李敬美，丁圓媛，潘夕春，劉 雅，陳曉紅，張海港

(1.第三軍醫(yī)大學藥學院藥理教研室，2.藥物研究所與藥劑學教研室,重慶 400038)

細胞周期調節(jié)因子基因在H9c2心肌細胞肥大過程中的時相性表達變化

李敬美1，丁圓媛1，潘夕春1，劉 雅2，陳曉紅1，張海港1

(1.第三軍醫(yī)大學藥學院藥理教研室，2.藥物研究所與藥劑學教研室,重慶 400038)

目的 觀察血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)誘導H9c2心肌細胞肥大過程中細胞周期調控因子mRNA的時相性表達。方法 Ang Ⅱ (1.0 μmol·L-1) 刺激H9c2細胞，分別于0 min、5 min、10 min、30 min、1 h、2 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h，羅丹明標記鬼筆環(huán)肽染色并檢測細胞面積；Real-time PCR法檢測細胞周期蛋白(cyclin)B、D、E，細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)1、2、4、6，以及CDK抑制因子p21 mRNA的表達變化情況。結果 隨著Ang Ⅱ刺激時間的延長，H9c2細胞面積逐漸增大；細胞周期調節(jié)因子均于刺激后出現(xiàn)短暫反應性表達增加，周期蛋白E與CDK2、CDK4 mRNA在5 min時達到峰值，周期蛋白D mRNA在10 min時達到峰值，隨后一直呈減少趨勢；CDK6與周期蛋白B mRNA表達出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，分別于5 min和30 min達第一峰，隨后表達減少，于2 h達最低點，接著又表達增加，于12 h達第二峰。p21 mRNA表達量于30 min達峰值，隨后逐步減少，3 h時表達最低，之后又緩慢增加。結論 Ang Ⅱ誘導H9c2心肌細胞肥大發(fā)生的病理過程與細胞周期調控因子的震蕩性表達相關，各因子共同促進細胞肥大反應。

心肌肥大；心肌細胞；細胞周期；細胞周期蛋白；細胞周期蛋白依賴性激酶；細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子p21

心肌肥大(cardiac hypertrophy)是冠心病、高血壓、心律失常等眾多心血管疾病的獨立危險因素，然而其病理生理機制尚未完全闡明。傳統(tǒng)觀點認為心肌細胞是一種終末分化細胞，出生后不久即退出細胞周期，近年研究表明在受到病理刺激后心肌細胞可以重新進入細胞周期[1-3]，DNA及蛋白質合成增加，但一般不發(fā)生分裂，表現(xiàn)為心肌細胞肥大。我們前期研究證實，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1a (cyclin-dependent kinase inhibitor 1a, CDKN1a，p21) 在血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，Ang Ⅱ)誘導H9c2細胞肥大及異丙腎上腺素灌注誘導的小鼠心肌肥大模型中均異常表達；調控p21能有效抑制H9c2細胞肥大反應，減輕小鼠心肌肥大。鑒于細胞周期是非常復雜而精細的調節(jié)過程，有大量周期調節(jié)蛋白參與其中，細胞周期依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase, CDK) 是核心成員，與細胞周期蛋白(cyclin)、CDK抑制因子(CDK inhibitor，CKI) 等組成了細胞周期調控的網(wǎng)絡系統(tǒng)；CDK的激活依賴于cyclin，同時CDK的活性可以被CKI所抑制[4-6]。心肌肥大是心臟對機械負荷及其神經(jīng)體液因子的改變，進而維持適當收縮的代償反應以致失代償?shù)膭討B(tài)發(fā)展的復雜病理生理過程，而目前對細胞周期調節(jié)因子尚缺少連續(xù)性系統(tǒng)觀察，難以揭示心肌肥大發(fā)生過程中細胞周期改變的時空規(guī)律。本研究擬利用血管緊張素(angiotensin，Ang) Ⅱ誘導H9c2心肌細胞，動態(tài)觀察心肌肥大發(fā)展過程中cyclin B/D/E、CDK 1/2/4/6、p21 mRNA的表達變化，尋找其表達變化規(guī)律，進一步揭示心肌細胞肥大機制，為基于調控細胞周期防治心肌肥大的治療策略提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑 CFX Connect real-time PCR儀、SmartSpec 3000型分光光度計、SYBR GREEN定量超混液(Bio-Rad公司，美國)；DMI3000B型熒光倒置顯微鏡(Leica公司，德國)；3111型二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國)；3K18型離心機(Sigma公司，德國)；XDS-200C型顯微鏡(蔡康光學儀器有限公司，上海)；血管緊張素Ⅱ(MedChem Express公司，美國)；胎牛血清(Hyclone公司，美國)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)；羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽(Sigma公司，美國)；DAPI染色液(碧云天生物技術公司，江蘇)；RNAiso Plus、RNA逆轉錄試劑盒(TaAaRa公司，日本)。

