邢宏運(yùn),卞鐵榮，2，鄧 宇

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，四川瀘州 646000；2.西安理工大學(xué)材料學(xué)院，西安 710048；3.重慶醫(yī)科大學(xué)臨床2系，重慶 400016)

維生素C聯(lián)合硼替佐米對(duì)人T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞凋亡的應(yīng)用*

邢宏運(yùn)1,卞鐵榮1，2，鄧 宇3

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，四川瀘州 646000；2.西安理工大學(xué)材料學(xué)院，西安 710048；3.重慶醫(yī)科大學(xué)臨床2系，重慶 400016)

目的 研究維生素C聯(lián)合硼替佐米對(duì)人T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)與Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax) 表達(dá)調(diào)節(jié)的影響。方法 采用30 nmol/L的硼替佐米組，100 μg/mL的維生素C組及聯(lián)合組分別作用于Jurkat細(xì)胞24、48、72 h，設(shè)立未加藥物的對(duì)照組，應(yīng)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長方式，免疫組織化學(xué)檢測(cè)Bax及Bcl-2的表達(dá)，CCK-8及流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)Jurkat細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期。結(jié)果 維生素C使Jurkat細(xì)胞的生長方式從對(duì)照組的局部聚集向近乎均勻分散變化；維C組及聯(lián)合組在24 h至48 h期間，Bcl-2的表達(dá)降低較硼替佐米組快，Bax表達(dá)升高的亦快，且維C組24～48 h對(duì)Bax的表達(dá)增量遠(yuǎn)超過硼替佐米組。CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在72 h時(shí)維C組、聯(lián)合組、硼替佐米組Jurkat細(xì)胞的抑制率分別為25.72%、75.23%、56.81%；流式檢測(cè)凋亡率在72 h分別為81.73%、67.06%與81.50%；維生素C組的早期凋亡率大于晚期凋亡率，而硼替佐米組與聯(lián)合組均為早期凋亡率低，但維生素C的添加，聯(lián)合用藥組細(xì)胞的早期凋亡率得到了大約15.26%的提高。結(jié)論 維生素C抑制T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞的增殖，尤其是促進(jìn)Jurkat細(xì)胞早期凋亡，且細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白Bax與Bcl-2參與了維生素C誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡機(jī)制。

Jurkat細(xì)胞；淋巴瘤，T細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；抗壞血酸；凋亡調(diào)控蛋白

近年來,人們認(rèn)識(shí)到維生素C在心血管系統(tǒng)疾病及癌癥預(yù)防和治療中可能發(fā)揮重要作用[1-8]。而硼替佐米對(duì)T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的凋亡、增殖等方面研究頗多[9-11]，且人T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞在國內(nèi)外已經(jīng)廣泛地用于白血病的研究，而藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡療法已經(jīng)成為治療白血病的主要途徑。本課題組用Jurkat 細(xì)胞為靶細(xì)胞,觀察維生素C、硼替佐米、維生素C聯(lián)合硼替佐米(簡(jiǎn)稱聯(lián)合組)分別對(duì)人T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞凋亡的差異，同時(shí)研究凋亡相關(guān)蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax) 和細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的變化，探討維生素C能否成為治療或預(yù)防癌癥的常規(guī)輔助藥物，為臨床治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 硼替佐米(西安楊森制藥有限公司)，維生素C注射液(上?，F(xiàn)代哈森藥業(yè)有限公司)，AnnexinV-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)試劑盒(美國BD公司)，細(xì)胞周期試劑盒(上海凱基生物)，CCK-8(日本Dojindo公司)，Bax、Bcl-2 單克隆抗體(美國cell signaling公司)，Jurkat 細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫)，DMEM 培養(yǎng)液(美國Gibco公司)，96 孔和6孔培養(yǎng)板(美國Thermo Nunc公司)，胎牛血清(新西蘭PAA公司)，流式細(xì)胞儀(德國Beckman Coulter Epcis-XL公司)，全波長分光光度計(jì)(美國Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞生長方式觀察 實(shí)驗(yàn)組分別為30 nmol/L的硼替佐米組，100 μg/mL的維生素C組(后簡(jiǎn)稱維C組)及聯(lián)合組(兩種藥物的濃度不變)，分別作用于Jurkat細(xì)胞24、48、72 h；對(duì)照組未加藥物。觀察比較各組細(xì)胞的生長方式。

