袁曉范永升謝冠群朱飛葉馮曉紅

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 杭州 310006 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)

基于“TLR4/NF-kB”信號(hào)通路研究“加味四妙丸”治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的作用機(jī)制

袁曉1范永升2謝冠群2朱飛葉2馮曉紅1

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 杭州 310006 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)

[目的]觀(guān)察“加味四妙丸”治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（acute gouty arthritis,AGA）大鼠的療效，并基于“TLR4/NF-kB”信號(hào)通路探討“加味四妙丸”作用機(jī)制。[方法]108只SD雄性大鼠，隨機(jī)分為正常組、模型組、秋水仙堿組、“加味四妙丸”低、中、高劑量組，每組18只。除正常組外，其余大鼠參照Coderre造模方法膝關(guān)節(jié)腔注射尿酸鈉懸濁液制作AGA模型，治療4d后，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)受試關(guān)節(jié)腫脹指數(shù),光學(xué)顯微鏡觀(guān)察受試關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)變化，采用ELISA法檢測(cè)關(guān)節(jié)腔沖洗液IL-1β、TNF-α的含量，免疫組化法檢測(cè)關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4、NF-kB、p-NF-kB蛋白表達(dá)，RT-PCR法檢測(cè)滑膜組織TLR4mRNA表達(dá)。[結(jié)果]與正常組比較，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)顯著升高（P＜0.01），關(guān)節(jié)滑膜組織炎性改變明顯,滑膜組織中TLR4、NF-kB、p-NF-kB蛋白表達(dá)量和TLR4mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.01），關(guān)節(jié)腔沖洗液中IL-1β、TNF-α含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，“加味四妙丸”中、高劑量組大鼠治療后關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)顯著下降（P＜0.01），關(guān)節(jié)滑膜組織炎性改變明顯減輕，滑膜組織中TLR4、NF-kB、p-NF-kB蛋白表達(dá)量和TLR4mRNA表達(dá)量均顯著下調(diào)（P＜0.01），關(guān)節(jié)腔沖洗液中IL-1β、TNF-α含量顯著下降（P＜0.01）。[結(jié)論]“加味四妙丸”可能通過(guò)抑制“TLR4/NF-kB”信號(hào)通路，從而抑制IL-1β、TNF-α的產(chǎn)生，起到治療AGA的作用，且其療效與藥物劑量有一定相關(guān)性。

加味四妙丸；AGA；TLR4/NF-kB信號(hào)通路；劑量；范永升；名醫(yī)經(jīng)驗(yàn)

痛風(fēng)(gout)是一種尿酸鈉鹽(monosodium urate，MSU)沉積所致的晶體相關(guān)性關(guān)節(jié)病，急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（acute gouty arthritis,AGA）為痛風(fēng)的典型表現(xiàn)之一，是由于MSU析出并沉淀于關(guān)節(jié)腔內(nèi)，導(dǎo)致大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，從而引起患者關(guān)節(jié)劇烈疼痛、紅腫及出現(xiàn)功能障礙。AGA常反復(fù)發(fā)作,后期易引起腎功能損害、關(guān)節(jié)畸形等，危害嚴(yán)重。近年來(lái)痛風(fēng)的發(fā)病率逐年升高，目前我國(guó)的患病率約0.67%，且發(fā)病年齡也有所提前[1]。對(duì)于AGA的治療，臨床最常用的藥物如秋水仙堿及糖皮質(zhì)激素等均存在一定的毒副作用及不良反應(yīng)，很大程度上限制了其臨床運(yùn)用[2]。

中醫(yī)學(xué)在治療AGA上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和方法。范永升教授系浙江中醫(yī)藥大學(xué)教授、博士生導(dǎo)師，第四批全國(guó)名老中醫(yī)藥專(zhuān)家學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承工作指導(dǎo)老師，結(jié)合臨床診治經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出“加味四妙丸”，即在經(jīng)典方劑“四妙丸”基礎(chǔ)上添加土茯苓、山慈菇等五味中藥，全方清熱燥濕、通絡(luò)除痹，在AGA的治療中取得了良好的臨床療效，但目前對(duì)于其作用機(jī)制研究尚少。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在AGA的發(fā)病關(guān)節(jié)局部伴隨著一些信號(hào)通路的激活或抑制，“TLR4/NF-kB”就是其中最重要的信號(hào)通路之一，該通路的激活、細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α等的大量產(chǎn)生與AGA的發(fā)病及炎癥表現(xiàn)密切相關(guān)[3]。本研究基于“TLR4/NF-kB”信號(hào)通路來(lái)探討“加味四妙丸”治療AGA的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠108只，體質(zhì)量（200±15）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)于中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2013-0184。

