豬肉脂肪氧化酶在高壓結(jié)合熱處理過程中失活動力學(xué)模型

黃業(yè)傳，李 鳳，吳照民

豬肉脂肪氧化酶在高壓結(jié)合熱處理過程中失活動力學(xué)模型

黃業(yè)傳，李 鳳，吳照民

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010）

為了解豬肉高壓加工過程中脂肪氧化酶（lipoxygenase，LOX）活性的變化規(guī)律，以豬背最長肌為原料，經(jīng)不同壓力（200～700 MPa）、溫度（20～60 ℃）結(jié)合處理后，研究LOX失活常數(shù)的變化規(guī)律，并分別用Arrhenius和Eyring方程為基礎(chǔ)來建立LOX失活的動力學(xué)模型。結(jié)果表明，當處理溫度不變時，失活常數(shù)隨壓力的增加而增加；同樣，當處理壓力不變時，失活常數(shù)隨溫度升高而增加。Arrhenius和Eyring方程分別適用于整個研究的溫度區(qū)間和壓力區(qū)間，分別以兩者為基礎(chǔ)可以建立LOX失活的動力學(xué)方程，兩個方程的擬合程度均較高，決定系數(shù)分別達到0.989和0.965。因此在一定的處理溫度（20～60 ℃）和壓力（200～700 MPa）范圍內(nèi)，豬肉高壓結(jié)合熱處理過程中LOX活性的變化可以用以Arrhenius和Eyring方程為基礎(chǔ)建立的數(shù)學(xué)模型進行預(yù)測。

豬肉；高壓；熱處理；脂肪氧化酶；動力學(xué)模型

脂肪氧化酶（lipoxygenase，LOX，EC 1.13.11.12）是一類含非血紅素鐵的酶，能專一催化多不飽和脂肪酸中具有順,順-1,4-戊二烯結(jié)構(gòu)的脂肪酸，產(chǎn)生一系列脂肪酸氫過氧化物，這些氫過氧化物進一步分解會形成一些小分子化合物，如醇類、醛類、酮類等，部分小分子化合物會構(gòu)成食品中的揮發(fā)性風味成分[1]。LOX廣泛存在于各種植物、動物及微生物中，然而當前大多數(shù)研究都集中于植物特別是豆類中的LOX，對動物制品中的LOX研究較少且大都集中于LOX的分離純化和部分特性研究[2-6]。LOX對動物制品的品質(zhì)非常重要，一方面，其催化產(chǎn)生的一些小分子化合物對動物制品風味有重要貢獻；另一方面，如果這些小分子化合物特別是醛類在產(chǎn)品中濃度超過一定限值后又會對動物制品風味產(chǎn)生負面作用[1]，因此動物制品加工中如何調(diào)控LOX活性使其有利于產(chǎn)品風味是一個重要研究課題。

作為一種最新的食品加工技術(shù)，超高壓技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品加工中。相對于傳統(tǒng)熱處理殺菌技術(shù)，高壓技術(shù)作為一種冷殺菌技術(shù)可以在殺菌的同時最大程度地保留食品的色、香、味、形；此外高壓處理技術(shù)還能改善食品品質(zhì)，如嫩度、凝膠特性等[7-9]?，F(xiàn)在高壓技術(shù)在肉制品中的應(yīng)用主要與低溫熱處理（50～70 ℃）聯(lián)合應(yīng)用，因為一些耐壓芽孢菌在常溫進行處理時，高達1 000 MPa的壓力仍不能使其完全失活，而高壓結(jié)合一定溫度的熱處理則對這些芽孢菌有較好的殺滅效果。

