何書芬，居文政，胡浩彬，朱立靜，戴國梁，張 倩

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院中藥室，江蘇 南京 210008 )

◇實(shí)驗(yàn)方法學(xué)◇

腎陽虛型抑郁癥大鼠模型的建立和評(píng)價(jià)

何書芬1，居文政1，胡浩彬2，朱立靜1，戴國梁1，張 倩1

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院中藥室，江蘇 南京 210008 )

目的 建立腎陽虛抑郁癥大鼠病證結(jié)合動(dòng)物模型并進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法 將24只大鼠按體質(zhì)量區(qū)間分組法分為對(duì)照組、模型組、自愈組；模型組與自愈組連續(xù)21 d注射氫化可的松，對(duì)照組給予等體積生理鹽水。造模結(jié)束后，各組進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)：曠敞試驗(yàn)、糖水偏好試驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)，LC-MS/MS法測(cè)血漿中5-HT、DA、NE的含量；取肝、腎、脾、胸腺、腎上腺、睪丸及附睪，計(jì)算臟器指數(shù)。結(jié)果 與對(duì)照組相比，模型組大鼠出現(xiàn)毛發(fā)干枯、畏寒、拱背蜷縮等癥狀，體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯遲緩，強(qiáng)迫游泳的不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，糖水偏好降低，曠敞試驗(yàn)水平得分、垂直得分均降低，肝、腎、脾、胸腺、睪丸及附睪的臟器指數(shù)不同程度降低，血中5-HT、NE含量增加；與模型組相比，自愈組大鼠血漿5-HT、NE、DA明顯下降，且5-HT、DA明顯低于對(duì)照組。結(jié)論 連續(xù)注射氫化可的松誘導(dǎo)腎陽虛型抑郁癥大鼠模型是一種可行的方法。

抑郁癥；腎陽虛；氫化可的松；動(dòng)物模型；指標(biāo)檢測(cè)；LC-MS/MS

抑郁癥是一種以持續(xù)情緒低落為主要癥狀的精神情志障礙性疾病，具有患病率高、自殺率高、難治愈及復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，是全球性公共衛(wèi)生問題之一。中醫(yī)認(rèn)為抑郁癥病因病機(jī)復(fù)雜，近年來中醫(yī)醫(yī)家認(rèn)為腎陽主導(dǎo)抑郁癥發(fā)生，腎陽不足是抑郁癥的基礎(chǔ)病機(jī)，臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明輔以溫補(bǔ)腎陽法治療抑郁癥取得更好的效果。研究表明糖皮質(zhì)激素及其受體與抑郁癥密切相關(guān)[1]，且目前腎陽虛抑郁癥動(dòng)物造模方法主要是給予外源性糖皮質(zhì)激素，本實(shí)驗(yàn)試圖通過注射氫化可的松建立腎陽虛型抑郁癥大鼠模型，從行為學(xué)及生理變化多方面評(píng)價(jià)模型，為進(jìn)一步開展腎陽虛型抑郁癥的病理病機(jī)研究及篩選合適的中藥治療腎陽虛型抑郁癥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 注射用氫化可的松琥珀酸鈉粉針劑(天津生物化學(xué)制藥有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：021509017，規(guī)格10 mg/片)，用生理鹽水配成濃度為4 mg·mL-1，對(duì)照品鹽酸五羥色胺、鹽酸多巴胺均購于Sigma公司(批號(hào)分別為1001528057、101280875)；重酒石酸去甲腎上腺素、內(nèi)標(biāo)替硝唑均購于中國藥品生物制品檢定所(批號(hào)分別為：100169-201103、100336-200402)，苯甲酰氯購于成都科龍化工試劑廠(批號(hào)：20120529，分析純，98%)，甲醇、乙腈為色譜純，甲酸、乙酸銨、四硼酸鈉等均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器 Waters Quattro Micro液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Waters公司)，色譜工作站：Masslynx4.1；梅特勒-托利多AE240電子天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；Thermo Micro17冷凍高速離心機(jī)(美國Thermo公司)；Millipore Driet-Q5超純水機(jī)(法國Millipore公司)；WH-2微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)，游泳缸，自制敞箱，-20 ℃冰箱(海爾)，非接觸性紅外測(cè)試溫度計(jì)(Vicks)。