1.2 主要試劑和藥品 “加味四妙丸”由蒼術(shù)15g、黃柏10g、薏苡仁20g、牛膝15g、澤瀉12g、烏梢蛇9g、土茯苓15g、山慈菇15g、桂枝9g組成，所含中藥均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房提供，并由藥劑室將上述中藥加8～10倍純水浸泡30min，武火煎開(kāi)后，再文火煎煮30min，過(guò)濾，剩余藥渣加入3～5倍純水再次煎25min，藥液過(guò)濾后取過(guò)濾液，將2次過(guò)濾液濃縮成含生藥濃度為1.2g·mL-1的藥汁，分裝滅菌。秋水仙堿（1mg/片，批號(hào)：H53021534），由昆藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)。尿酸鈉懸濁液：電子天平稱(chēng)取微晶型MSU 2500mg（批號(hào)：108K5309，Sigma-Aldrich公司），用無(wú)菌生理鹽水配制成25mg·mL-1的尿酸鈉懸濁液,4℃冰箱保存,用前搖勻。IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒（批號(hào)：P26017417、P17017418），購(gòu)自CUSABIO公司；TLR-4抗體（批號(hào)：dw253469）、NF-kB(p65)抗體（批號(hào)：dw016352）、p-NF-kB(p65)抗體（批號(hào)：ap160988）均購(gòu)自Affbiotech公司；Trizol購(gòu)自Invitrogen公司（批號(hào)：123801）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(PerfectRealTime)(批號(hào)：AK3702),SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(批號(hào)：AKA3301)，均購(gòu)自Takara公司。

1.3 主要儀器 顯微鏡（OLYMPUS，Japan），CMOS （OLYMPUS，Japan），LDZ5-2型離心機(jī)（北京離心機(jī)廠(chǎng)），RM2015型切片機(jī)（LEICA公司，Germany），MDF-382E型低溫冰箱（三洋公司，Japan），恒溫水浴箱（江蘇太倉(cāng)醫(yī)用儀器廠(chǎng)），攤片機(jī)（湖北慧達(dá)儀器有限公司），MIR-153型干燥箱（三洋公司，Japan），多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)（Media Cybernetics公司，America），醫(yī)用微波爐(浙江臨安愛(ài)迪儀器廠(chǎng))。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組 SD大鼠在動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為6組：正常組、模型組、秋水仙堿組、“加味四妙丸”低劑量組、“加味四妙丸”中劑量組、“加味四妙丸”高劑量組(以下簡(jiǎn)稱(chēng)低、中、高劑量組)，每組18只。

2.2 模型制備 參照Coderre造模方法[4]：固定大鼠,以大鼠右膝關(guān)節(jié)為中心，常規(guī)碘伏消毒，鋪一次性手術(shù)洞巾，戴手術(shù)手套，正常組大鼠右膝關(guān)節(jié)外側(cè)膝眼進(jìn)針，用1mL注射器向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.2mL生理鹽水，其余5組以同樣方法右膝關(guān)節(jié)每個(gè)關(guān)節(jié)注射0.2mL尿酸鈉懸濁液。

2.3 藥物干預(yù)方法 建立模型4h后,依據(jù)人-大鼠的體表面積轉(zhuǎn)換系數(shù)，并結(jié)合前期研究，“加味四妙丸”低、中、高劑量組分別按成人劑量的4倍、8倍、12倍劑量取上述“加味四妙丸”濃縮液，用生理鹽水稀釋成混懸液灌胃；秋水仙堿組按秋水仙堿0.325mg/（kg·d）制成混懸液灌胃；正常組、模型組大鼠分別以生理鹽水灌胃；各組大鼠灌胃量均為20mL·kg-1，分2次/d定時(shí)灌胃，連續(xù)4d。

2.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

2.4.1 關(guān)節(jié)腫脹指數(shù) 分別于造模前1h、造模后4h、48h及末次灌胃后4h，采用縛線(xiàn)法于大鼠受試膝關(guān)節(jié)同一部位測(cè)量周徑，并計(jì)算各階段腫脹指數(shù)。腫脹指數(shù)=〔測(cè)量時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)周徑-初始周徑（即造模前1h測(cè)得關(guān)節(jié)周徑）〕/初始周徑。