肉制品高壓加工必然會影響到其中LOX的活性，由于LOX對肉制品品質(zhì)十分重要，因此很有必要研究肉中LOX在高壓處理過程中的變化規(guī)律及LOX對高壓加工肉制品品質(zhì)的作用。雖然前期研究了LOX在高壓促進肉中脂肪氧化過程中的初步作用[10]，但仍不明白其中的真正機理，為探究LOX在高壓加工肉制品中的真正作用，必須研究LOX在處理過程中的動力學(xué)變化規(guī)律?，F(xiàn)在一些學(xué)者研究了大豆[11-14]、綠豆[15-17]、番茄[18-19]等植物產(chǎn)品中LOX在高壓處理過程中的動力學(xué)變化規(guī)律，但肉制品在高壓處理中LOX的動力學(xué)變化規(guī)律鮮見報道。因此，本研究以豬肉為材料，探究不同壓力（200～700 MPa）、溫度（20～60 ℃）處理后，樣品規(guī)律中LOX的失活，并探索用Arrhenius和Eyring方程為基礎(chǔ)來建立LOX失活動力學(xué)模型的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白玉黑土豬，由四川綿陽天農(nóng)生態(tài)食品開發(fā)有限公司提供，宰殺后取3 頭豬的背最長肌，并去掉表面可見脂肪、筋膜和結(jié)締組織，用絞肉機絞碎，并裝入聚乙烯塑料袋中，每袋約20 g，真空包裝后于－18 ℃冷藏待用。

亞油酸 美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HPP.L2超高壓處理設(shè)備 天津華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；FSH-2A勻漿機 上海梅香儀器有限公司；5804R臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；U-3900H分光光度計 日本Hitachi公司；JYS-A800絞肉機 山東九陽電器有限公司；L-128型氮吹儀 北京來亨科貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

樣品先在4 ℃條件下解凍24 h，然后放進高壓設(shè)備的處理腔，按設(shè)定的溫度（20～60 ℃）、壓力（200～700 MPa）、時間（1～40 min）分別進行處理，高壓處理以癸二酸二辛酯為壓力傳遞介質(zhì)。其中，每個溫度和壓力的組合做5 個時間點，具體每個處理的5 個時間點根據(jù)預(yù)備實驗確定，比較劇烈的組合處理時間相對較短，反之時間較長，以使每個時間點處理后都能觀察到明顯的酶失活且又不完全失活以利于計算失活常數(shù)（如200 MPa、50 ℃的處理時間分別為1、2、3、4、5 min，而400 MPa、60 ℃的處理時間分別為20、25、30、35、40 min）。高壓處理后，馬上分析各處理樣品的LOX酶活力。對照樣為不經(jīng)過壓力處理的樣品，其LOX活力計為100%。

1.3.2 樣品中LOX的提取與活力測定

LOX的提取參照Jin Guofeng等[20]的方法。樣品經(jīng)不同處理后，稱取約5 g，加入4 倍體積50 mmol/L pH 7.4磷酸鈉緩沖溶液（含1 mmol/L二硫蘇糖醇和1 mmol/L乙二胺四乙酸），于冰浴中15 000 r/min勻漿15 s，重復(fù)3 次。經(jīng)4 層紗布過濾后，勻漿物在10 000×g、4 ℃條件下離心1 h，得到的上清液經(jīng)濾紙過濾后即為LOX粗酶液。

亞油酸底物溶液的制備參照Gata等[21]的方法。將140 mg亞油酸溶解在5 mL脫氧重蒸水（含180 μL吐溫20），用2 mol/L NaOH調(diào)整pH值至9.0，待亞油酸完全溶解后用脫氧重蒸水定容至50 mL，并于氮氣環(huán)境下貯藏待用。

將2.9 mL 50 mmol/L、pH 5.5的檸檬酸緩沖溶液與0.2 mL亞油酸底物溶液于20 ℃條件下快速混合均勻，當其在234 nm波長處吸光度穩(wěn)定后，加入0.1 mL酶溶液，迅速混合均勻后測定1 min內(nèi)在234 nm波長處吸光度的增加量。1 個LOX酶活力單位（U）定義為每分子每克蛋白質(zhì)中引起吸光度增加0.001的酶量。對照樣中包括0.2 mL亞油酸底物溶液和3.0 mL檸檬酸緩沖溶液。

1.3.3 LOX失活動力學(xué)研究

根據(jù)預(yù)備實驗和資料顯示[14]，在一定的溫度和壓力條件下，LOX失活速率常數(shù)K與高壓處理時間t滿足一階反應(yīng)動力學(xué)方程（1），對方程（1）進行積分得到方程（2）。

