張 軍，谷 翔，黃問銀，張普華，殷嫦嫦 ,于 歡，張義平，王麗麗，李衛(wèi)東

(1. 九江學院附屬醫(yī)院心內(nèi)科, 江西 九江 332000；2. 南昌大學研究生院醫(yī)學部, 江西 南昌 330006；3. 九江學院基礎(chǔ)醫(yī)學院,江西 九江 332000)

GLP-1對AGEs誘導H9C2心肌細胞凋亡的保護作用研究

張 軍1,2，谷 翔1，黃問銀1，張普華1，殷嫦嫦3,于 歡3，張義平3，王麗麗3，李衛(wèi)東3

(1. 九江學院附屬醫(yī)院心內(nèi)科, 江西 九江 332000；2. 南昌大學研究生院醫(yī)學部, 江西 南昌 330006；3. 九江學院基礎(chǔ)醫(yī)學院,江西 九江 332000)

目的 研究胰高血糖素樣肽素-1(glucogon like pep tide-1，GLP-1)對晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)誘導H9C2心肌細胞凋亡的保護作用機制。方法 體外培養(yǎng)H9C2細胞，實驗分為4組:正常對照組、100 mg·L-1AGEs試驗組、AGEs(100 mg·L-1)+GLP-1(10 nmol·L-1)組、 AGEs(100 mg·L-1)+NAC(5 mmol·L-1)組，處理24 h。通過CCK-8比色法檢測細胞存活率，相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，雙氯熒光素(DCFH-DA)染色熒光顯微鏡攝片觀察細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平；RT-PCR法測定Bax、Bcl-2 mRNA基因的表達；運用Hoechst 33258檢測試劑盒及流式細胞術(shù)檢測心肌細胞的凋亡率，Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達量。結(jié)果 與正常組相比，100 mg·L-1AGEs組降低H9C2細胞生存率，活性氧(ROS)生成量增加；與 AGEs 組相比，AGEs+GLP-1組細胞生成率提高，活性氧(ROS)生成量減少。與正常組相比，AGEs組促凋亡蛋白Bax表達增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2減少,細胞凋亡率升高；AGEs+GLP-1組較AGEs組下調(diào)促凋亡蛋白Bax，上調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2,細胞凋亡率減少。結(jié)論 GLP-1對AGEs誘導的心肌細胞凋亡具有保護作用，其保護機制與減少活性氧(ROS)有關(guān)。

胰高血糖素樣肽素-1； 糖基化終產(chǎn)物；活性氧； H9C2心肌細胞； 凋亡； 心肌保護；機制

大量研究表明晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end proudct, AGEs)在糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[1-2],AGEs是機體在長期高糖狀態(tài)時蛋白質(zhì)和還原糖之間經(jīng)過非酶性糖基化反應(yīng)生成的物質(zhì)；AGEs誘導心肌氧化應(yīng)激，活性氧形成，進而導致細胞損傷、甚至凋亡。因此，發(fā)現(xiàn)抑制AGEs誘導心肌氧化應(yīng)激并對其損傷性小的藥物尤為關(guān)鍵。

越來越多的研究證實,過多活性氧在心血管疾病發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。如：動脈粥樣硬化、心力衰竭[3-4]等。另外心力衰竭、心肌病等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展與心肌細胞凋亡現(xiàn)象有關(guān)。心肌細胞凋亡是心肌缺血損傷機制中的一個重要環(huán)節(jié),是引發(fā)心力衰竭的重要誘因; 其中活性氧 ( ROS) 介導的氧化應(yīng)激在心肌細胞凋亡的病理過程中發(fā)揮了重要的作用[5-6]。