1.1.2 試驗細胞 大鼠心肌細胞株H9c2購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組與處理 將H9c2細胞分別以1×104和3×105的密度接種于24孔和12孔培養(yǎng)板，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h后換無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后用Ang Ⅱ(1.0 μmol·L-1)分別孵育0 min、5 min、10 min、30 min、1 h、2 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h。

1.2.2 細胞面積的檢測 將細胞取出無菌室，吸棄培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次；4%多聚甲醛固定30 min。PBS洗滌2次；0.5%TritonX-100室溫孵育15 min，20 mg·L-1羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽避光染色40 min，PBS洗滌3次后DAPI染色5 min。熒光顯微鏡下觀察細胞，采用Image J軟件測量50個細胞的面積，取平均值。

1.2.3 Real-time PCR檢測細胞周期因子mRNA表達變化 使用Primer 5.0進行引物設計，引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列如下：

PrimernameForwardprimer(5′?3′)Reverseprimer(5′?3′)Annealingtemperatureβ?actinCGTAAAGACCTCTATGCCAACATAGGAGCCAGGGCAGTAATC58℃CDK1TCTTCGCTCGTTAAGAGTTACATCTGCCAGTTTGATTGTTC58℃CDK2GTTGACGGGAGAAGTTGTGGGCTTGACGATGTTAGGGTGAT58℃CDK4CTACGGACATACCTGGACAAAAATCTAGGCCGCTTAGAAACT58℃CDK6GTGGAAGTTCAGACGTGGATCAAGCATTTCAGAAGGAGGT58℃CyclinBCAGGCTTTCTCCGATGTGATTGCTCTTCCTCCAGTTGTCTG58℃CyclinD1GCCCTCCGTTTCTTACTTCACTCCTCTTCGCACTTCTGCT58℃CyclinEGTCAACGACACGGGAGAAGTAGCAGCGAGGACACCATAAG58℃p21GGTGATGTCCGACCTGTTCCACGCTCCCAGACGTAGTTGC58℃

如前所述處理細胞，RNAiso Plus提取細胞總RNA。按照RNA逆轉錄試劑盒操作說明書合成cDNA，按如下程序進行PCR反應：95℃，3 min；45個循環(huán)(95℃，10 s；58℃，30 s；72℃，30 s)；72℃，10 min；添加熔解曲線。采用 2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。

2 結果

2.1 AngⅡ刺激H9c2細胞面積增加 對照組H9c2細胞呈梭形、多角形。隨著Ang Ⅱ刺激時間的延長，H9c2細胞面積逐漸增大(Fig 1A)；Ang Ⅱ刺激10 min，H9c2細胞面積較對照組增大(P<0.05)，當刺激至24～48 h，細胞面積達對照組的2.5～3.0倍(Fig 1B)。

2.2 AngⅡ誘導H9c2心肌細胞cyclin B/D/E基因的時相性表達 Ang Ⅱ刺激H9c2細胞cyclin B mRNA的時相性表達呈現(xiàn)明顯的“波峰”和“波谷”，初始逐漸增加至30 min達峰值，較對照組增加了70%；而后表達量減少，2 h時表達最低，基本恢復正常水平。之后隨著Ang Ⅱ刺激時間延長，cyclin B mRNA表達逐漸升高，6 h時出現(xiàn)第二次峰值之后表達量又逐漸減小，48 h出現(xiàn)表達量的第二個“波谷”(Fig 2A)。cyclin D mRNA表達量先是緩慢增加，10 min升至最高點，較對照組增加了25%；隨后急劇下降，到1 h時其表達量僅為正常對照組的一半，并維持于低水平，從3 h開始，cyclin D mRNA表達量緩慢回升，至24 h基本恢復至正常水平；但48 h時，其表達量再次降低 (Fig 2B)。Ang Ⅱ處理H9c2細胞后，cyclin E mRNA表達瞬時升高，5 min時表達量即達到對照組的3倍；隨后其表達量隨著時相點的延長逐漸減少，3 h時降至正常水平以下并維持至6 h；隨后在12 h恢復接近正常水平 (Fig 2C)。