式中：t為高壓處理時間/min；A、A0分別為高壓處理時間為t和0時的樣品酶活力/U；K為酶的失活速率常數(shù)/min－1。

因此，利用SPSS的線性回歸程序，可從酶活力的自然對數(shù)ln（A/A0）與時間t的一次回歸直線斜率得到某一特定處理壓力和溫度條件下的LOX失活速率常數(shù)K。

Eyring方程（3）和Arrhenius方程（4）經(jīng)常分別用來評價壓力和溫度對反應(yīng)速率常數(shù)K的影響，因此在本實驗中也用來評定壓力和溫度對LOX失活常數(shù)的影響，具體影響程度用反應(yīng)活化體積（Va）和反應(yīng)活化能（Ea）來衡量。

式中：KrefT和KrefP分別為參考溫度和參考壓力條件下的失活速率常數(shù)/min－1；Va為反應(yīng)活化體積/（cm3/mol）；Ea為反應(yīng)活化能/（kJ/mol）；R為通用氣體常數(shù)（8.314 J/（mol·K））；T為溫度/K；Tref為參考溫度/K（本實驗中參考溫度設(shè)為40 ℃）；P為處理壓力/MPa；Pref為參考壓力/MPa（本實驗中參考壓力設(shè)為450 MPa）。

同樣，利用SPSS的線性回歸程序，在各溫度條件下，以lnK為因變量，（P－Pref）/RT為自變量作線性回歸分析，所得斜率即為各溫度條件下的Va，截距即為各溫度條件下的lnKrefP；在各壓力條件下，以lnK為因變量，（1/T－1/Tref）/R為自變量作線性回歸分析，所得斜率即為各壓力條件下的Ea，截距即為各壓力條件下的lnKrefT。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗重復(fù)測定3 次，采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行處理，實驗結(jié)果表示為±s。

2 結(jié)果與分析

2.1 LOX的失活常數(shù)

表1 豬肉中脂肪氧化酶不同處理壓力和溫度條件下的失活常數(shù)Table1 Inactivation rate constants of lipoxygenase in pork at different pressures and temperatures 10－2min－1

利用SPSS的線性回歸程序（方程（2））測得不同處理壓力和溫度條件下的失活常數(shù)。由表1可知，在某一特定溫度條件下，失活常數(shù)隨處理壓力的升高而增加，表明升高壓力可以加速LOX的失活，這與一些報道中的結(jié)果是一致的[13-14]。同樣，在某一特定壓力條件下，失活常數(shù)隨溫度的升高而增加，表明溫度的升高也可以加速LOX的失活。王韌[14]研究大豆中LOX的失活時，發(fā)現(xiàn)在特定壓力條件下（550～650 MPa），LOX的失活常數(shù)在10～20 ℃出現(xiàn)最小值，表明大豆中LOX在此溫度條件下具有最高壓力穩(wěn)定性，在此溫度條件下，增加或降低溫度都會加速LOX的失活。這與本研究的結(jié)論存在一定差異，可能與研究的溫度范圍有關(guān)，本實驗只研究了常溫（20℃）及以上的溫度，而前述報道中均研究了20 ℃以下的溫度，而他們得到的溫度臨界值也不超過20 ℃。本研究得到的豬肉中LOX失活常數(shù)總體上與一些研究者報道的豆類中LOX[13-15]的失活常數(shù)相當，說明豬肉和大豆中LOX在壓力結(jié)合一定溫度處理過程中穩(wěn)定性相當。

2.2 壓力對LOX失活常數(shù)的影響

表2 各溫度條件下脂肪氧化酶失活的反應(yīng)活化體積及參考壓力條件下（450 MPa）的失活常數(shù)Table2 Activation volume and inactivation rate constants at referenced pressure (450 MPa) of lipoxygenase at different temperatures

