雙烏組合給藥對大鼠佐劑型關(guān)節(jié)炎的治療作用研究

游韶平 鄒霞輝

摘要：目的利用制川烏、制草烏（雙烏）組合給藥治療大鼠佐劑型關(guān)節(jié)炎（AA）并探討其藥效強弱及作用方式。方法制備佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，給藥治療后檢測血清細(xì)胞因子TNF-α、IL-2、IL-4的水平并觀察大鼠體重和足跖的變化情況。結(jié)果隨著雙烏的治療各組大鼠血清TNF-α、IL-2的水平呈下降趨勢，而IL-4水平變化不明顯；各組大鼠左后足的足跖腫脹程度顯著減輕，各組大鼠的體重沒有顯著性差異。結(jié)論雙烏對大鼠佐劑型關(guān)節(jié)炎有明顯的治療作用，抑制炎性因子（IL-2、TNF-α）產(chǎn)生而不是促進抑炎因子（IL-4）生成可能是其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的主因。

關(guān)鍵詞：雙烏；關(guān)節(jié)炎；細(xì)胞因子；治療作用

中圖分類號：R285.5文獻標(biāo)志碼：A文章編號：1007-2349（2017）01-0076-03

【Abstract】Objective：To study the effect of Radix Aconiti Preparata and Radix Aconiti Kusnezoffii on the adjuvant arthritis（AA）in rats and its pesticide effect and mode of action. Methods：AA rat model was established. After the rats were administrated，their TNF-α，IL-2 and IL-4 in serum were measured and the changes of body weight and paw were observed. Results：With the treatment of the two herbs，the levels of serum TNF-α and IL-2 decreased while the level of IL-4 did not change significantly. And the swelling of the left hind paw of each group significantly alleviated，but their body weight was no significant differences. Conclusion：Radix Aconiti Preparata and Radix Aconiti Kusnezoffii have an obvious therapeutic effect on adjuvant arthritis in rats and can inhibit the production of IL-2 and TNF-α rather than promote the production of IL，which may be major cause for the treatment of RA.

【Key words】Radix Aconiti Preparata and Radix Aconiti Kusnezoffii，arthritis，cytokine，therapeutic effect

制川烏為川烏的炮制加工品，制草烏屬草烏的炮制加工品，這兩味藥均具有祛風(fēng)除濕，溫經(jīng)止痛的功效，臨床上常被用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎等痹癥[1，2]。但對于其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的主要方式到底是偏抗炎作用還是偏免疫作用，目前仍不完全清楚。本文將通過以下實驗來探討雙烏組合治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥效強弱及作用方式，為雙烏在臨床上的治療類風(fēng)濕等疾病的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1藥物及試劑制川烏提取物（批號 12090061），制草烏提取物（批號：12090062），廣東一方公司生產(chǎn)；雷公藤多苷片（批號：120301），黃石飛云公司生產(chǎn)；Freunds完全佐劑，SIGMA-ALDRCH公司生產(chǎn)；TNF-α、IL-2、IL-4試劑盒，RND公司生產(chǎn)；制川烏和制草烏的混合配比為1：1。

1.2動物Wistar大鼠（SPF級）雌雄各半，體重180～220 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.3大鼠AA模型制備根據(jù)文獻[3]中制備方法利用弗氏完全佐劑，于每鼠左后足跖皮內(nèi)注射0.1 mL致炎。

1.4分組與給藥劑量大鼠隨機分為6組，每組10只，雌雄各半，即空白組、模型組、雷公藤多苷片組、雙烏治療高劑量組、雙烏治療中劑量組、雙烏治療低劑量組。給藥濃度分別為雙烏治療低劑量組0.30 g/kg，雙烏治療中劑量組0.90 g/kg，雙烏治療高劑量組2.70 g/kg；雷公藤組給予雷公藤多苷片混懸液9.00 mg/kg灌服；給藥體積為2 mL/250 g?？瞻捉M、模型組以2 mL/250 g蒸餾水給大鼠灌胃[4，5]。連續(xù)灌胃給藥35 d，于第36 d對大鼠進行相應(yīng)處理。

1.5體重及炎癥反應(yīng)指標(biāo)檢測實驗開始時每7 d稱量一次各鼠的體重；AA 大鼠模型建立后每隔7 d分別測量左后足足跖的厚度，每次測量部位不變，專人負(fù)責(zé)測定并加以記錄[6]。

1.6樣本采集經(jīng)腹主動脈采血后，離心分離得到血清并作標(biāo)記。同時打開關(guān)節(jié)腔，取出滑膜組織，將取下的滑膜以10%甲醛固定，EDTA脫鈣，乙醇逐級脫水，常規(guī)包埋，石蠟切片，厚度為5 Lm，裱于干凈載玻片上，60℃恒溫箱烤片4 h，備用。

