf值為0.47（紫紅色）。IRmax（KBr，cm-1）：3 423（—OH），2 943，2 891（C—H），2 828（Bohlman帶），1 072。EI-MS m/z∶173（M+），155，138，116，115，96（100%），84，72，43。經(jīng)TLC苦馬豆素標準品對照，結(jié)合文獻[16-17]光譜數(shù)據(jù)確定化合物9是苦馬豆素（1α，2α，8β，8αβ-trihydroxyindolizidine），分子式：C8H15NO3。

3討論

從莖直黃芪中分離得到9種化合物，分別鑒定為β-谷甾醇、胡蘿卜苷、氧化氮苦馬豆素、1-羥基吲哚里西啶、斑莢素、山奈酚-4′-甲基醚、鼠李檸檬素-3-氧-β-D-半乳糖苷、角鯊烯和苦馬豆素，除苦馬豆素外，其他化合物均首次從莖直黃芪中分離得到。β-谷甾醇具有降低血清膽固醇含量、消炎解熱、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用，而角鯊烯具有攜氧、抗癌、抗氧化、降低血清膽固醇含量等功能，均為活性藥物篩選的熱點[18-19]。氧化氮苦馬豆素、1-羥基吲哚里西啶、斑莢素和苦馬豆素屬吲哚里西啶類生物堿，是瘋草類有毒植物的主要成分，具有多樣的生物活性如抗癌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等功能。長期以來國內(nèi)學(xué)者僅從瘋草中分離得到苦馬豆素，其他類似物難以分離，本研究通過制備色譜、D101大孔樹脂等方法進行分離，為今后瘋草類植物的開發(fā)利用提供了一定的借鑒。

參考文獻：

[1]趙寶玉，曹光榮，段得賢，等. 西藏莖直黃芪對山羊的毒性研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，1992，23（3）：276-280.

[2]周啟武，趙寶玉，路浩，等. 中國西部天然草地瘋草生態(tài)及動物瘋草中毒研究與防控現(xiàn)狀[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46（6）：1280-1296.

[3]Cook D，Ralphs M H，Welch K D，et al. Locoweed poisoning in livestock[J]. Rangelands，2009，31（1）：16-21.

[4]Newman D J，Cragg G M. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010[J]. Journal Natural Products，2012，75（3）：311-335.

[5]羅婭君，肖新峰，王照麗. 大葉金花草化學(xué)成分的研究[J]. 化學(xué)研究與應(yīng)用，2009，21（1）：97-99.

[6]冀紫陽，楊彥霞，莊方方，等. 香蜂花葉化學(xué)成分研究[J]. 中藥材，2015，38（3）：510-513.

[7]Molyneux R J，James L F. Loco intoxication：Indolizidine alkaloids of spotted locoweed （Astragalus lentiginosus）[J]. Science，1982，216（6）：190-191

[8]Green D L C，Kiddie J J，Thompson C M. Stereochemistry of remote dianion addition to imines. Application to the synthesis of（1S，8aS）-l-hydroxyindolizidine[J]. Tetrahedron，1995，51（10）：2865-2874.

[9]Alam M A，Vankar Y D. Total synthesis of （+）-lentiginosine from d-glucose[J]. Tetrahedron Letters，2008，49（38）：5534-5536.

[10]Chaudhari V D，Kumar K S A，Dharale D D，et al. Synthesis of（-）-lentiginosine，its 8a-epimer and dihydroxylated pyrrolizidine alkaloid from D-glucose[J]. Tetrahedron，2006，62（18）：4349-4354.

[11]卜憲章，肖貴武，張敏，等. 高良姜化學(xué)成分研究[J]. 中藥材，2000，23（2）：84-87.

[12]劉志平，崔建國，劉紅星，等. 蒲葵葉化學(xué)成分研究[J]. 廣西植物，2007，27（1）：140-142.

[13]李平，俞惟樂，路英華，等. 黃花棘豆種子中化學(xué)成分的研究[J]. 化學(xué)學(xué)報，1991，49（12）：1510-1513.

[14]羅建光，孔令義. 巴西甘薯葉黃酮類成分的研究[J]. 中國中藥雜志，2005，30（7）：516-518.

[15]唐孝榮，王玲. 瑞香狼毒中2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯的分離鑒定及其生物活性研究[J]. 西華大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，31（2）：77-80.

[16]Lindsay K B，Pyne S G.. Asymmetric synthesis of （—）-swainsonine，（+）-1，2-di-epi-swainsonine，and （+）-1，2，8-tri-epi-swainsonine[J]. The Journal of Organic Chemistry，2002，67（22）：7774-7780.

[17]Buschmann N，Ruckert A，Blechert S. A new approach to（—）-swainsonine by ruthenium-catalyzed ring rerrangement[J]. The Journal of Organic Chemistry，2002，67（12）：4325-4329.

[18]李慶勇，姜春菲，張黎，等. β-谷甾醇、豆甾醇誘導(dǎo)人肝癌細胞SMMC-7721凋亡[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2012，23（5）：1173-1175.

[19]劉純友，馬美湖，靳國鋒，等. 角鯊烯及其生物活性研究進展[J]. 中國食品學(xué)報，2015，15（5）：147-156.