馬力??+陳永忠??+鐘海雁??+周波??+彭邵鋒??+李志鋼??+王湘南??+王保明??+彭映赫??+王瑞

摘要：建立了油茶籽油中角鯊烯的HPLC測(cè)定方法。樣品采用硅膠柱提純處理優(yōu)于皂化處理、皂化處理后硅膠柱提純處理，得到的色譜峰雜峰少、角鯊烯峰型對(duì)稱、峰面積較大。最佳色譜條件為C18柱，流動(dòng)相V乙腈 ∶[KG-3]V甲醇為 40 ∶[KG-3]60，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流速為1 mL/min，柱溫為40 ℃。該方法下角鯊烯在0.01～0.4 mg/mL 范圍內(nèi)濃度和面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 6；平均回收率100.28%（RSD=1.9）；精密度RSD（n=6）為1.24%；可用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)油茶籽油中角鯊烯的含量。

關(guān)鍵詞：油茶籽油；角鯊烯；高效液相色譜；流動(dòng)相；色譜條件

中圖分類號(hào)： O657.7文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0353-04

油茶籽油含角鯊烯、維生素E等活性成分，賦予其與眾不同的營養(yǎng)保健作用。角鯊烯是具有促進(jìn)血液循環(huán)、細(xì)胞修復(fù)、抗氧化和消炎殺菌等功能的天然活性成分[1-3]，廣泛用于醫(yī)療保健品和化妝品等方面。目前角鯊烯軟來源主要是深海魚類，植物性來源的角鯊烯較少。已知莧屬植物種子油中角鯊烯含量可達(dá)5%～8%，甘草根、帶皮種子和去皮種子中角鯊烯含量分別為0.2%、0.104 5%、0.078 1%，橄欖油、棕櫚油、玉米油和米糠油等也含一定量的角鯊烯。角鯊烯的檢測(cè)尚未有相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)或者規(guī)范性文件[4]，在現(xiàn)有的研究中大多采用薄層層析法（TCL）、氣相色譜法（GC）和液相色譜法（HPLC）[5]。但薄層層析法人工影響因素較多；氣相色譜法需要前期對(duì)檢測(cè)物進(jìn)行衍生處理，易引入新的雜質(zhì)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本試驗(yàn)采用TCL定性測(cè)定油茶籽油中是否含有角鯊烯，采用waters C18反相極性色譜柱考察流動(dòng)相及流動(dòng)相比例、流速及柱溫對(duì)油茶籽油中角鯊烯分離效果的影響。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料、儀器與試劑

1.1.1試驗(yàn)材料供試的油茶籽由湖南省林業(yè)科學(xué)院提供。

1.1.2試劑甲醇、乙腈和正己烷，均為色譜純；無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸銀、石油醚、氫氧化鉀、硫酸鈉和角鯊烯，均為分析純；柱層層析硅膠，為試劑級(jí)。

1.1.3試驗(yàn)儀器榨油機(jī)，湖南省林業(yè)科學(xué)院自制；DHG-9070A型電熱恒溫箱，北京佳源興業(yè)科技有限公司生產(chǎn)；SZF-06GI粗脂肪測(cè)定儀，上海新嘉電子有限公司生產(chǎn)；KQ-700DV數(shù)控超聲波清洗器，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)；P10-Y實(shí)驗(yàn)室超純水器（國之源）；LC-2010AHT液相色譜儀，日本島津公司生產(chǎn)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1測(cè)定油樣的制取稱取1～1.5 kg油茶籽，置于干燥箱105 ℃干燥至恒質(zhì)量后，用壓榨機(jī)提油，將油靜置、除雜后，備用。

1.2.2角鯊烯測(cè)定條件優(yōu)化

1.2.2.1角鯊烯的定性分析用10 cm×20 cm硅膠 GF254薄層層析薄板鑒定油茶籽油中是否含有角鯊烯。

點(diǎn)樣：在距薄層層析板1側(cè)的底部1 cm處畫好1條直線作為起點(diǎn)線，用毛細(xì)管分別吸取標(biāo)準(zhǔn)角鯊烯溶液和油茶籽油樣品垂直輕輕地接觸到起點(diǎn)線上，樣點(diǎn)間距為1～1.5 cm。

顯色：將展開劑加入到層析缸中，將層析缸密封1 h，然后將薄層層析板放入進(jìn)行展開，當(dāng)展開劑的前沿已到達(dá)薄層層析板上端0.5～1 cm時(shí)，迅速取出薄層層析板，晾干。將除去展開劑的層析板，碘缸顯色20～30 min，即出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)，取出后計(jì)算Rf值。Rf值為斑點(diǎn)中心距原點(diǎn)的距離與溶劑展開前沿距原點(diǎn)距離的比值。

1.2.2.2角鯊烯預(yù)處理優(yōu)化

角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取0.1 g的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL的容量瓶中，用正己烷定容至刻度并搖勻，配制成濃度為10 mg/mL的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