1.2.2 藥物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制實(shí)驗(yàn) 制備Jurkat細(xì)胞懸液，將細(xì)胞調(diào)整濃度為1×108/L，接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔100 μL。37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入30 nmol/L的硼替佐米，100 μg/mL的維生素C及聯(lián)合組藥物，作用24、48、72 h。檢測(cè)前加入10 μL的CCK-8，然后培養(yǎng)1～4 h，通過全波長分光光度計(jì)測(cè)定450 nm波長的吸光度值(A值)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置復(fù)孔，抑制率=[1-實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照空A值]×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),接種于6孔板,每孔細(xì)胞數(shù)1×106,加藥方法同抑制試驗(yàn)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)48 h,用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)離心洗滌2次,用500 μL Binding Buffer重懸,轉(zhuǎn)移到流式分析管中,加入AnnexinV-FITC 15 μL 避光反應(yīng)15 min,再加入PI 5 μL避光反應(yīng)5 min,立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期 將細(xì)胞接種于6孔板,每孔細(xì)胞數(shù)為1×106,細(xì)胞培養(yǎng)處理方法同上,培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞,用冷PBS 4 ℃離心洗滌2次,加入清洗液1 mL 混勻,4 ℃離心去除,加入固定液1 mL 混勻,4 ℃放置16 h,4 ℃離心去除,加入緩沖液500 μL和PI 20 μL混勻,暗室反應(yīng)45 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 免疫法檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)情況 制備Jurkat細(xì)胞懸液，將細(xì)胞調(diào)整濃度為1×108/L，接種于放置蓋玻片的6孔培養(yǎng)板上，每孔2 mL。37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加藥方法及培養(yǎng)時(shí)間同上述實(shí)驗(yàn)，采用一步聚合物法檢測(cè)，加入1∶200 稀釋的Bax、Bcl-2 單抗孵育結(jié)合,結(jié)合羊抗兔酶標(biāo)二抗后應(yīng)用化學(xué)染色法判定結(jié)果，采用Image-Pro Plus 中文版 6.0軟件分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞生長方式 倒置熒光顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組24、48、72h，Jurkat細(xì)胞生長方式顯示：對(duì)照組和硼替佐米組Jurkat細(xì)胞呈“堆落”生長，而維C組及聯(lián)合組細(xì)胞生長方式為“堆落”散開，均勻或比較均勻地呈散細(xì)胞生長，見圖1。

A：對(duì)照組；B：維C組；C：硼替佐米組；D：聯(lián)合組。

圖2 各組72h的流式凋亡圖

A：對(duì)照組；B：維C組；C：硼替佐米組；D：聯(lián)合組。

圖3 各組72h細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果

圖4 實(shí)驗(yàn)組Jurkat細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況

組別Bcl-224h48h72hBax24h48h72h硼替佐米組211.45±0.6612.34±0.2895.42±3.1791.21±1.0496.51±2.37127.00±4.16維C組105.19±2.357.06±1.8730.44±0.734.78±0.6960.53±0.6267.94±1.65聯(lián)合組268.85±17.2310.64±0.8133.76±1.78161.81±1.5184.49±2.2886.85±0.28

2.2 藥物對(duì)細(xì)胞的生長抑制率 聯(lián)合組、硼替佐米組及維C組對(duì)Jurkat細(xì)胞的生長抑制依次降低，CCK-8同樣也驗(yàn)證了這一點(diǎn)， 3組在72h的抑制率分別為75.23%、56.81%、25.72%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)組(維C組、硼體佐米組、聯(lián)合組)與對(duì)照組的流式細(xì)胞術(shù)凋亡率分別為81.73%、81.50%、67.06%與28.51%，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組細(xì)胞凋亡率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；維C組較對(duì)照組早期凋亡率大于晚期凋亡率，其早期凋亡率占凋亡率的近60.00%，而硼替佐米組與聯(lián)合組比較，早期凋亡率低，但聯(lián)合組的早期凋亡率較硼替佐米組約增高15.26%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.4 細(xì)胞周期結(jié)果 對(duì)照組G1期55.69%，S期36.31%，G2期8.00%；維C組G1期66.83%，S期31.09%，G2期0.58%；硼替佐米組G1期62.05%，S期37.95%，G2期無；聯(lián)合組G1期64.01%，S期35.99%，G2期無,與對(duì)照組相比，G1期比例升高，而S期和和G2期細(xì)胞比例下降。各組間G1期和S期細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，G2期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

2.5 實(shí)驗(yàn)組Bcl-2和顯微鏡下對(duì)各組細(xì)胞爬片染色結(jié)果 細(xì)胞染色棕黃色即陽性表達(dá)。每組選5個(gè)非重復(fù)視野，通過Image-ProPlus中文版 6.0軟件分析其系列圖片，蛋白表達(dá)見表1。關(guān)于Bcl-2，24h組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；48h組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；72h硼替佐米組與其他兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而其他兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Bax蛋白與Bcl-2在24h相同；48h維C組與其他兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；72h硼替佐米組與其他兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

3 討 論

臨床上硼替佐米治療T細(xì)胞淋巴瘤價(jià)格高昂并對(duì)神經(jīng)末梢細(xì)胞存在毒性,而維生素C價(jià)格低廉且是普通常見藥物,且近年來維生素C在癌癥的預(yù)防及治療中作用日益受到人們重視[1]，加之其對(duì)正常細(xì)胞無不良反應(yīng)，且能一定程度上提高機(jī)體的免疫力。這與文獻(xiàn)[2-8]將維生素C應(yīng)用輔助治療卵巢癌、乳腺癌、骨轉(zhuǎn)移抗放療的患者、大劑量維生素C輔助治療化療晚期患者是一致的。而維生素C的作用不止表現(xiàn)在提高免疫力一方面，且對(duì)細(xì)胞凋亡有作用，本文對(duì)其做了研究并給出了解釋。