胰高血糖素樣肽-1(glucogen like peptide-1,GLP-1)是機體中一種具有“腸促胰素效應(yīng)”的腸源性激素，在發(fā)揮綜合降糖作用外，GLP-1對心血管系統(tǒng)也有保護作用；在血管內(nèi)皮細胞中GLP-1能降低RAGE表達，阻斷AGEs/RAGE軸造成的細胞損害[7-8]；同時發(fā)現(xiàn)GLP-1也可減少急性冠脈綜合征患者心肌梗死面積[9-10]。但 GLP-1對AGEs誘導的H9C2心肌細胞損傷的作用未見報道。本實驗通過建立AGEs誘導H9C2心肌細胞損傷模型，探討GLP-1對AGEs誘導H9C2心肌細胞損傷性保護作用及其可能機制。為GLP-1臨床上有效治療糖尿病心血管并發(fā)癥提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 H9C2大鼠心肌細胞株由南昌大學第二附屬醫(yī)院實驗室細胞庫惠贈。AGEs (121800，Calbiochem,美國)，DMEM-F12培養(yǎng)基( Hyclone公司，美國), 胎牛血清(BI公司，以色列)，GLP-1(Sigma公司,美國)，Hoechst 33258試劑盒購自南京建成生物工程研究所，N-acety-L-cysteine( NAC)、活性氧檢測試劑盒、細胞計數(shù)CCK-8試劑盒均購于碧云天生物技術(shù)研究所，細胞凋亡檢測試劑盒AnnexinV-FITC/PIKit(北京莊盟)，兔抗老鼠GAPDH(10494-1-AP，Peprotech公司產(chǎn)品，美國)，Bax、Bcl-2(12789-1-AP) 多克隆抗體為Peprotech公司產(chǎn)品，CDI-165M 三氣細胞培養(yǎng)箱、BIO-BEST200E凝膠成像系統(tǒng)(SIM公司)，TS100-F倒置相差顯微鏡(Nikon公司,日本), 超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，冷凍高速離心機( 珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司)，水平電泳儀( 北京六一儀器廠)，PCR儀(BIO-RAD公司)，BDFACSCalibur流式細胞儀( BD公司，美國)

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與處理 H9C2細胞培養(yǎng)于含體積分數(shù)為0.15胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液，37 ℃、CO2體積分數(shù)0.05、飽和濕度條件下培養(yǎng)。細胞貼壁80%以上時,0.25%胰酶消化、計數(shù)、傳代,每3～4 d傳代1次。取接種對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞成活率 取對數(shù)生長期細胞，以2×107·L-1細胞濃度接種96孔板，各實驗組設(shè)4個復(fù)孔，另設(shè)無細胞培養(yǎng)液孔為空白對照。根據(jù)CCK-8試劑盒說明書,處理結(jié)束后每孔加入10μL CCK-8工作液。37 ℃培養(yǎng)2 h，酶標儀( El×800，BioTek，USA) 記錄 450 nm波長處的吸光度。取4孔光密度( optical density，OD) 的平均值，按下列公式計算細胞存活率:生存率/% = (OD處理組-OD空白組)/(OD對照組-OD 空白組)×100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 細胞內(nèi)ROS 水平的測定 根據(jù)實驗需要給予相應(yīng)的處理：(1) 實驗對照組； (2)100 mg·L-1AGEs處理24 h； (3) 10 nmol·L-1GLP-1與100 mg·L-1AGEs處理24 h； (4) 抗氧化劑(NAC)與100 mg·L-1AGEs處理24 h。均包括3個復(fù)孔。處理完成后，用PBS漂洗6孔板2次，用10 μmol·L-1DCFH-DA 染液于37 ℃孵育20 min。在熒光顯微鏡下隨機選取5個不重復(fù)區(qū)攝片，用 Image J 1.410 軟件分析4個視野綠色熒光強度的平均值，再對每組的各樣本進行統(tǒng)計分析。

1.2.4 Hoechst 33258核染色法檢測心肌細胞凋亡 H9C2心肌細胞經(jīng)不同因素處理后,小心棄去培養(yǎng)基，PBS洗1遍，4%多聚甲醛固定10 min，PBS 漂洗后，加入5 mg·L-1Hoechst 33258 試劑，室溫輕搖30 min。在熒光顯微鏡 ( BX50-FLA,Olympus,Japan)下攝片,染色質(zhì)均勻分布,核被染成均勻藍色的細胞認為是正常細胞，核呈濃縮、碎裂的明亮藍色細胞認為是凋亡細胞，隨機選取視野在熒光顯微鏡下攝片。

1.2.5 RT-PCR檢測凋亡相關(guān)基因 Bax、Bcl-2 mRNA的表達 將H9C2細胞按1×106/孔接種于6孔板中，實驗分組同上，刺激細胞24h后，按RNA快速提取試劑盒說明書提取各組細胞總RNA,采用兩步法RT-PCR:以O(shè)lig(dT)為引物，以M-MLV反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，0.01瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性再行 PCR擴增，PCR反應(yīng)體系: cDNA 0.5 μL，上下游引物各1 μL，Mix 12.5 μL，ddH2O 10 μL，總體積25 μL。擴增產(chǎn)物采用0.01瓊脂糖凝膠電泳25～30 min，凝膠成像系統(tǒng)照相，Image J軟件進行灰度分析。如 Table1所示