角鯊烯樣品預(yù)處理?xiàng)l件的優(yōu)化分3種不同的處理方法。

處理1（A）：皂化處理。稱取1 g油茶籽油于250 mL的磨口錐形瓶中，加入2 mol/L的KOH-乙醇溶液50 mL，連接好回流裝置，在85 ℃的恒溫水浴鍋中回流1 h，移出后冷卻至室溫。將皂化液轉(zhuǎn)入250 mL的分液漏斗中，加入飽和氯化鈉溶液50 mL，然后加入50 mL石油醚，充分振搖萃取，靜置分層后將上層溶液轉(zhuǎn)入250 mL的分液漏斗中，下層溶液再用50 mL 石油醚萃取2次，合并3次的上層有機(jī)相溶液，用去離子水洗至中性，然后過無水硫酸鈉脫水，在35 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用正己烷定容至2 mL，混勻后，過0.45 μm微孔濾膜于進(jìn)樣瓶中，作為待測(cè)液。

處理2（B）：硅膠柱提純處理。采用濕法裝柱法，將硅膠柱固定于鐵架臺(tái)上，倒入約100 mL的石油醚，稱取10 g經(jīng)500 ℃烘干的硅膠，慢慢倒入硅膠柱中，靜置片刻，再加入 0.5 cm 無水硫酸鈉（約2 g），打開塞子，使石油醚緩慢淋洗下來，確保柱中硅膠填料均勻，不出現(xiàn)氣泡和斷層現(xiàn)象。稱取 1 g 左右的油茶籽油樣品放置于小燒杯中，用少量石油醚分?jǐn)?shù)次潤洗小燒杯，洗滌液一并倒入小柱中，加入50 mL石油醚于硅膠柱中，打開旋塞，收集濾液，當(dāng)石油醚液面與上端無水硫酸鈉層相切時(shí)，再分2次加入50 mL石油醚，收集全部的洗脫液至錐形瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮濾液，然后用氮吹儀氮吹至干，隨后用正己烷定容至2 mL，充分振搖，過0.45 μm微孔濾膜，作為待測(cè)液轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣瓶中。

處理3（C）：皂化處理后硅膠柱提純處理。按處理1皂化萃取后，再按處理2硅膠柱提取。

1.2.2.3角鯊烯高效液相色譜測(cè)定的條件優(yōu)化

流動(dòng)相選擇：在流速為1 mL/min和柱溫40 ℃的相同條件下，改變流動(dòng)相，考察甲醇、乙腈、甲醇/乙腈（V/V，50/50）體系對(duì)分離效果的影響。

流動(dòng)相比例的選擇：在流速為1 mL/min和柱溫40 ℃的相同條件下，選擇較優(yōu)的流動(dòng)相比例，考察流動(dòng)相比例對(duì)分離效果的影響。

柱溫的選擇：在乙腈/甲醇（V/V，40/60）作為流動(dòng)相和流速為1 mL/min的相同條件下，改變柱溫（35、40、45 ℃），考察柱溫對(duì)分離效果的影響。

流速的選擇：在流速為1 mL/min和柱溫40 ℃的相同條件下，改變流速（0.8、1.0、1.2 mL/min），考察流速對(duì)分離效果的影響。

2結(jié)果與分析

2.1薄層層析法（TLC）定性檢測(cè)油茶籽油中的角鯊烯

由圖1可知，在Rf=0.662處有一個(gè)黃色斑點(diǎn)，斑點(diǎn)非常清晰，未產(chǎn)生拖尾，與角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品完全一致。說明油茶籽油中含有角鯊烯。

2.2預(yù)處理?xiàng)l件的測(cè)定結(jié)果

采用3種不同的預(yù)處理方法對(duì)油茶籽油樣品進(jìn)行處理，處理后的色譜圖如圖2至圖4所示。

由圖2至圖4可知，油茶籽油經(jīng)不同的預(yù)處理方法得到的角鯊烯HPLC圖譜差異很大。經(jīng)皂化處理后的HPLC圖譜雜[CM（25]質(zhì)峰較多，目標(biāo)峰（角鯊烯）附近有干擾，損害色譜柱，且皂[CM）]

化時(shí)間過長(zhǎng)。經(jīng)硅膠柱提純處理后的HPLC圖譜峰形較好，附近沒有雜質(zhì)峰的干擾，方法簡(jiǎn)單且角鯊烯峰型對(duì)稱、峰面積較大。經(jīng)皂化處理和硅膠柱提純處理后的HPLC圖譜與硅膠柱提取后的HPLC圖譜處理的效果差別不大，但角鯊烯峰面積偏低，且操作過程較為繁瑣，因此硅膠柱提取法是一種較優(yōu)的預(yù)處理方法，最終能使角鯊烯得到良好的分離效果。