Bcl-2是抗凋亡蛋白,在許多白血病細(xì)胞中高表達(dá),Bax是促凋亡蛋白，其表達(dá)增加，可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。Bcl-2、Bax同為Bcl-2家族成員，Bcl-2是細(xì)胞凋亡研究中最受重視的癌基因之一，Bax為細(xì)胞凋亡調(diào)控基因。該文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明維生素C組及聯(lián)合組在24～48h時(shí)，Bcl-2的表達(dá)降低較硼替佐米組快，Bax表達(dá)升高的也快，表明維生素C在這個(gè)時(shí)間段降低了抗凋亡蛋白的表達(dá)，提高了促凋亡蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了Bax水平增加與促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)，而Bcl-2蛋白水平增加與抗凋亡相關(guān)，且表明細(xì)胞凋亡可能是通過Bax這一途徑實(shí)現(xiàn)的。但維C組及聯(lián)合組48h后的作用不及硼替佐米組，這為臨床建議48h后補(bǔ)充服用維生素C奠定基礎(chǔ)。

在細(xì)胞增殖抑制及流式凋亡實(shí)驗(yàn)中維C組的抑制率近乎硼替佐米組的1/3，但維生素C的添加使細(xì)胞的早期凋亡率得到了大約15.26%的提高。細(xì)胞周期分析表明3組藥物G1期細(xì)胞增加,聯(lián)合組與硼替佐米組的G2和S期細(xì)胞下降,維C組與聯(lián)合組的G2期和S期細(xì)胞降低，硼替佐米組S期細(xì)胞相對(duì)照組沒有明顯變化，G2期細(xì)胞亦明顯減低，各組間G1期和S期細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，G2期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但毫無疑問細(xì)胞增殖被阻滯在了G1期,使細(xì)胞無法完成DNA的復(fù)制,作用的效果與抗生素類化療藥相似。而維C組的G1期比其余兩組細(xì)胞增加的高些，這是否與早期凋亡所占比例大有關(guān)，還有待于研究?？傊撗芯拷Y(jié)果表明了維生素C添加對(duì)Jurkat腫瘤細(xì)胞的早期凋亡的提高，不同于一些抑癌藥物對(duì)晚期凋亡率影響大[9-10]，而早期凋亡率很小。如果維生素C對(duì)提高腫瘤細(xì)胞早期凋亡率具有普遍性，該研究就無疑為臨床上應(yīng)用維生素C作為腫瘤治療的輔助藥物奠定一定的基礎(chǔ)。

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Application of vitamin C combined with bortezomib in human T cell lymphoma cell line Jurkat cell apoptosis*

XingHongyun1,BianTierong1，2,DengYu3

(1.DepartmentofHematology,AffiliatedHospital,SouthWestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;2.MaterialCollege,Xi′anUniversityofTechnology,Xi′an,Shaanxi710048,China;3.SecondDepartmentofClinic,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Objective To study the influence of vitamin C combined with bortezomib on the apoptosis regulatory protein B lymphocytoma-2(Bcl-2) and Bcl-2 associated X protein (Bax) expression regulation in human T-cell lymphoma cell line Jurkat cells.Methods 30 nmol/L bortezomib group,100 μg/mL vitamin C group and the combination group were adopted to act on Jurkat cells for 24,48,72 h respectively.There was no drug added to the control group.The inverted microscope was used to observe the cell growth way.The expression of Bax and Bcl-2 proteins was detected by immunohistochemistry.CCK-8 and flow cytometry were used to detect the cellular apoptosis and cellular cycle.Results Vitamin C made the Jurkat cell growth way to change from the local accumulation growth in the control group to almost evenly disperse change.The expression decrease of Bcl-2 from 24 h to 48 h in the vitamin C group and combination group were faster than that in the bortezomib group,the Bax expression increase was also faster,moreover the expression increment of Bax from 24 h to 48 h by vitamin C far surpassed that in the bortezomib group.The inhibition rates of Jurkat cell in three groups detected by CCK-8 at 72 h were 25.72%,75.23% and 56.81% respectively.The apoptosis rates at 72 h in three groups detected by flow cytometry were 81.73%,67.06% and 81.50% respectively.Early apoptosis rate in the vitamin C group was greater than the late apoptosis rate,but the bortezomib group and combination group all had low early apoptosis rate,but cell early apoptosis rate in the combination group was increased by about 15.26% after adding vitamin C.Conclusion Vitamin C inhibits T-cell lymphoma cell line Jurkat cell proliferation,especially promotes early apoptosis of Jurkat cells,moreover confirms that the apoptosis regulatory proteins Bax and Bcl-2 participate in the vitamin C-induced Jurkat cell apoptosis mechanism.

Jurkat cells;lymphoma,T-cell；apoptosis；ascorbic acid;apoptosis regulatory proteins

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.003

四川省衛(wèi)生廳項(xiàng)目(110349)。

邢宏運(yùn)，(1974-)，副教授，博士，主要從事惡性血液病的發(fā)病機(jī)制方面研究。

R557+.4

A

1671-8348(2017)02-0152-04

2016-07-20

2016-09-02)