2.4.2 受試關(guān)節(jié)腔沖洗液細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α含量檢測(cè) 末次灌胃后4h，測(cè)量完受試關(guān)節(jié)周徑后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，以大鼠受試膝關(guān)節(jié)為中心,常規(guī)備皮，碘伏消毒，切開(kāi)關(guān)節(jié)囊，用1mL生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，然后收集關(guān)節(jié)腔沖洗液，采用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)IL-1β、TNF-α的含量。

2.4.3 受試關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)觀(guān)察 切取關(guān)節(jié)囊，分離關(guān)節(jié)滑膜組織。在每組大鼠中隨機(jī)抽取3只大鼠的膝關(guān)節(jié)滑膜組織混樣作為一個(gè)樣本，采用4%中性多聚甲醛液充分固定后，沖洗標(biāo)本梯度脫水、浸蠟、包埋,切4um薄片,HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察關(guān)節(jié)滑膜組織病理變化。

2.4.4 受試膝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4、NF-kB、p-NF-kB免疫組化檢測(cè) 將上述切片脫蠟、入水、熱修復(fù)抗原后冷卻至室溫，PBS洗滌3次，滴加正常封閉液，室溫20min后，先后滴加第一抗體(稀釋比例為1：100)和生物素化第二抗體（IgG），切片上滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP）、DAB顯色、蘇木素輕度復(fù)染、脫水、透明、中性樹(shù)脂封片，最后采用美國(guó)多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)分析，算出平均光密度值。

2.4.5 受試關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4mRNA檢測(cè) 采用熒光定量RT-PCR法，取受試關(guān)節(jié)滑膜組織，采用Trizol試劑盒提取關(guān)節(jié)滑膜組織總RNA，經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA的完整性，采用TakaRa公司的Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒及SYBR Premix Ex TaqTM合成模板cDNA和擴(kuò)增目的基因cDNA片段（引物見(jiàn)表1），擴(kuò)增結(jié)束后以GAPDH為內(nèi)參基因，按下述公式計(jì)算ΔCt和ΔΔCt：ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因；ΔΔCt=（Ct實(shí)驗(yàn)組目的基因-Ct實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因）-（Ct對(duì)照組目的基因-Ct對(duì)照組內(nèi)參基因），實(shí)驗(yàn)組目的基因與對(duì)照組目的基因的差異表達(dá)量（2-ΔΔCt）用下式計(jì)算：2-ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組目的基因/對(duì)照組目的基因。

表1 GAPDH和TLR4引物Tab.1 Forward and reverse primers for GAPDH and TLR4

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA),組間兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠受試關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)比較 造模后4h，與正常組比較，其余各組大鼠受試膝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；造模后48h，與模型組比較，秋水仙堿組、中劑量組、高劑量組大鼠受試膝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)均減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；末次灌胃后4h，與模型組比較，秋水仙堿組、中劑量組、高劑量組大鼠受試膝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)均顯著減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠不同時(shí)期膝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)比較（x±s）Tab.2 Comparison of the joint swelling index at different time in each group（x±s）

3.2 各組大鼠受試關(guān)節(jié)滑膜組織光鏡觀(guān)察結(jié)果 正常組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織結(jié)構(gòu)清晰,滑膜細(xì)胞排列整齊，其間為膠原性間質(zhì),滑膜組織無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)滑膜細(xì)胞增生和毛細(xì)血管充血、水腫；模型組滑膜炎癥明顯，出現(xiàn)滑膜組織明顯水腫，滑膜細(xì)胞排列紊亂伴細(xì)胞增生，并出現(xiàn)毛細(xì)血管增生，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等炎癥表現(xiàn)；與模型組比較，秋水仙堿組及低、中、高劑量組滑膜炎癥反應(yīng)均有不同程度減輕，中、高劑量組與秋水仙堿組病變減輕程度相當(dāng)，均較低劑量組更明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠受試膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理結(jié)果（HE，400×）Fig.1 Pathological changes of Synovial tissues of the rats in each group（HE,400×）

3.3 各組大鼠受試關(guān)節(jié)腔沖洗液細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α含量測(cè)定 與正常組比較，其余各組IL-1β和TNF-α均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿組、低劑量組、中劑量組、高劑量組IL-1β均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜ 0.01）；與模型組比較，秋水仙堿組、中劑量組、高劑量組TNF-α均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與秋水仙堿組比較，高劑量組IL-1β和TNF-α差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)沖洗液IL-1β、TNF-α含量的比較（±s）Tab.3 Comparison of IL-1β and TNF-α in washing fluid of the joint cavity in each group（±s）

表3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)沖洗液IL-1β、TNF-α含量的比較（±s）Tab.3 Comparison of IL-1β and TNF-α in washing fluid of the joint cavity in each group（±s）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01；與秋水仙堿組比較，△△P＜0.01。Note:Compared with normal group，▲▲P＜0.01；compared with model group,★P＜0.05，★★P＜0.01；compared with colchicine group，△△P＜0.01.