如前所述，LOX的失活常數(shù)在某一特定溫度條件下隨壓力的升高而增加，具體增加規(guī)律可用Eyring方程進行評價，利用SPSS的線性回歸程序（方程（3））可以求得各溫度條件下LOX的活化體積（Va）和參考壓力下（450 MPa）失活常數(shù)的自然對數(shù)lnKrefP。由表2可知，各溫度條件下活化體積均為負值，這也進一步說明在某一特定溫度條件下失活常數(shù)是隨壓力的升高而增加的?；罨w積的絕對值隨溫度的升高而增加，說明隨著溫度升高，壓力對失活常數(shù)的影響程度也在增加，這與Wang Ren等[22]的研究結(jié)論有所差異，在其研究溫度范圍內(nèi)（5～60 ℃），活化體積的絕對值先隨溫度的升高而增加，30 ℃時達最大值，然后逐漸減小。另外，本研究中得到的活化體積的絕對值要顯著低于大豆中的[13-14]，而比綠豆中的略高一些[15]。這些差異可能與不同食品中LOX性質(zhì)、濃度的差異有關(guān)，也可能與LOX所處的體系環(huán)境不同有關(guān)。

2.3 溫度對LOX失活常數(shù)的影響

表3 各壓力條件下脂肪氧化酶失活的反應(yīng)活化能及參考溫度條件下（40 ℃）的失活常數(shù)Table3 Activation energy and inactivation rate constants at referenced temperature (40 ℃) of lipoxygenase at different pressures

由前面的研究可知，LOX的失活常數(shù)在某一特定壓力條件下隨溫度的升高而增加，具體增加規(guī)律可用Arrhenius方程進行評價，利用SPSS的線性回歸程序（方程（4））可以求得各壓力條件下LOX的Ea和參考溫度（40 ℃）條件下失活常數(shù)的自然對數(shù)lnKrefT，如表3所示。由表3可知，各壓力條件下活化能均為正值，這也進一步說明在某一特定壓力條件下失活常數(shù)是隨溫度的升高而增加的。從數(shù)值上看，活化能隨壓力的升高先增加，300 MPa時達到最大值，然后逐漸減小。說明300 MPa時，溫度對失活常數(shù)的影響最為顯著。本研究的結(jié)論與Indrawati等[15]研究綠豆時得到的結(jié)論一致，他們發(fā)現(xiàn)綠豆中LOX活化能也是隨壓力的升高先增加后減小。而王韌[14]研究大豆中LOX失活時發(fā)現(xiàn)在一定壓力范圍內(nèi)（475～600 MPa），活化能隨壓力的升高而逐漸減小，與本研究結(jié)論略有不一致，這可能與其研究壓力范圍較窄有關(guān)。事實上，在本研究中若壓力范圍固定在450～600 MPa，活化能也隨壓力的升高而逐漸減小。另外，本研究中得到的LOX活化能大小與其他人研究大豆中LOX[13-14]時得到的數(shù)據(jù)一致，說明豬肉中和大豆中LOX的活化能值是大致相當?shù)摹?/p>

2.4 以Eyring方程為基礎(chǔ)建立LOX失活的動力學(xué)模型

圖1 活化體積隨溫度的變化Fig. 1 Effect of temperature on activation volume

從前面的研究可知，在整個研究的溫度范圍內(nèi)，失活常數(shù)均隨壓力升高而增加，因此Eyring方程適用于整個壓力區(qū)間。在Eyring方程中Va和lnKrefP均可表示為溫度T的函數(shù)，根據(jù)表2的數(shù)據(jù)，LOX的Va隨溫度的變化趨勢如圖1所示。經(jīng)曲線回歸分析，發(fā)現(xiàn)用一次函數(shù)對其進行擬合精度較好，決定系數(shù)達0.981，因此用方程（5）表示Va隨溫度的變化。同樣lnKrefP隨溫度的變化（圖2）也可以用一次函數(shù)擬合（方程（6））。將方程（5）、（6）代入方程（3）得到方程（7），即是初步擬合的以Eyring方程為基礎(chǔ)的LOX失活動力學(xué)模型。將表1數(shù)據(jù)代入方程（7）中，利用SPSS對方程（7）進行非線性回歸分析，得到模型中各參數(shù)的估計值（表4），整個模型的決定系數(shù)為0.965。該模型得到的各處理條件下失活常數(shù)的預(yù)測值與實測值的關(guān)系如圖3所示，可以看出該模型擬合程度較高，因此在一定的處理溫度和壓力范圍內(nèi)，可以用以Eyring方程為基礎(chǔ)建立的LOX失活動力學(xué)模型來預(yù)測豬肉中LOX在不同處理條件下的失活常數(shù)。