1.3 動(dòng)物及造模方法 SPF級(jí)健康成年SD大鼠24只，♂，體質(zhì)量(150±20) g，由南通大學(xué)提供，合格證號(hào)：(蘇)2014-0001SPF級(jí)，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，保持12 h晝夜節(jié)律，室溫(22±2) ℃，濕度50%，自由攝食飲水。按體質(zhì)量區(qū)間分組法將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、自愈組，8只/組，4只/籠。模型組、自愈組大鼠每天14:00左右臀部肌肉注射氫化可的松25 mg·kg-1，連續(xù)21 d[2]，對(duì)照組大鼠給予等體積的生理鹽水。21 d造模結(jié)束后，空白組、模型組大鼠眼眶取血0.5 mL，置于肝素鈉浸泡過的1.5 mL EP管中，4 ℃，3 000 r·min-1離心10 min，分離血漿于-20 ℃冰箱中備用；隔天處死大鼠，取肝、腎、脾、胸腺、腎上腺、睪丸及附睪稱重。自愈組停止給藥，正常進(jìn)食進(jìn)水，14 d后，同上操作。

1.4 行為學(xué)評(píng)估

1.4.1 一般四診指標(biāo) 觀察各模型組大鼠實(shí)驗(yàn)過程中生長(zhǎng)發(fā)育情況，精神狀態(tài)，活動(dòng)度，毛發(fā)，大小便情況等。

1.4.2 大鼠體重、體溫檢測(cè) 測(cè)定時(shí)間為實(shí)驗(yàn)前d 0和造模過程中的7、14、21 d，按動(dòng)物序號(hào)進(jìn)行測(cè)量。

1.4.3 糖水偏好[2]實(shí)驗(yàn)前1 d，將大鼠單籠適應(yīng)24 h。d 1：給予每只大鼠2瓶1%蔗糖水；d 2：給予每只大鼠1瓶1%蔗糖水，1瓶純凈水；d 3：所有大鼠均禁食禁水23 h；d 4：給予每只大鼠事先定量的2瓶水：1瓶1%蔗糖水，1瓶純凈水，1 h后交換兩瓶位置，計(jì)算大鼠在2 h內(nèi)的糖水消耗量。

1.4.4 曠敞試驗(yàn)[2]將大鼠放入高40 cm，長(zhǎng)、寬均為80 cm，內(nèi)壁涂黑，底面平均分為25個(gè)(16×16) cm2的小方格的箱內(nèi)底面中心，同時(shí)進(jìn)行攝像和計(jì)時(shí)，以5 min內(nèi)大鼠穿越箱底面的方格數(shù)為水平得分(三爪以上跨入)，穿越1格得1分；以雙前肢抬起次數(shù)為垂直得分(兩前肢離地1 cm以上)，雙前肢離地1次得1分。徹底清潔敞箱后再進(jìn)行下1只大鼠的觀察。

1.4.5 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)[3]將大鼠放入直徑40 cm、水深35 cm的桶內(nèi)，水溫25 ℃，適應(yīng)2 min，累計(jì)后4 min內(nèi)大鼠的不動(dòng)時(shí)間。

1.5 生化指標(biāo)評(píng)估

1.5.1 臟器指數(shù)測(cè)定[4]解剖動(dòng)物臟器，稱重，計(jì)算臟器系數(shù)，臟器系數(shù)=臟器重量/體質(zhì)量×100%。

1.5.2 血漿中5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)含量測(cè)定

1.5.2.1 血樣處理[3]取血漿100 μL，加入10 μL內(nèi)標(biāo)(替硝唑：5.28 mg·L-1)，加入200 μL乙腈，渦旋1 min，12 000 r·min-1離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的EP管中，依次加入50 μL苯甲酰氯(體積分?jǐn)?shù)為2%的苯甲酰氯溶于乙腈溶液中)及50 μL四硼酸鈉緩沖溶液(100 mmol·L-1)，室溫下微振10 min，12 000 r·min-1離心5 min，取上清100 μL于進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)樣10 μL分析。

1.5.2.2 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18(150 mm×2.1 mm，5 μm)，美國Agilent公司；保護(hù)柱：Agilent Zorbax SB-C18(12.5 mm×2.1 mm，5 μm)，美國Agilent公司；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液(含2.0 mmol·L-1乙酸銨) ∶乙腈=35 ∶65；流速：0.2 mL·min-1，柱溫：35 ℃。

1.5.2.3 質(zhì)譜條件 多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)模式；電噴霧正離子化檢測(cè)(ESI+)；檢測(cè)電壓：3.0 kv；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑溫度：350 ℃；脫溶劑氣體流速：450 L·h-1。各成分的檢測(cè)離子、錐孔電壓、碰撞能量見Tab 1。

Tab 1 MRM parameters of three analytes and internal standards(IS)

