蔡 軼，黃珺珺，劉夏雯，黃碧云，朱 柳，吳 波

(廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物研發(fā)中心，廣東 廣州 511436)

◇論 著◇

過表達Nampt通過激活NF-κB誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大

蔡 軼，黃珺珺，劉夏雯，黃碧云，朱 柳，吳 波

(廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物研發(fā)中心，廣東 廣州 511436)

目的 研究過表達尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase, Nampt)對心肌細(xì)胞肥大的影響，并初步探討NF-κB在其中的作用。方法 心肌細(xì)胞給予苯腎上腺素(PE)或過表達Nampt處理，采用Real-time PCR檢測Nampt、ANP和BNP的mRNA表達，利用Western blot檢測Nampt的蛋白水平，使用免疫熒光檢測心肌細(xì)胞表面積，采用雙熒光素酶報告基因的方法檢測NF-κB依賴的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果 過表達Nampt能夠誘導(dǎo)ANP和BNP等肥大基因的激活，增加心肌細(xì)胞表面積；過表達Nampt能夠增加NF-κB依賴的轉(zhuǎn)錄活性，而沉默NF-κB的p65亞基能夠部分取消Nampt對心肌細(xì)胞肥大的調(diào)控作用。結(jié)論 過表達Nampt能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，其機制可能與NF-κB的激活有關(guān)。

Nampt；心肌肥大；NF-κB；苯腎上腺素；ANP; BNP

心肌肥大是一個非常重要的病理進程，它是心臟在病理狀態(tài)下維持適當(dāng)收縮功能的代償反應(yīng)，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大、重量增加、間質(zhì)細(xì)胞增生以及心肌重構(gòu)等。長期的心肌肥大可導(dǎo)致冠心病、心律失常、心力衰竭，是心功能惡化及心源性死亡的獨立危險因素，因此，研究心肌肥大的分子機制具有十分重要的意義[1-3]。

尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase, Nampt)，又名內(nèi)臟脂肪素visfatin，或前B細(xì)胞克隆增強因子PBEF，是哺乳動物生命活動中不可或缺的蛋白[4]。在哺乳動物細(xì)胞中，Nampt是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)生物合成過程中的限速酶，廣泛表達于心、腦、肺、骨髓、肝臟、肌肉等機體各組織和器官中，與糖尿病、肥胖、動脈粥樣硬化、血管內(nèi)皮炎性損傷等密切相關(guān)[5-7]，提示Nampt在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。然而，Nampt在心肌細(xì)胞肥大中的作用國內(nèi)外少有報道，值得進一步研究。本實驗以新生大鼠心肌細(xì)胞作為主要研究對象，通過檢測過表達Nampt對心肌細(xì)胞肥大的影響，并初步探索NF-κB依賴的信號通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 出生1～3 d的SD大鼠，♀♂不限，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清均購自Gibco BRL公司；苯腎上腺素(PE)購自Sigma-Aldrich公司，用無菌超純水配成0.1 mol·L-1儲存液，并于-80℃保存；Nampt兔多抗購自Sigma-Aldrich公司；β-actin小鼠單抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗均購自廣州市潔利生物醫(yī)學(xué)有限公司；Opti-MEMI培養(yǎng)基和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；含有NF-κB結(jié)合位點的PGL4.32-NF-κB-RE-luc2P和作為內(nèi)參使用的PRL-TK質(zhì)粒均購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 心肌細(xì)胞培養(yǎng)與處理 取1～3 d新生SD大鼠，用75%酒精擦凈胸部及腹部皮膚后，開胸，取出心臟，放入預(yù)冷的PBS緩沖液中。剔除心臟上的結(jié)締組織，并剪成1 mm3的碎塊。連同PBS吸入離心管，瞬時離心后去上清。將心肌組織移入錐形瓶，加入15 mL 0.08%的胰蛋白酶于磁力攪拌器上37℃水浴消化。5 min后收集細(xì)胞上清至5 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，1000 r·min-1離心5 min，棄上清，重懸細(xì)胞沉淀，剩余組織繼續(xù)消化，直到組織塊消化完全為止。收集各次消化細(xì)胞懸液，1000 r·min-1離心5 min，用DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后，收集上清，并加入0.1 mmol·L-1Brdu以抑制心肌成纖維細(xì)胞生長。培養(yǎng)24h之后，換新鮮含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，此時部分細(xì)胞開始出現(xiàn)搏動。在處理細(xì)胞之前換含0.1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h，使細(xì)胞同步化[8]。再給予PE(100 μmol·L-1)或轉(zhuǎn)染Nampt及空載體處理細(xì)胞24 h，并進行后續(xù)實驗。