圖2 ln 2 lnKrefPrefP隨溫度的變化Fig. 2 Effect of temperature on lnKrefP

表4 豬肉中脂肪氧化酶高壓失活數(shù)學(xué)模型參數(shù)估計值Table4 Estimated parameters of the mathematical models of pork lipoxygenase inactivation at high pressure

圖3 模型預(yù)測（方程（7））和實驗得到的K值對比Fig. 3 Comparison between experimentally determined and model (Eq.(7)) predicted K values

式中：a、b、c、d為模型參數(shù)；K為失活常數(shù)/min－1；P為處理壓力/MPa；T為處理溫度/℃；Va為活化體積/（cm3/mol）；8.314為通用氣體常數(shù)/（J/（mol·K））；273.15為℃與K的轉(zhuǎn)換常數(shù)；450為參考壓力/MPa。

2.5 以Arrhenius方程為基礎(chǔ)建立LOX失活的動力學(xué)模型

從前面的研究可知，在整個研究的壓力范圍內(nèi)，失活常數(shù)均隨溫度升高而增加，因此Arrhenius方程適用于整個溫度區(qū)間。在Arrhenius方程中Ea和lnKrefT均可表示為壓力P的函數(shù)，根據(jù)表3中的數(shù)據(jù)，LOX的活化能隨壓力的變化趨勢如圖4所示，經(jīng)過曲線回歸分析，發(fā)現(xiàn)用三次函數(shù)對其進行擬合時精度高于比其他函數(shù)，決定系數(shù)為0.944，因此用方程（8）表示Ea隨壓力的變化。lnKrefT隨壓力的變化（圖5）用一次函數(shù)擬合效果就很好，因此用方程（9）表示。將方程（8）、（9）代入方程（4）得到方程（10），即是初步擬合的以Arrhenius方程為基礎(chǔ)的LOX失活動力學(xué)模型。將表1中的數(shù)據(jù)代入方程（10），利用SPSS對方程（10）進行非線性回歸分析，得到模型中各參數(shù)的估計值，如表4所示，整個模型的決定系數(shù)為0.989，用該模型預(yù)測的各處理條件下的失活常數(shù)與實測的失活常數(shù)的關(guān)系如圖6所示，同樣可以看出，該模型的擬合程度也較好，因此在一定的處理溫度和壓力范圍內(nèi)，也可以用以Arrhenius方程為基礎(chǔ)建立的LOX失活動力學(xué)模型來預(yù)測豬肉中LOX在不同處理條件下的失活常數(shù)。

式中：a、b、c、d、e、f為模型參數(shù)；K為失活常數(shù)/min－1；P為處理壓力/MPa；T為處理溫度/℃；Ea為活化能/（kJ/mol）；8.314為通用氣體常數(shù)/（J/（mol·K））；313.15為參考溫度/K。

圖4 活化能隨壓力的變化Fig. 4 Effect of pressure on activation energy

在王韌[14]和Ludikhuyze[23]等對大豆的研究，及Indrawati等[15]對綠豆的研究中，因Arrhenius不適用于整個溫度區(qū)間，故以Eyring方程為基礎(chǔ)建立了LOX失活的動力學(xué)方程。Weemaes等[24]研究鱷梨時以Arrhenius方程為基礎(chǔ)建立了多酚氧化酶的失活動力學(xué)模型；而Katsaros等[25]研究獼猴桃中蛋白酶失活時，同時以Arrhenius和Eyring方程為基礎(chǔ)建立了失活動力學(xué)模型。本實驗第一次在研究LOX失活時同時使用Arrhenius和Eyring方程為基礎(chǔ)來建立酶失活的動力學(xué)模型，也第一次研究了肉類中LOX在高壓處理中失活的動力學(xué)模型。從研究結(jié)果來看，兩個動力學(xué)方程均具有較高的決定系數(shù)，因此在研究的處理溫度（20～60 ℃）和壓力（200～700 MPa）范圍內(nèi)均能較好的預(yù)測豬肉高壓結(jié)合熱處理過程中LOX活性的變化；從兩者的對比來看，方程10的預(yù)測效果略高于方程（9），可能是由于方程（10）采用了三次函數(shù)來進行擬合，擬合結(jié)果更為精確，而在對方程（9）中Va和T進行擬合時，一次函數(shù)效果雖然很好，但其決定系數(shù)略低于二次和三次函數(shù)，為了簡化結(jié)果，最終采用了一次函數(shù)。