Tab 1 Primer sequences and products

1.2.6 Western blot 測定 Bax、Bcl-2 蛋白表達 收集H9C2 細胞，預(yù)冷的 PBS 洗滌3次，RIPA全細胞裂解液冰上裂解30 min，離心取上清，BCA 法進行蛋白定量。每孔蛋白上樣量 30 μg，在0.1聚丙烯酰胺凝膠( SDS-PAGE)中進行電泳70V，電泳15-20 min，待指示劑到濃縮膠與分離膠交界處后，改為 120V 繼續(xù)電泳，直至溴酚藍完全到凝膠底部停止電泳。置于電轉(zhuǎn)液中，在250 mA恒定電流下將蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上。50 g·L-1脫脂奶粉封閉1 h，Bax、Bcl-2一抗( 1 ∶1000 稀釋)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次。二抗室溫孵育1 h，漂洗3次,ECL顯色。用ECL 檢測液發(fā)光顯影定影后，用Image J軟件進行灰度分析。

1.2.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集H9C2 細胞，預(yù)冷的PBS洗2次,每次均需300 g,4℃離心 5 min,加入100 μL 1× Binding buffer 重懸細胞。再加入5 μL Annexin V-FITC 和 PI Staining solution,輕輕混勻。避光，室溫反應(yīng)10 min。后再加入400 μL 1× Binding buffer 混勻，樣品在1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)學觀察 倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn): 正常 H9C2細胞呈梭形，排列規(guī)整，大小均一,胞核、胞質(zhì)境界清楚。AGEs 損傷組細胞大小不規(guī)則，胞體變圓、皺縮。胞核增大，胞質(zhì)有空泡出現(xiàn)。AGEs+GLP-1組細胞大小較為均一，形態(tài)趨向正常，細胞皺縮變形和胞質(zhì)空泡化減少。

Fig 1 Cellular morphology observation(×100)

A:Control group; B: AGEs group; C:AGEs+GLP-1 (10 nmol·L-1) group;D:AGEs+NAC (5 mmol·L-1) group

2.2 GLP-1處理提高H9C2細胞生成率 用CCK-8法測定細胞生成率，如Tab 2示：根據(jù)不同濃度預(yù)實驗結(jié)果并參考文獻[11-12],以100 mg·L-1AGEs 處理24h建立H9C2損傷模型，正常對照組,100 mg·L-1AGEs，AGEs+GLP-1 (10 nmol·L-1), AGEs+NAC(5mmol·L-1)處理24 h。結(jié)果顯示100 mg·L-1處理細胞生成率明顯降低，而AGEs+GLP-1組的細胞生成率升高。

GroupCellviability(%ofcontrol)NormalControl93．37±3．73100mg·L-1AGEs70．16±1．98##100mg·L-1AGEs+10nmol·L-1GLP?180．66±1．78?100mg·L-1AGEs+5mmol·L-1NAC79．11±2．28?

##P<0.01vscontrol group ;*P<0.05vs100 mg·L-1AGEs group

2.3 GLP-1處理抑制AGEs誘導的ROS Fig 2顯示, 正常心肌細胞內(nèi)存在少量的ROS，100 mg·L-1AGEs處理H9C2心肌細胞24 h使胞內(nèi)ROS水平明顯增多,與對照組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。10 nmol·L-1GLP-1與100 mg·L-1AGEs共培養(yǎng)24 h能明顯地抑制 AGEs 誘導的ROS，使胞內(nèi)ROS 明顯減少(P<0.05)。

2.4 GLP-1抑制 AGEs 誘導的心肌細胞凋亡 Fig 3顯示,與正常組比較，100 mg·L-1AGEs處理H9C2心肌細胞24h能使凋亡H9C2細胞數(shù)量明顯增多;與100 mg·L-1AGEs組損傷相比，100 mg·L-1AGEs+10 nmol·L-1GLP-1、100 mg·L-1+5 mmol·L-1NAC mg·L-1組對細胞凋亡有抑制作用，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05) 。