1.7細(xì)胞因子檢測血清中TNF-α、IL-2、IL-4水平[7，9]按ELISA試劑盒說明書進行檢測。病理切片：常規(guī)HE染色。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)以（x±s）表示，用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。顯著性檢驗采用單因素方差分析，組間方差分析用F檢驗，有差異的兩兩比較用t檢驗。

2實驗結(jié)果

2.1大鼠體重測量結(jié)果體重作為一種常規(guī)的實驗檢測指標(biāo)，可以反映出一種藥物的有效性和安全性[8]。通過體重的增減變化，反映該藥對機體免疫功能的調(diào)節(jié)作用及對胃腸道等消化吸收系統(tǒng)的影響。實驗數(shù)據(jù)表明，在整個實驗期間，各組動物體重變化均無顯著差異。見圖1：

2.2給藥對AA大鼠繼發(fā)炎癥反應(yīng)的影響足趾腫脹度是反應(yīng)AA模型后肢炎癥輕重程度的外部客觀指標(biāo)[6]。實驗結(jié)果表明：模型組大鼠的右后足（注射足）在致炎后開始發(fā)紅并逐漸腫脹，造模24h左右達到高峰，各組腫脹與正常組相比具有極顯著差異（P<0.01），表明造模非常成功。造膜第14d后開始給藥，一天一次，連續(xù)給藥35d。實驗結(jié)果表明：和模型組比較，給藥14d后雙烏低劑量能夠顯著降低足跖腫脹程度（P<0.05），雷公藤陽性組、雙烏中劑量組體現(xiàn)出極顯著差異（P<0.01）；給藥21d后雷公藤陽性組、雙烏中劑量、雙烏高劑量組體現(xiàn)出了極顯著差異（P<0.01）；實驗反應(yīng)出雙烏組合能夠顯著降低大鼠左后足的足跖腫脹程度，有很好的抗炎效果。見表1。

2.3大鼠血清細(xì)胞因子TNF-α、IL-2、IL-4水平檢測實驗結(jié)果表明：與空白組相比較，模型組大鼠血清中 TNF-ɑ和IL-2含量明顯增高，有極顯著差異（P<0.01），IL-4的差異不明顯。與模型組相比較，雙烏中、高劑量組能顯著降低大鼠血清中 TNF-ɑ 含量（P<0.05），雷公藤陽性組能極顯著降低大鼠血清中 TNF-ɑ 含量（P<0.01）。與空白組相比較，模型組大鼠血清中 IL-2 含量明顯增高，有極顯著差異（P<0.01）。與模型組相比較，雙烏中、高劑量組能極顯著降低大鼠血清中 IL-2含量（P<0.01），雷公藤陽性組能顯著降低大鼠血清中 IL-2含量（P<0.05）。與空白組相比較，其它各組大鼠血清中IL-4的含量沒有明顯差異（P>0.05）。見表2。

2.4各組對大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)的影響實驗結(jié)果表明：鏡下觀察到空白組滑膜組織未見異常。模型組大鼠滑膜組織可見滑膜充血，滑膜增厚明顯，炎癥細(xì)胞浸潤，關(guān)節(jié)軟骨破壞嚴(yán)重。陽性組大鼠可見滑膜細(xì)胞增生不明顯，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少。各雙烏給藥治療組的滑膜充血、水腫均有不同程度減輕，淋巴細(xì)胞浸潤明顯減少，未見關(guān)節(jié)軟骨破壞，與模型組比較均差異性顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義。病理學(xué)結(jié)果表明雙烏組合給藥能夠明顯改善AA大鼠關(guān)節(jié)的滑膜病變程度。結(jié)果見圖2。

3討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以慢性多關(guān)節(jié)炎癥為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫性疾病，RA 在世界范圍內(nèi)的平均患病率約1%，我國的發(fā)病率為0.32%-0.36%，是一種致殘率較高的疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。西藥受不良反應(yīng)的限制較大，其毒副作用明顯，患者難以長期耐受，中醫(yī)藥治療此病具有獨特優(yōu)勢，如副作用少、適宜長期服用等，使得中醫(yī)藥治療此病成為近年來國內(nèi)、外學(xué)者研究的主要方向[9]。

實驗的體重測量結(jié)果反應(yīng)出雙烏組合給藥具有安全性，不會對實驗動物的體重以及消化系統(tǒng)等造成不良影響[10]。右后足足跖腫脹厚度測量結(jié)果表明，給藥后各治療組在21d和28d時體現(xiàn)出顯著療效，和膜型組比較有顯著差異。大鼠血清細(xì)胞因子（TNF-α、IL-2、IL-4）檢測結(jié)果表明，雙烏中、高劑量組能顯著降低大鼠血清中 TNF-ɑ及 IL-2含量，但對IL-4的含量沒有明顯影響。整個實驗結(jié)果表明方劑治療大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的機制主要與抑制炎性因子（IL-2、TNF-α）的產(chǎn)生與釋放密切相關(guān)，而不是體現(xiàn)在保護或促進抑炎因子（IL-4）生成方面。

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（收稿日期：2016-10-24）