1.2.2 Real-time PCR檢測mRNA表達 乳鼠心肌細(xì)胞給予不同濃度PE處理不同時間或給予過表達Nampt及其空載體處理之后，棄培養(yǎng)基，采用TRIzol一步法提取心肌細(xì)胞中的總RNA，RNA 定量后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用BIO-RAD熒光定量PCR系統(tǒng)進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃ 10 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，循環(huán)50次；95℃ 15s，60℃ 1 h；65℃ 30 s，循環(huán)61次。每組樣品設(shè)3個復(fù)孔，以保證實驗數(shù)據(jù)的有效性。各目的基因及內(nèi)參引物以Primer premier 5.0 軟件設(shè)計，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見Tab 1。

Tab 1 Sequence of primers for quantitative real-time PCR

1.2.3 Western blot檢測蛋白表達 乳鼠心肌細(xì)胞分別過表達空載體質(zhì)?；駿GFP-Nampt質(zhì)粒24 h之后，棄培養(yǎng)基，加入三去污裂解液提取細(xì)胞總蛋白，依次進行 SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，并加入待測一抗Nampt(稀釋比： 1 ∶1 000)和內(nèi)參抗體β-actin(稀釋比：1 ∶1 500)，于4 ℃孵育過夜，次日加入相應(yīng)的二抗，化學(xué)發(fā)光法檢測目的蛋白表達水平，采用Image J軟件對顯影的條帶進行灰度分析。

1.2.4 免疫熒光檢測心肌細(xì)胞表面積 在細(xì)胞培養(yǎng)皿中放入玻片，將心肌細(xì)胞接種在玻片上，心肌細(xì)胞分別給予PE(100 μmol·L-1)處理或過表達Nampt 24 h之后，棄培養(yǎng)基，冷PBS緩沖液洗3次，并用4%多聚甲醛室溫固定15～30 min，在PBS緩沖液中加入0.1%羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(Rhodamine-phalloidin)和0.1% saponin，充分混勻后加入培養(yǎng)皿中，室溫靜置1 h(避光)；用含有0.1% saponin的PBS緩沖液洗細(xì)胞3次，每次5 min，在載玻片上滴加一小滴含DAPI的封片劑，取出蓋玻片，并吸干水分使其倒扣在載玻片上，當(dāng)封片劑分布均勻后，在蓋玻片四周涂上指甲油，4℃過夜，用激光共聚焦顯微鏡對其進行觀察，每次實驗過程中，各組隨機選取7個視野，每個視野包含5～10個心肌細(xì)胞，該實驗重復(fù)3次，測量35～70個細(xì)胞的表面積，利用Image J圖像分析軟件計算細(xì)胞表面積，并分析計算結(jié)果。1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測NF-κB依賴的轉(zhuǎn)錄活性 心肌細(xì)胞按5×104/cm2密度接種于96孔板中，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染PGL4.32-NF-κB-RE-luc2P質(zhì)粒和作為內(nèi)參使用的PRL-TK載體，細(xì)胞于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育6 h后換入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。按照Promega公司Dual-Luciferase Reporter Assay System說明書進行操作，加入 luciferase reagent充分混合均勻后，將待測液轉(zhuǎn)移入白色不透光的96孔板中，用Varioskan Flash型全波長掃描式多功能讀數(shù)儀(美國Thermo公司)測量可見光強度10 s(此時的熒光為PGL4.32-NF-κB-RE-luc2P載體轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生的螢火蟲luciferase發(fā)出)，在96孔板中加入Stop&Glo Reagent，混合均勻，用Varioskan Flash型全波長掃描式多功能讀數(shù)儀進一步測量可見光強度10 s(此時的熒光為內(nèi)參載體PRL-TK轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生的海腎luciferase發(fā)出)，將所得的數(shù)值，以海腎luciferase為參照進行標(biāo)準(zhǔn)化，計算均值，統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 過表達Nampt對Nampt mRNA和蛋白水平的影響 為了驗證過表達EGFP-Nampt是否成功，我們分別利用Real-time PCR和Western blot的方法檢測轉(zhuǎn)染EGFP-Nampt和空載體質(zhì)粒之后Nampt的mRNA和蛋白表達變化。如Fig 1所示，與轉(zhuǎn)染空載體組(Vector)相比，EGFP-Nampt組Nampt的mRNA和蛋白水平明顯升高。