2 結(jié)果

2.1 大鼠的生活狀態(tài) 造模前各組大鼠發(fā)育正常，毛發(fā)光澤整齊，無豎毛，大小便正常，行為活躍，對(duì)外來刺激反應(yīng)靈敏?？瞻捉M大鼠造模前、后一般狀況無明顯變化；與空白組相比，模型組大鼠生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，毛發(fā)枯燥無光澤，豎毛，泄瀉，精神萎靡，對(duì)外來刺激反應(yīng)差，行動(dòng)遲緩，常蜷縮在角落。

2.2 行為學(xué)測(cè)試結(jié)果 造模過程中，模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，14 d時(shí)，模型組體質(zhì)量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，21 d時(shí)，模型組體質(zhì)量極明顯低于對(duì)照組 (P<0.01)，同時(shí)模型組大鼠的水平得分、垂直得分、糖水偏好及強(qiáng)迫游泳的不動(dòng)時(shí)間均極明顯低于對(duì)照組 (P<0.01)，模型組大鼠體溫低于對(duì)照組，但無明顯差異，見Tab 2。

Time/dTestitemControlgroupModelgroup0Bodyweight/mg177179Bodytemperature/℃35．235．47Bodyweight/g242235Bodytemperature/℃35．034．914Bodyweight/mg284266?Bodytemperature/℃36．636．521Bodyweight/mg324277??Bodytemperature/℃35．535．1Open?fieldtest Levelscore67±1338±18?? Verticalscore30±1013±8??Sucrosepreferencetest/%69．52±11．8547．97±14．56??Forcedswimtest(immobiletime)/s59．3±14．5111．6±15．78??

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.3 生化指標(biāo)結(jié)果 ♂ SD注射氫化可的松后，腎臟、胸腺、睪丸及附睪指數(shù)明顯降低(P<0.05)，脾臟指數(shù)極明顯降低(P<0.01)，肝臟指數(shù)降低，但變化不明顯，腎上腺指數(shù)無明顯差異，見Tab 3。

2.4 樣品測(cè)定 結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組大鼠血漿中5-HT、NE的含量明顯或極明顯升高(P<0.05,P<0.01 )，與模型組相比，自愈組大鼠血漿中5-HT、NE、DA的含量明顯或極明顯降低(P<0.05,P<0.01)，并且自愈組5-HT、DA的含 量明顯或極明顯低于正常組(P<0.05,P<0.01)，而NE含量依然高于正常組。見Tab 4。

GroupLiverKidneySpleenAdrenalglandThymusTestisandepididymisControl3．77±0．970．72±0．100．22±0．010．02±0．010．11±0．031．21±0．13Model3．50±0．240．66±0．02?0．16±0．03??0．02±0．000．08±0．03?1．13±0．13?Self?healing3．49±0．300．67±0．08?0．16±0．02??0．02±0．000．08±0．01?1．12±0．14?

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Group5?HT/mg·L-1NE/mg·L-1DA/mg·L-1Control0．06±0．011．51±0．710．24±0．04Model0．19±0．13??2．20±0．43?0．24±0．04Self?healing0．04±0．01?##1．63±0．35#0．13±0．03??##

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3 討論

中醫(yī)“證”是祖國醫(yī)學(xué)理論的基本概念，也是實(shí)施中醫(yī)辨證施治的基礎(chǔ)，因此建立可靠的動(dòng)物模型是深入研究疾病的前提之一。本實(shí)驗(yàn)采取連續(xù)21 d給予SD大鼠肌注氫化可的松25 mg·kg-1，行為學(xué)評(píng)估結(jié)果顯示大鼠表現(xiàn)出明顯的腎陽虛抑郁狀態(tài)，如拱背、蜷縮、毛發(fā)疏松、無光澤、泄瀉、體質(zhì)量減輕、體溫降低，糖水偏好降低，強(qiáng)迫游泳的不動(dòng)時(shí)間明細(xì)延長(zhǎng)，曠場(chǎng)試驗(yàn)的水平得分和垂直得分明顯降低，與實(shí)驗(yàn)報(bào)道一致[5-8]，已造成腎陽虛型抑郁癥模型。

病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，模型大鼠的肝、腎、脾、胸腺、睪丸及附睪的臟器指數(shù)均不同程度的降低，其中脾臟指數(shù)下降極為明顯，提示氫化可的松可導(dǎo)致大鼠腎臟、脾臟、睪丸等萎縮，生理機(jī)能減退、免疫力下降、性功能降低，說明氫化可的松導(dǎo)致大鼠下丘腦-垂體-性腺軸和腎上腺軸-胸腺軸功能紊亂[4,6,9]，模型大鼠出現(xiàn)腎陽虛型抑郁癥的病理癥狀，停止氫化可的松刺激14 d后，受影響的臟器未能恢復(fù)正常，認(rèn)為氫化可的松造成的臟器損傷可能是不可逆的。