2.5 GLP-1抑制促凋亡Bax mRNA的表達,增加抑凋亡Bcl-2 mRNA的表達 Fig 4顯示，與正常組相比較，100 mg·L-1AGEs處理24 h，促凋亡蛋Bax含量增加;抑凋亡蛋白Bcl-2含量則減少;GLP-1處理可以抑制上述改變。與AGEs損傷組比較,GLP-1+AGEs處理組使Bax mRNA減少，Bcl-2 mRNA 增加。2.6 運用流式細胞儀檢測:GLP-1減少AGEs誘導的H9C2心肌細胞凋亡 Fig 5顯示，正常組凋亡率為3.73%，100 mg·L-1AGEs處理細胞凋亡率明顯增加,而100 mg·L-1AGEs+10 nmol·L-1GLP-1組、100 mg·L-1AGEs+5 mmol·L-1NAC組處理24 h可明顯地減少凋亡細胞的數(shù)量；與AGEs組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

Fig 2 Effect of GLP-1 on AGEs-induced

A、B：Fluorescence intensity of ROS production in H9C2 cells in different groups under inverted fluorescence microscope.##P<0.01vscontrol;*P<0.05vsAGEs

2.7 Western blot檢測各組凋亡相關(guān)蛋白Bax,Bcl-2表達 細胞發(fā)生凋亡時，促凋亡蛋白Bax增加，而抑制凋亡蛋白Bcl-2減少。Western blot檢測結(jié)果如Fig 6,與對照組相比，AGEs組的Bax上調(diào)及Bcl-2下調(diào)。與AGEs組相比，AGEs+GLP-1組，AGEs+NAC組的Bax表達量均下調(diào)，而抑制凋亡Bcl-2均上調(diào)。與AGEs+GLP-1組相比，AGEs+NAC組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

A、B：Show that the apoptotic rate of each group H9C2 was determined by fluorescence microscope.##P<0.01vscontrol;*P<0.05vsAGEs

3 討論

越來越多的實驗證實AGEs在糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[2-3]，AGEs在心肌細胞代謝過程中，產(chǎn)生大量內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)，造成心肌細胞過氧化，引發(fā)一系列的病理生理變化；AGEs 激活細胞凋亡通路，從而導致細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)：凋亡造成心肌細胞丟失，與AGEs引起的的心肌能量代謝和心功能衰竭關(guān)系密切[13-14]。通過CCK-8活力比較,選用100 mg·L-1AGEs建立體外H9C2心肌損傷模型。AGEs對心肌細胞的損傷具有濃度依賴性，Hoechst 33258及流式細胞儀檢測其細胞凋亡率明顯增加；以上結(jié)果證明，本研究成功復(fù)制了心肌細胞體外損傷模型。

GLP-1是由腸道L細胞分泌的一種重要的腸促胰島素；具有一定的抗炎、抑制ROS產(chǎn)生、抗氧化、減少細胞凋亡、發(fā)揮對血管內(nèi)皮細胞的保護作用[9-10,15-16]。在心肌細胞凋亡機制研究中, 目前有3條凋亡途徑:死亡受體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和線粒體凋亡途徑[17]。其中線粒體凋亡通路是主要的途徑[18]，Bax是Bcl-2家族的促凋亡蛋白，細胞受到損傷時，大量的細胞內(nèi)信號引起前凋亡蛋白Bax的活化，Bax轉(zhuǎn)位到線粒體表面，增加線粒體通透性，導致細胞色素C外漏，從而激活線粒體細胞凋亡途徑[19]，形成凋亡小體。然而，此凋亡途徑可被Bcl-2等蛋白凋亡抑制因子所調(diào)控[20-21]，Bcl-2可與Bax形成異源二聚體，阻止Bax 向線粒體移位，減少線粒體通透性，抑制Bax 的促凋亡作用。因此，兩者在線粒體凋亡途徑中起到重要的調(diào)節(jié)作用[22]。

Fig 4 Effect of GLP-1 on anti-apoptotic Bcl-2 and

B、C：##P<0.01vscontrol;#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsAGEsl

本研究首先檢測了Bax和Bcl-2的表達變化,研究表明GLP-1 對細胞凋亡的抑制是否與Bcl-2 的上調(diào)和 Bax 的下調(diào)有關(guān)。Western blot 實驗表明，與正常組相比，AGEs組的促凋亡蛋白Bax表達量明顯增加，而抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達量減少;而與AGEs組相比，AGEs+GLP-1組下調(diào)促凋亡蛋白Bax表達，上調(diào)抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達。本研究結(jié)果說明, GLP-1可能通過調(diào)控 Bax 和 Bcl-2 蛋白的表達而緩解氧化損傷。