2.2 過表達Nampt對肥大基因表達的影響 為了探討過表達Nampt對心肌細(xì)胞肥大的影響，我們在原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染了EGFP-Nampt和空載體質(zhì)?；蚪o予PE(100 μmol·L-1)處理，24 h之后分別檢測了ANP和BNP的表達情況。如Fig 2所示，我們發(fā)現(xiàn)PE處理心肌細(xì)胞24 h可明顯增加ANP和BNP的表達，而過表達EGFP-Nampt能夠模擬PE的作用誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，過表達空載體質(zhì)粒則無此效應(yīng)。

Fig 1 EGFP-Nampt transiently

Cardiomyocytes were transfected with Nampt. A: the mRNA expression of Nampt was detected by Real-time PCR; B: the protein expression of Nampt was measured by Western blot.*P<0.05vsvector group

Fig 2 The mRNA expression of ANP and BNP in

The cardiomyocytes were transfected with EGFP-Nampt or treated with 100 μmol·L-1PE for 24 h. A，B: the mRNA expression of ANP and BNP were detected by Real-time PCR.*P<0.05vscontrol group

2.3 過表達Nampt對心肌細(xì)胞表面積的影響 為了進一步明確Nampt在心肌細(xì)胞肥大中的功能，我們在轉(zhuǎn)染了EGFP-Nampt和空載體質(zhì)粒或給予PE處理24 h之后進一步檢測了心肌細(xì)胞表面積。如Fig 3所示，在心肌細(xì)胞中PE可明顯增大心肌細(xì)胞表面積，而過表達EGFP-Nampt能夠模擬PE的作用增加心肌細(xì)胞表面積，過表達空載體質(zhì)粒則無此效應(yīng)。

Fig 3 The cell-surface area in cardiomyocytes transfected with EGFP-Nampt

The cardiomyocytes were transfected with EGFP-Nampt or treated with 100 μmol·L-1PE for 24 h. A-B: the cell-surface area was measured.*P<0.05vscontrol group

2.4 過表達Nampt對NF-κB依賴的轉(zhuǎn)錄活性的影響 NF-κB作為一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，激活后能夠調(diào)控下游與心肌肥大相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄[9]。為了研究過表達Nampt誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的分子機制，我們將含有NF-κB結(jié)合位點的PGL4.32-NF-κB-RE-luc2P質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒PRL-TK共轉(zhuǎn)染入心肌細(xì)胞，如Fig 4所示，給予心肌細(xì)胞PE處理24 h后NF-κB依賴性轉(zhuǎn)錄活性明顯增加，過表達EGFP-Nampt質(zhì)粒也能夠增加NF-κB依賴性轉(zhuǎn)錄活性，而過表達空載體質(zhì)粒則無此效應(yīng)。

2.5 沉默NF-κB對過表達Nampt所致心肌細(xì)胞肥大的影響 為了進一步探討NF-κB在Nampt調(diào)控心肌肥大中的作用，我們在心肌細(xì)胞中，檢測特異性沉默NF-κB的p65亞基之后，過表達Nampt對肥大基因表達和心肌細(xì)胞表面積的影響。結(jié)果如Fig 5所示，在心肌細(xì)胞中沉默NF-κB的p65亞基能夠取消Nampt對肥大基因和心肌細(xì)胞表面積的影響。