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3.4 各組大鼠受試關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4、NF-kB、p-NF-kB免疫組化檢測(cè)結(jié)果 與正常組比較，模型組、低劑量組、中劑量組滑膜組織中TLR4、NF-kB表達(dá)量均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），模型組、低劑量組p-NF-kB表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿組、中劑量組、高劑量組滑膜組織TLR4、NF-kB、p-NF-kB表達(dá)量均顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），低劑量組TLR4、p-NF-kB表達(dá)量明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），NF-kB表達(dá)量有下調(diào)趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；秋水仙堿組TLR4、NF-kB、p-NF-kB表達(dá)量與高劑量組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4、圖2～4。

3.5 各組大鼠受試關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4mRNA檢測(cè)結(jié)

表4 各組大鼠TLR4、NF-kB、p-NF-kB比較（平均光密度值）（x±s）Tab.4 Comparison of expression levels of TLR4,NF-kB and p-NF-kB in synovial tissues in each group(MOD)（x±s）

圖2 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4的表達(dá)（400×）Fig.2 The expression of TLR4 in the synovial tissues of the rats in each group(400×)

圖3 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織NF-kBp65的表達(dá)（400×）Fig.3 The expression of NF-kBp65 in the synovial tissues of the rats in each group(400×)

果 與正常組比較，模型組、低劑量組、中劑量組TLR4mRNA相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿組、低劑量組、中劑量組、高劑量組TLR4mRNA的相對(duì)表達(dá)量均下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），其中秋水仙堿組與中劑量組、高劑量組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TRL4mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）Tab.5 Comparison of expression levels of TLR4mRNA in synovial tissues of each group（±s）

表5 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TRL4mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）Tab.5 Comparison of expression levels of TLR4mRNA in synovial tissues of each group（±s）

注：與正常組比較，▲P＜0.05,▲▲P＜0.01；與模型組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01；與秋水仙堿組比較,△△P＜0.01。Note:Compared with normal group，▲P＜0.01,▲▲P＜0.01；compared with model group,★P＜0.05，★★P＜0.01；compared with colchicine group，△△P＜0.01.

組別 T L R 4正常組模型組秋水仙堿組低劑量組中劑量組高劑量組1 1 . 9 4 9 ± 0 . 0 5 7▲▲1 . 1 0 3 ± 0 . 0 8 7★★1 . 7 7 8 ± 0 . 1 2 7▲▲★△△1 . 1 6 9 ± 0 . 0 9 7▲★★1 . 1 4 3 ± 0 . 0 6 7★★

圖4 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織p-NF-kBp65(Ser536)的表達(dá)（400×）Fig.4 The expression of p-NF-kBp65(Ser536)in the synovial tissues of the rats in each group(400×)

4 討論

AGA是痛風(fēng)最常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)之一,發(fā)作時(shí)以四肢遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)非對(duì)稱(chēng)的紅腫熱痛為主要特征，常反復(fù)發(fā)作,后期易引起腎功能損害、關(guān)節(jié)畸形等,危害嚴(yán)重,且與高血壓、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生也有密切相關(guān)性[5]。痛風(fēng)目前尚無(wú)法根治,臨床治療目的是及時(shí)控制AGA急性發(fā)作并降低血尿酸水平,減少其復(fù)發(fā)。目前最常用于治療的藥物有秋水仙堿、非甾體抗炎藥及糖皮質(zhì)激素等,但由于上述西藥存在諸多毒副作用及不良反應(yīng)，很大程度上限制了其臨床運(yùn)用[2]。