圖5 ln 5 lnKrefTrefT隨壓力的變化Fig. 5 Effect of pressure on lnKrefT

圖6 模型預(yù)測（方程（10））和實驗得到的K值的對比Fig. 6 Comparison between experimental determined and model (Eq.(10)) predicted K values

3 結(jié) 論

對豬肉進行高壓處理過程中，當處理溫度不變時，豬肉中脂肪氧化酶失活常數(shù)隨壓力（200～700 MPa）的增加而增加；同樣，當處理壓力不變時，失活常數(shù)隨溫度（20～60 ℃）的升高而增加。

各溫度條件下脂肪氧化酶的活化體積均為負數(shù)，且其絕對值隨溫度的升高而增加，說明隨著溫度的升高，壓力對失活常數(shù)的影響程度也在增加；各壓力條件下脂肪氧化酶的活化能均為正值，其數(shù)值先隨壓力的升高而增加，300 MPa后隨壓力的升高而減小，說明300 MPa時，溫度對失活常數(shù)的影響程度比其他壓力條件下都要顯著。

Arrhenius和Eyring方程分別適用于整個研究的溫度區(qū)間和壓力區(qū)間，分別以兩者為基礎(chǔ)可以建立脂肪氧化酶失活的動力學(xué)模型；兩個動力學(xué)模型的決定系數(shù)分別達0.989和0.965，均在研究的處理溫度（20～60 ℃）和壓力（200～700 MPa）范圍內(nèi)能較好的預(yù)測豬肉高壓結(jié)合熱處理過程中脂肪氧化酶活性的變化。

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Modeling the Effect of Combined Thermal and High Pressure Treatment on Inactivation of Lipoxygenase in Pork

HUANG Yechuan, LI Feng, WU Zhaomin
(College of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, China)

This study aimed to investigate the effect of high pressure processing on lipoxygenase (LOX) activity in pork. Pork Longissimus dorsi muscles were treated in the pressure range of 200-700 MPa and in the temperature range of 20-60 ℃. Changes in LOX inactivation rate constants were studied, and kinetic models of LOX inactivation based on Arrhenius and Eyring equation were established, respectively. The results showed that the inactivation rate constants increased with increasing pressure in the studied temperature range, and increased with increasing temperature in the studied pressure range. The Arrhenius and Eyring equations were suitable for the whole temperature and pressure ranges, respectively. Both the Arrhenius and Eyring kinetic models had a good f tting degree with high R2values (0.989 and 0.965, respectively). Thus, the regression models could well predict changes in LOX activity in pork during combined thermal and high pressure processing in a certain range of pressure and temperature.

pork; high pressure; thermal treatment; lipoxygenase; kinetic model

10.7506/spkx1002-6630-201702006

TS251.1

A

1002-6630（2017）02-0034-06

黃業(yè)傳, 李鳳, 吳照民. 豬肉脂肪氧化酶在高壓結(jié)合熱處理過程中失活動力學(xué)模型[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(2): 34-39. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702006. http://www.spkx.net.cn

HUANG Yechuan, LI Feng, WU Zhaomin. Modeling the effect of combined thermal and high pressure treatment on inactivation of lipoxygenase in pork[J]. Food Science, 2017, 38(2): 34-39. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201702006. http://www.spkx.net.cn

2016-03-18

國家自然科學(xué)基金面上項目（31271892）；四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心科研創(chuàng)新團隊建設(shè)基金項目（14tdgc03）

黃業(yè)傳（1975—），男，副教授，博士，研究方向為肉制品加工與食品酶技術(shù)。E-mail：55238861@qq.com