2.3角鯊烯檢測(cè)高效液相色譜法條件的研究

2.3.1流動(dòng)相的選擇

由圖5可知，采用乙腈作為流動(dòng)相，由于乙腈具有較強(qiáng)的洗脫能力，圖譜中僅有1個(gè)大峰，溶劑峰與目標(biāo)峰沒有分開。采用甲醇和甲醇/乙腈（V/V，50/50）分離效果均較好，因乙腈較甲醇使柱內(nèi)承受的壓力低，考慮到色譜柱的使用壽命，選用甲醇/乙腈作為流動(dòng)相。

2.3.2流動(dòng)相比例的選擇由圖6可知，樣品在不同比例的流動(dòng)相條件下都能與雜質(zhì)峰分開，但是隨著乙腈比例的增加，樣品的保留時(shí)間增加，當(dāng)乙腈增加到60%時(shí)，樣品主峰的保留時(shí)間為29 min。一般情況下，因乙腈的洗脫能力較甲醇強(qiáng)，增加乙腈的比例，樣品的保留時(shí)間縮短，但在本試驗(yàn)中，隨著乙腈的比例增加，樣品的保留時(shí)間反而延長(zhǎng)，這可能與角鯊烯的特有性質(zhì)有關(guān)。為縮短樣品的保留時(shí)間，選擇乙腈/甲醇（V/V，40/60）作為流動(dòng)相。

2.3.3柱溫的選擇

柱溫是最重要的色譜操作條件，它直接影響色譜柱的選擇性、色譜峰區(qū)域展寬和分析速度[6]。由圖7可知，在柱溫為35、40、45 ℃時(shí)，峰形有一定的變化，但在試驗(yàn)中觀察到峰面積變化很??；樣品主峰跟其他雜質(zhì)峰均分離良好，樣品的保留時(shí)間隨著柱溫的升高都前移了。因柱溫太高容易損傷色譜柱，綜合考慮樣品的保留時(shí)間和柱子的使用壽命，柱溫選擇40 ℃。

2.3.4流速的選擇

由圖8可知，在流速選擇0.8、1.0、1.2 mL/min 時(shí)，樣品主峰跟其他雜質(zhì)峰均分離良好，流速增大時(shí)，峰寬變小，但峰面積變化不大。樣品的保留時(shí)間隨著流速的增大而縮短。同時(shí)，隨著流速的增大，柱壓會(huì)上升。綜合

考慮分析時(shí)間及柱子使用壽命，流速選擇1.0 mL/min。

2.4高效液相色譜法檢測(cè)角鯊烯的效果評(píng)價(jià)

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)角鯊烯濃度與峰面積的線性關(guān)系

量取一定量10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用正己烷稀釋，配制成濃度分別為001、0.05、0.10、0.15、0.20、0.40 mg/mL的標(biāo)樣，按選定的色譜條件，取10 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，測(cè)定其峰面積，以峰面積（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（圖9）及線性回歸方程。

線性回歸方程y=4×107x+198 720，r2=0999 6，線性范圍0.01～0.4 mg/mL。

2.4.2穩(wěn)定性試驗(yàn)

精確稱取油茶籽油樣品1 g，經(jīng)硅膠柱提取處理后用正己烷定容至2 mL，每隔8 h進(jìn)樣10 μL，按照優(yōu)化的色譜條件進(jìn)行定量分析。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表1。根據(jù)表1，計(jì)算出RSD為1.26%，說明用本試驗(yàn)方法制成的供試樣品溶液中的角鯊烯在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3回收率試驗(yàn)

加標(biāo)回收率是表示準(zhǔn)確度的一個(gè)指標(biāo)。稱取已知角鯊烯含量（80.02 μg/g）的油茶籽油樣品，再添加5 μL 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品溶液。經(jīng)硅膠柱提取處理后用正己烷定容至2 mL，進(jìn)樣10 μL，按照優(yōu)化的色譜條件進(jìn)行定量分析，重復(fù)3次，回收率試驗(yàn)結(jié)果見表2。

根據(jù)表2，得到該試驗(yàn)方法的平均回收率為100.28%，RSD為1.9%，說明該方法的回收率良好，即測(cè)定方法有良好的準(zhǔn)確度，是可靠的。

2.4.4精密度的測(cè)定

柱溫為40 ℃。該方法下角鯊烯在0.01～0.40 mg/mL范圍內(nèi)濃度和面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 6，平均回收率100.28%（RSD=19%），精密度RSD（n=6）為124%。該方法可用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)油茶籽油中角鯊烯的含量。

液相色譜法[7-8]已應(yīng)用于甘草[9-10]、羅漢果[11]中角鯊烯含量的測(cè)定，但應(yīng)用于油茶籽油的檢測(cè)中尚未有報(bào)道。本研究建立了油茶籽油中角鯊烯的HPLC測(cè)定方法，對(duì)建立油茶籽油中角鯊烯含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法具有參考價(jià)值。

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