2.3 AngⅡ誘導H9c2心肌細胞CDK 1/2/4/6基因的時相性表達 在Ang Ⅱ刺激H9c2細胞5 min即誘導CDK 1/2/4/6 mRNA表達增高，其中CDK2 mRNA表達增加最為明顯，較對照組增加1.5倍；隨后CDK 1/2/4和6的mRNA表達開始下降，在3 h時CDK1 mRNA表達降至最低位，僅為正常對照組的70%，后又迅速升高，于24～48 h達到正常對照組1.5倍。隨著Ang Ⅱ刺激時間延長，CDK2和CDK4 mRNA表達呈現(xiàn)“階梯式”下降，3 h時達最低點，與對照組相比，分別降低了30%和60%，而后雖有小幅度升高，但總體維持于較低水平。CDK6 mRNA表達量在 Ang Ⅱ刺激5 min之后逐步降低，2 h時達最低點，而后升高至12 h后又呈現(xiàn)下降趨勢 (Fig 3)。

Fig 1 Increase of H9c2 cell areas treated with angiotensin Ⅱ

2.4 AngⅡ誘導H9c2心肌細胞p21 基因的時相性表達 Ang Ⅱ誘導H9c2細胞p21 mRNA表達逐漸增加，刺激30 min時p21 mRNA表達達峰值，較對照組增加了70%；之后隨著刺激時間的延長，p21 mRNA表達量急劇減少，至3 h時相比對照組降低了50%，之后雖有緩慢增加，但是均維持在較低水平 (Fig 4)。

3 討論

心肌肥大在細胞水平上指心肌細胞體積增大而無細胞分裂的一種現(xiàn)象，是多因素參與調節(jié)的復雜病理生理過程[7-8]。各種病理因素刺激循環(huán)及心肌局部的兒茶酚胺及Ang Ⅱ水平增加，促進全身微動脈收縮、增加外周血管阻力，誘導心肌肥大的發(fā)生發(fā)展。H9c2 細胞源于BD1X大鼠胚胎心臟組織，是兼具心肌和骨骼肌功能的特異心肌細胞株系，能夠良好模擬乳大鼠原代心肌細胞的生物學特性且能夠分裂，因此被廣泛應用于心肌肥大的研究。本實驗中AngⅡ作用于H9c2細胞，隨著刺激時間的延長，H9c2體積逐漸增大，且出現(xiàn)“雙核”現(xiàn)象，提示心肌肥大的細胞模型復制成功。

Fig 2 mRNA expressions of cyclin B, D and E in H9c2 cells treated with angiotensin Ⅱ

Cyclin、CDK、CKI 是細胞周期調控的內源性分子，三者在細胞周期中相互協(xié)調，形成復雜的調控網(wǎng)絡。在細胞周期不同時期，細胞周期調控點有不同cyclin/CDK復合物形成[9]；截至目前，已經(jīng)確定的CDKs就達21種[10]，但僅有CDK1/2/4/6參與細胞周期的調控[11-12]；CDK被激活之后發(fā)揮蛋白激酶活性，在cyclin/CDK復合物中作為催化亞基。cyclin是一類呈細胞周期特異性或時相性表達、累積與分解的蛋白質，在cyclin/CDK復合物中作為調節(jié)亞基。細胞周期蛋白cyclin D在細胞周期開始啟動時首先被合成，與其相應的周期蛋白激酶CDK4或CDK6結合形成復合物，在G1中至晚期發(fā)揮作用[13]；cyclin E是另一種G1期細胞周期蛋白，激活激酶CDK2，共同作用于G1晚期[14]；cyclin B能與CDK1結合，組成復合物MPF(maturation promoting factor)，促進細胞進入有絲分裂期，cyclin B作為細胞增殖必不可少的調控蛋白，主要于G2末期發(fā)揮作用[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在AngⅡ刺激10 min內，H9c2細胞內CDK4、CDK6、cyclin D mRNA的合成逐步增加。這些周期調節(jié)因子能夠促進多種與蛋白質、DNA合成密切相關的酶的轉錄，為細胞進入S期做準備。在AngⅡ刺激2h內，cyclin E與CDK2均處于高表達，這與細胞中核內復制有關；而cyclin B與CDK1在刺激3h后一直處于高水平表達，可促進細胞進入M期，完成細胞質分裂的需要。p21屬于CKI中的Cip/Kip家族成員，可以廣泛地作用于CDK-cyclin復合物并抑制它們的活性，特別是作用于G1期的CDK 4/6-cyclin D復合物導致細胞周期阻滯，阻止損傷DNA的復制[10,15]。本實驗中隨著AngⅡ刺激時間的延長，p21基因表達于30 min達峰值，隨后逐步減少，3h時表達最低，之后又緩慢增加，但一直維持低水平表達。因此，隨著AngⅡ刺激時間的延長，心肌細胞可以重新進入細胞周期，通過G1/S檢查點，進入了S期，合成核酸和蛋白質，促進心肌細胞發(fā)生肥大反應；但是重返細胞周期的肥大心肌細胞無法順利通過G2/M檢測點，導致細胞核分裂而胞質未能完成分裂，因而出現(xiàn)部分雙核細胞。這提示重返細胞周期的心肌細胞沒有順利的完成細胞分裂，其細胞周期再次被阻滯了；而p21WAF1/CIP1基因是目前已知最廣泛的細胞周期抑制因子，其對細胞周期復雜而又精細的調節(jié)作用，廣泛影響細胞周期發(fā)展的各階段。p21是通過競爭性與細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)結合，影響cyclins的磷酸化，從而影響細胞周期的運行[14]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，隨著AngⅡ刺激時間的延長，細胞周期調控因子CDKs、cyclins、p21 mRNA均呈波動性的表達，且重返細胞周期的心肌細胞并未完成胞質分裂，而是再次被阻滯，這是細胞周期正、負調控因子之間的相互作用的結果，與其在細胞中的表達變化分不開，在心肌肥大過程中p21基因震蕩性表達參與細胞周期的調控。