中醫(yī)學(xué)在治療AGA上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和方法，中醫(yī)學(xué)將AGA歸于“痹癥”范疇，認(rèn)為濕毒內(nèi)生是主要病機(jī)，清熱燥濕是主要治則?！八拿钔琛痹雌鹩凇兜は姆ā?，距今已有700多年的歷史，由蒼術(shù)、黃柏、薏苡仁和牛膝等四味中藥組成。黃柏苦寒燥濕，善去下焦?jié)駸?；蒼術(shù)燥濕健脾，清流潔源；牛膝補(bǔ)肝腎、祛風(fēng)濕，引藥下行；薏苡仁利濕舒筋?！凹游端拿钔琛痹凇八拿钔琛被A(chǔ)上添加土茯苓、山慈菇、桂枝、烏梢蛇、澤瀉等五味中藥。土茯苓、山慈菇擅治濕熱、利關(guān)節(jié)；桂枝通絡(luò)除痹；烏梢蛇血肉有情之品，乃祛風(fēng)通絡(luò)、主治關(guān)節(jié)痹痛之良藥；澤瀉有利水滲濕、泄熱之功效，與黃柏相須為用，清下焦?jié)駸?。全方清熱燥濕、通絡(luò)除痹，在AGA的治療中具有良好的臨床療效，但對(duì)于其作用機(jī)制研究尚少。

近年來(lái)，“TLR4/NF-kB”信號(hào)通路被公認(rèn)為與AGA的發(fā)病及炎癥表現(xiàn)密切相關(guān)。TLRs(Toll樣受體) （Toll-like receptor，TLR）屬于模式識(shí)別受體家族,可識(shí)別病原相關(guān)分子模式，目前研究較多的是該家族的TLR4。研究發(fā)現(xiàn)，在AGA時(shí)，MSU能類(lèi)似于外源性的佐劑一樣作為危險(xiǎn)信號(hào)被TLRs所識(shí)別，激活的TLRs可募集髓樣分化因子（MyD88），之后相繼活化IL-1受體相關(guān)激酶(IRAK)、TGF-β活化激酶（TAK1），進(jìn)而激發(fā)IkB激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB，從而啟動(dòng)與炎癥免疫有關(guān)的細(xì)胞因子如IL-1β、TNF-α等基因的表達(dá)，最終產(chǎn)生大量IL-1β、TNF-α等炎性細(xì)胞因子[6-8]。成熟的IL-1β被認(rèn)為是AGA時(shí)調(diào)節(jié)炎癥的始動(dòng)因素[9]：它通過(guò)激活I(lǐng)L-1受體使趨化因子和其他炎癥調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用，導(dǎo)致大量中性粒細(xì)胞進(jìn)入關(guān)節(jié)部位，促使AGA的炎癥產(chǎn)生和發(fā)展[10]；此外，IL-1β可激活破骨細(xì)胞使其分化，還能作用于神經(jīng)元，觸發(fā)機(jī)體對(duì)炎癥所致疼痛的過(guò)度敏感[11]。而TNF-α又能通過(guò)相關(guān)信號(hào)通路促使IL-1、IL-8、PGE2等細(xì)胞因子分泌及中性粒細(xì)胞出現(xiàn)吞噬活性并釋放氧自由基和蛋白水解酶，導(dǎo)致尿酸鹽沉積處出現(xiàn)充血、水腫、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并不斷加重[12]。Liu-Bryan等[13]將基因敲除TLR-4-/-的同基因型的小鼠背部造囊,注射MSU模擬AGA,結(jié)果表明這些TLRs缺陷鼠的囊腔內(nèi)中性粒細(xì)胞很少,體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MSU誘發(fā)的IL-1β、TNF-a表達(dá)也顯著減少，進(jìn)一步證實(shí)了“TLR4/NF-kB”信號(hào)通路與AGA的發(fā)病密切相關(guān)[14]。

本研究參照文獻(xiàn)進(jìn)行AGA大鼠造模，成模后觀(guān)察不同劑量“加味四妙丸”對(duì)AGA大鼠關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)、相關(guān)炎性細(xì)胞因子水平的影響及關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)改變；用免疫組化法檢測(cè)TLR4、NF-kB、p-NF-kB蛋白的表達(dá),RT-PCR檢測(cè)TLR4mRNA的表達(dá)等情況，基于“TLR4/NF-kB”信號(hào)通路探討“加味四妙丸”治療AGA的作用機(jī)制，為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