##P<0.01vscontrol;*P<0.05vsAGEs

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示, GLP-1作用后, AGEs所導致的 H9C2 細胞凋亡率減少；AGEs損傷組細胞 DCFH-DA 熒光強度水平升高，DCFH-DA 是活性氧的指示劑，細胞氧化應(yīng)激時，ROS產(chǎn)生增加；GLP-1處理使 DCF-DA 熒光強度水平降低，說明GLP-1 可以清除活性氧，減輕心肌脂質(zhì)過氧化，對抗 AGEs引起的氧化應(yīng)激，減輕細胞損傷。結(jié)果說明 GLP-1可能通過調(diào)控細胞氧化還原系統(tǒng), 減少 AGEs 引起的ROS 過量堆積, 進而保護心肌細胞。

綜上所述, GLP-1拮抗AGEs誘導心肌細胞氧化損傷所導致的凋亡作用, 且能通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白發(fā)揮對心肌細胞保護作用。上述實驗結(jié)果對 GLP-1 抗氧化研究、防治糖尿病心血管并發(fā)癥等疾病具有重要意義。

Fig 6 Effect of GLP-1 on anti-apoptotic

B、C：Show that the protein expression of each group H9C2 was determined by Western blot.#P<0.05,##P<0.01vscontrol;*P<0.05 ,**P<0.01vsAGEs group

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Protective effect of GLP-1 against AGEs-induced H9C2 myocardial cell apoptosis

ZHANG Jun1，2,GU Xiang1,HUANG Wen-yin1, ZHANG Pu-hua1,YING Chang-chang3, YU Huan3ZHANG Yi-ping3, WANG Li-li3, LI Wei-dong3

(1.DeptofCardiology,JiujiangUniversityHospital,JiujangJiangxi332000,China,2.DeptofMedicine,GraduateSchool,NanchangUniversity,Nanchang330006China, 3.BasicMedicalCollege,JiujiangUniversity,JiujiangJiangxi332000,China)

Aim To investigate the protective effect of Glucogon like pep tide-1(GLP-1 ) on H9C2 cardiomyocytes against AGEs-induced apoptosis and the potential molecular mechanisms. Methods H9C2 cardiomyocytes cells culturedinvitrowere divided into the following groups: normal control group,100 mg·L-1AGEs group,100 mg·L-1AGEs+10 nmol·L-1GLP-1 group,100 mg·L-1AGEs+5 mmol·L-1N-acetylcysteine (NAC) group. Cell viabillity rate was measured by CCK-8 assay,ROS production was measured by DCFH-DA fluorescent probe;Cells in different groups were stained with Annexin V-FITC/PI and then apoptotic rate was detected by flow cytometry;Nucleus morphology was observed under fluorescence microscope after being incubated with Honchest 33258;Bax, Bcl-2 mRNA gene expression was measured using RT-PCR;Western blot was applied to assess the apoptotic components expression including Bax and Bcl-2. Result Compared with control group,cell viability rate in AGEs group was decreased in a dose-dependent manner;cell apoptosis and ROS production in H9C2 cells were remarkably increased in AGEs group. However,compared with AGEs group,GLP-1 reduced ROS production and ameliorated cell apoptosis caused by AGEs;the expression of pro-apototic proteins Bax was decreased,the expression of anti-apoptotic proteins like Bcl-2 was increased. Conclusion GLP-1 protects H9C2 cardiomyocytes against AGEs-induced apoptosis,which may be related to the reduction of the active oxygen (ROS).

GLP-1; AGEs; ROS; H9C2 cardiomyocytes; apoptosis; myocardial preservation; mechanism

時間：2016-12-27 16:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161227.1613.042.html

2016-07-05，

2016-10-14

國家自然科學青年基金資助項目(No 81000075);江西省教育廳科技課題資助項目(No GJJ09350)

張 軍(1989-)，男，碩士生，醫(yī)師，研究方向：糖尿病心肌病發(fā)病機制，E-mail：15079265586@163.com； 谷 翔(1967-)，男，博士，主任醫(yī)師，教授，碩士生導師，研究方向：糖尿病心肌病、心肌缺血/再灌注的發(fā)病機制，通訊作者，E-mail：eagle0094@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.01.021

A

1001-1978(2017)01-0120-07

R-332；R322.11；R329.25；R587.2；R977.6