本研究結果顯示，在病理性刺激下，心肌細胞周期各調控因子基因表達水平呈時相性震蕩，共同促進心肌細胞重返細胞周期。本研究同時提示，在持續(xù)病理性刺激下，即使一些細胞周期正調控因子表達水平持續(xù)升高，細胞周期仍然被阻滯，致使細胞無法正常分裂，最終導致心肌細胞肥大。因此尚需對在心肌肥大過程中細胞周期調控因子之間的相互作用進行深入探討，為心肌肥大治療提供新的策略。

(致謝：本研究在第三軍醫(yī)大學藥學院藥理學教研室完成，感謝張海港教授在本文完成過程中給予的指導和建議。)

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Temporal expressions of cell cycle regulators mRNA during hypertrophic process of H9c2 rat cardiomyocytes induced by angiotensin Ⅱ

LI Jing-mei1, DING Yuan-yuan1, PAN Xi-chun1, LIU Ya2, CHEN Xiao-hong1, ZHANG Hai-gang1

(1.DertofPharmacology,CollegeofPharmacy,ThirdMilitaryMedicalUniversity; 2.InstituteofMateriaMedica,CollegeofPharmacy,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)

Aim To observe the mRNA expressions of cell cycle regulators at different time points during the hypertrophic process of H9c2 rat cardiomyoctes induced by angiotensin Ⅱ stimulation. Methods H9c2 myocytes were stimulated with 1.0 μmol·L-1angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ) for scheduled time. Cells were stained by Rhodamine labeled phalloidin and the cell area was measured by ImageJ software. mRNA expression levels of cyclin B, D, E, cyclin dependent kinase (CDK) 1, 2, 4, 6, and CDK inhibitor p21 were determined by real-time PCR at different time points (0, 5, 10, 30 min, and 1, 2, 3, 6, 12, 24, 48 h). Results H9c2 cell size increased soon after stimulation of Ang Ⅱ; mRNA expressions of cyclin E, CDK4 and CDK2 all reached the peak at 5min after stimulation of Ang Ⅱ; mRNA expression of cyclin D was increased dramatically at 10 min, followed by a decrease trend. However, the mRNA expression of cyclin B and CDK6 both showed two peaks, a p21 mRNA level was up to the peak at 30 min, and the expression was lowest at 3h. Although its expression increased gradually after 3h, p21 mRNA remained low level. Conclusion mRNA expression levels of the cell cycle regulators fluctuate and jointly facilitate the hypertrophic process of cardiomyocytes.

cardiac hypertrophy; cardiomyocytes; cell cycle; cyclin; cyclin dependent kinase; cyclin dependent kinase inhibitor p21

時間：2016-12-27 16:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161227.1613.024.html

2016-09-07,

2016-11-10

國家自然科學基金資助項目(No 30973524)；重慶市基礎與前沿研究計劃項目(No cstc2013jcyjA10094)

李敬美(1992-)，女，碩士，研究方向：心血管藥物藥理學，E-mail：jingmei382@163.com; 張海港(1970-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：心血管藥物藥理學，通訊作者，Tel：023-68752365,E-mail：hg001zhang@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.01.012

A

1001-1978(2017)01-0063-06

R-332；R322.11；R329.28；R341；R345.57；R542.202.2