抑郁癥經(jīng)典的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和受體假說認(rèn)為，抑郁癥的發(fā)生可能與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)功能失衡有關(guān)，5-HT、NE、DA被認(rèn)為與抑郁癥發(fā)生密切相關(guān)。由于5-HT、DA及NE是內(nèi)源性物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)在參考文獻(xiàn)[3]的基礎(chǔ)上，采用活性炭預(yù)處理后的血漿作為空白血漿，排除了5-HT、NE對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，同時(shí)大大降低了DA的干擾，保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確可靠。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示持續(xù)注射外源性氫化可的松可引起大鼠血漿中5-HT、NE含量明顯升高，與蔡定芳等的研究結(jié)果一致[10-12]，且更早研究表明內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素缺乏時(shí)支配中樞單胺類遞質(zhì)的神經(jīng)興奮性增高[13-14]，提示長(zhǎng)期大劑量注射氫化可的松導(dǎo)致HPA軸功能低下的同時(shí)，反饋性激活中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的合成及代謝，大鼠表現(xiàn)出腎陽虛抑郁狀態(tài)；停止注射氫化可的松14 d后，與模型組相比，自愈組大鼠血漿中5-HT、NE及DA含量下降，并且5-HT、DA含量明顯低于正常組，而NE含量依然高于正常組，楊慧敏等[15]對(duì)不同中醫(yī)癥型抑郁癥進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，心腎不交型抑郁癥5-HT、DA水平低下，NE水平相對(duì)亢進(jìn)，與本實(shí)驗(yàn)自愈組結(jié)果一致，認(rèn)為模型大鼠在14 d內(nèi)不僅未能恢復(fù)正常狀態(tài)，反而由腎陽虛型發(fā)展為心腎不交型，病情加重。本研究亦從單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量角度初步揭示了腎陽虛型抑郁癥，若久病不治，腎之精血不足，不能上養(yǎng)心神，最終將可能發(fā)展成心腎不交型抑郁癥。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)在江蘇省中醫(yī)院基礎(chǔ)藥理實(shí)驗(yàn)室和臨床藥理實(shí)驗(yàn)室完成，特此致謝！)

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Establishment and evaluation of animal model of depression rats with kidney-yang deficiency

HE Shu-fen1, JU Wen-zheng1, HU Hao-bin2, ZHU Li-jing1, DAI Guo-liang1, ZHANG Qian1

(1.DeptofClinicalPharmacology,theAffiliatedHospitalofNanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210029,China; 2.Mesothecium,JiangsuInstituteforFoodandDrugControl,Nanjing210008,China)

Aim To establish depression rat model with kidney-yang deficiency and evaluate the related parameters. Methods A total of 24 adult SD rats were divided into control group, model group and self-healing group by body weight. Model group and self-healing group were injected hydrocortisone for 21 days, meanwhile the control group was injected sodium chloride. After modeling, the related indexs detection were taken out: open-field test, sucrose preference test and forced swim test. Then the orbital blood was taken to detect 5-HT, DA and NE by LC-MS/MS. And liver, kidney, spleen, thymus, adrenal gland, testis and epididymis were taken to calculate organ index. Results Compared with the control group, model rats displayed depression and kidney yang deficiency syndrome such as dry hairs, chills, back arched and so on. Correspondingly, the body weight increased slowly. Immobility in FST was significantly increased. Sucrose preference, horizontal scores and vertical scores was significantly decreased. Organ index decreased in liver, kidney, spleen, adrenal, testis and epididymis. The level of 5-HT and NE was significantly high. Compared with the model group, 5-HT, NE and DA were significantly reduced, 5-HT and DA were even lower than those of the control group. Conclusion Depression rat model with kidney-yang deficiency could be induced by continuous injection of hydrocortisone.

depression; kidney-yang deficiency; hydrocortisone; animal model; index detection; LC-MS/MS

時(shí)間：2016-12-27 16:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161227.1613.048.html

2016-09-12,

2016-11-28

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81573685)；江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心重點(diǎn)項(xiàng)目(No ZDXM-2)

何書芬(1989-)，女，碩士生，研究方向：中藥臨床藥理，E-mail：l097089864@qq.com； 居文政(1965-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥臨床藥物代謝動(dòng)力學(xué),通訊作者，E-mail：wzhju333@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.01.024

A

1001-1978(2017)01-0140-04

R-332；R241.3；R322.61；R363-332；R749.41