Fig 4 The NF-κB-dependent transcription activity in

The cardiomyocytes were transfected with EGFP-Nampt or treated with 100 μmol·L-1PE for 24 h. The NF-κB-dependent transcription activity was measured by luciferase reporter gene assays.*P<0.05 vs control group

3 討論

Nampt是NAD生物合成的限速酶，研究表明Nampt具有促血管新生、抗細(xì)胞凋亡、參與機體炎癥應(yīng)答、促進多種細(xì)胞增殖分化成熟等生理功能, 對許多疾病如糖尿病、癌癥、自身免疫性疾病等有潛在的作用[10-11]。近年來，大量研究證明Nampt與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在冠狀動脈不穩(wěn)定粥樣硬化患者的頸動脈斑塊和急性心肌梗死病人破裂斑塊中Nampt表達明顯增加[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)Nampt能夠增強MMP-2和MMP-9的酶活性，而MMP可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，使纖維帽變薄，導(dǎo)致斑塊破裂，提示Nampt在動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定中起重要作用[13]。此外，Nampt抑制劑APO866治療心肌梗死可以減少梗死面積、中性粒細(xì)胞浸潤和在心肌缺血再灌注損傷中小鼠模型體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生[14]。因此，Nampt 藥理抑制劑作為一種有效的治療藥物，可以減少心肌梗死氧化介導(dǎo)的組織損傷。柴雅琴等[15]的研究還發(fā)現(xiàn)Nampt在妊娠高血壓綜合征產(chǎn)婦胎盤組織中高表達，且二者的表達水平呈明顯正相關(guān)，提示其與妊娠期高血壓密切相關(guān)。Schutte 等[16]認(rèn)為Nampt可能通過炎癥反應(yīng)、血管收縮等作用于心血管系統(tǒng)疾病。以上結(jié)果提示Nampt對動脈粥樣硬化、心肌梗死、妊娠高血壓等心血管疾病具有重要的調(diào)節(jié)作用，但Nampt能否影響心肌細(xì)胞肥大，目前國內(nèi)外少有報道。在本課題中，我們發(fā)現(xiàn)過表達Nampt能夠模擬PE的作用誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，提示Nampt可能是一個潛在的防治心肌肥大的藥物作用靶點。

Nampt調(diào)控心肌細(xì)胞肥大的分子機制尚不清楚，值得進一步研究。臨床研究顯示Nampt的濃度在慢性炎癥性疾病中明顯增加[17]，提示Nampt與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。NF-κB是細(xì)胞內(nèi)非常重要的核轉(zhuǎn)錄因子，不僅直接調(diào)控參與免疫炎癥相關(guān)基因的表達，而且也調(diào)節(jié)與促炎性細(xì)胞因子、趨化因子的產(chǎn)生、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[18]。近年來的研究提示，心肌細(xì)胞肥大的過程中需要NF-κB的激活，抑制心肌細(xì)胞肥大性反應(yīng)與降低NF-κB活性呈正相關(guān)[19-20]。在心肌組織中，NF-κB可被多種引起心肌肥厚的刺激因子活化引起心肌細(xì)胞肥大，它的過表達還可啟動 ANP、BNP的表達[21]。此外，NF-κB還可以與MAPK等其他導(dǎo)致肥厚的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間交互作用，共同促進心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展[22]。以上結(jié)果提示NF-κB在心肌肥大的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。那么NF-κB是否參與了Nampt對心肌肥大的調(diào)控作用呢？為了解決這個問題，我們檢測了過表達Nampt對NF-κB依賴性轉(zhuǎn)錄活性的影響，發(fā)現(xiàn)過表達Nampt能夠增加NF-κB依賴性轉(zhuǎn)錄活性，進一步的研究表明沉默NF-κB的p65亞基能夠明顯逆轉(zhuǎn)過表達Nampt誘導(dǎo)心肌肥大的效應(yīng)，提示NF-κB信號通路參與了Nampt對心肌細(xì)胞肥大的調(diào)控作用。然而，在本文中我們也發(fā)現(xiàn)沉默NF-κB并不能完全阻斷Nampt的作用，Nampt還可能通過其它途徑發(fā)揮調(diào)控心肌細(xì)胞肥大的作用。研究表明作為NAD合成的關(guān)鍵酶，Nampt與酶活性依賴于NAD的沉默信息調(diào)節(jié)因子2(silent information regulator 2, Sir2)家族成員關(guān)系密切，Nampt可通過調(diào)控NAD的合成影響SIRT1的活性進而調(diào)節(jié)SIRT1下游通路[23]。此外，Nampt還被報道參與調(diào)控AKT及MAPK等信號通路[24]，這些通路在Nampt調(diào)控心肌肥大中的作用尚需我們進一步探討。