研究結(jié)果顯示:與正常組比較，模型組大鼠受試關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)明顯升高，光鏡觀(guān)察膝關(guān)節(jié)滑膜組織水腫、增生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等炎性改變明顯；免疫組化及RT-PCR等檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，模型組大鼠“TLR4/NF-kB”信號(hào)通路表達(dá)顯著上調(diào)：關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR4、NF-kB、p-NF-kB蛋白表達(dá)量和TLR4mRNA表達(dá)量均顯著升高，關(guān)節(jié)腔沖洗液中IL-1β、TNF-α含量顯著升高。與模型組比較，“加味四妙丸”中、高劑量組大鼠治療后膝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)顯著下降，滑膜組織炎性改變明顯減輕，滑膜組織TLR4、NF-kB、p-NF-kB蛋白表達(dá)量和TLR4mRNA表達(dá)量均顯著下調(diào)，關(guān)節(jié)腔沖洗液中IL-1β、TNF-α含量顯著下降，其中，高劑量組下調(diào)程度與秋水仙堿組相當(dāng)，作用強(qiáng)度強(qiáng)于中、低劑量組。

綜上所述，本研究證明“加味四妙丸”能有效治療AGA，減輕臨床癥狀，其作用機(jī)制之一，可能是通過(guò)抑制“TLR4/NF-kB”信號(hào)通路，從而抑制IL-1β、TNF-α的產(chǎn)生，起到抗炎、鎮(zhèn)痛的作用。同時(shí)，對(duì)“加味四妙丸”低、中、高不同劑量組的療效比較表明，隨著藥物劑量的增加，其對(duì)“TLR4/NF-kB”信號(hào)通路的抑制作用及療效均相應(yīng)增強(qiáng)，說(shuō)明“加味四妙丸”的療效與藥物劑量有一定相關(guān)性。本研究為更全面地闡釋“加味四妙丸”的作用機(jī)制、進(jìn)一步為尋找中藥治療AGA的作用靶點(diǎn)研究提供了客觀(guān)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Study on the Mechanism of Treatment of Acute Gouty Arthritis Rats by"Modified Simiao Pill"Based on the"TLR4/NF-kB"Signal Pathway

YUAN Xiao1,FAN Yongsheng2,XIE Guanqun2,et al 1.The First Hospital Affiliated to Zhejiang University of TCM,Hangzhou(310006)，China;2.Zhejiang University of TCM

[Objective]To observe the therapeutic effect of"Modified Simiao Pill"in the treatment of acute gouty arthritis(AGA)and to explore the mechanism of"Modified Simiao Pill"based on the"TLR4/NF-kB"signal pathway.[Methods]108 SD male rats were randomly divided into normal group,model group, colchicine group,"Modified Simiao Pill"low，medium and high dose groups,18 rats in each group.Except the normal group,the rest rats were established as AGA model by injecting monosodium urate(MUS)into the knee joint cavity according to Coderre method,after 4 days of treatment,the calculation of each time point tested joint swelling index,the pathological changes of synovial tissue were observed by optical microscope,and the content of IL-1βand TNF-αin joint cavity washing liquid was detected by ELISA method；Immunohistochemistry was applied to measure the expression of TLR4,NF-kB and p-NF-kB protein in synovial tissues.RT-PCR was used to detect the expression of TLR4mRNA in synovial tissues.[Results]Compared with the normal group,model group of rat knee joint swelling index was significantly increased(P＜0.01),synovial tissue inflammatory changed obviously,and the expression of TLR4,NF-kB and p-NF-kB protein and TLR4mRNA in synovial tissue was significantly increased(P＜0.01),the contents of IL-1βand TNF-α in the washing fluid of the joint cavity were significantly increased(P＜0.01).Compared with the model group,"Modified Simiao Pill"high and medium dose group rats knee of joint swelling index decreased significantly(P＜0.01),synovial tissue inflammatory changes were alleviated significantly,and the expression of TLR4,NF-kB and p-NF-kB protein and TLR4mRNA in synovial tissue was significantly decreased(P＜0.01),the contents of IL-1β and TNF-α in the washing fluid of the joint cavity were significantly decreased(P＜0.01).[Conclusion]"Modified Simiao Pill"may be through inhibiting the"TLR4/NF-kB"signaling pathway,thereby inhibiting the production of IL-1β and TNF-α to play a role in the treatment of AGA,and the therapeutic effect is in a dosage-dependent manner.

Modified Simiao Pill；AGA；TLR4/NF-kB signal pathway；dosage；FAN Yongsheng；experiences of famous doctor

R331

：A

1005-5509（2017）01-0017-08

10.16466/j.issn1005-5509.2017.01.003

2016-09-28）

浙江中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)科研基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2015ZZ04）

Fund project：The key project of Zhejiang Chinese Medical University Research Fund（2015ZZ04）

范永升，E-mail：fyszjtcm@163.com