綜上所述，在本課題中我們發(fā)現(xiàn)過表達Nampt能夠模擬PE的作用誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，且其機制與NF-κB依賴性轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)。今后的工作中，我們將通過腺病毒心室壁注射的方式在整體動物水平干預(yù)Nampt，進一步在體內(nèi)明確Nampt對心肌肥大的調(diào)控作用，并深入探索Nampt調(diào)控NF-κB的具體分子機制以及Nampt調(diào)控心肌肥大的其它信號通路，為確定心肌肥大治療的新靶點提供初步的實驗數(shù)據(jù)。

Cardiomyocytes overexpressed with Nampt after transfection with si-p65 were treated with PE for 24 h. A-B: the protein expression of p65 was measured by Western blot; C-D: the mRNA expression of ANP and BNP were detected by Real-time PCR; E-F: the cell-surface area was measured.*P<0.05 vs control group,#P<0.05vsNampt group.

(致謝：本實驗在廣州醫(yī)科大學(xué)藥物研發(fā)中心和醫(yī)學(xué)實驗中心完成，非常感謝藥物研發(fā)中心和醫(yī)學(xué)實驗中心的各位老師在實驗技術(shù)上的幫助。)

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Overexpression of Nampt induced cardiac hypertrophy by activating NF-κB

CAI Yi, HUANG Jun-jun, LIU Xia-wen, HUANG Bi-yun, ZHU Liu ,WU Bo

(CenterofPharmaceuticalResearchandDevelopment,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511436,China)

Aim To examine the effect of Nampt overexpression on cardiac hypertrophy, and elucidate the role of NF-κB. Methods The cultured neonatal cardiomyocytes were pretreated with 100 μmol·L-1PE or transfected with Nampt. The mRNA and protein expression of Nampt were determined by Real-time PCR and Western blot respectively. The cardiomyocyte hypertrophy was monitored by measuring cell-surface area and the mRNA levels of ANP and BNP, which were biomarkers of hypertrophic response. Moreover, we te- sted the effects of Nampt on NF-κB-dependent transcription activity through luciferase reporter gene assays. Results Nampt overexpression significantly increased cardiomyocyte surface area and the mRNA expression of ANP and BNP. In addition, Nampt overexpression could markedly increase NF-κB-dependent transcription activity. Moreover, when p65 was knocked down, cardiomyocytes with Nampt overexpression could not induce cardiac hypertrophy. Conclusion Overexpression of Nampt induces cardiac hypertrophy by increasing NF-κB-dependent transcription activity.

Nampt; cardiac hypertrophy; NF-κB; PE; ANP; BNP

時間：2016-12-27 16:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161227.1613.014.html

2016-09-05，

2016-11-15

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81300085)；廣州市科技計劃-科學(xué)研究專項(No 201510010179)；廣東省科技計劃項目-廣東省高科技發(fā)展專項項目(No 2013B010403024)；廣州市屬高?？蒲杏媱濏椖?No 1201430926，1201410511)

蔡軼(1984-)，男，博士，助理研究員，研究方向：心血管藥理學(xué),Tel:020-37104150，E-mail:yicaisysu@163.com; 吳 波(1971-)，男，博士，研究員，研究方向：天然藥物化學(xué)，通訊作者,Tel:020-37103258，E-mail:gykyc@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.01.007

A

1001-1978(2017)01-0033-07

R-332；R322.11；R345.54；R542.2；R977.3；R977.6