武夷巖茶種質(zhì)資源遺傳多樣性與親緣關(guān)系的SRAP分析

夏法剛，衷興旺，吳鋒，季彪俊

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武夷巖茶種質(zhì)資源遺傳多樣性與親緣關(guān)系的SRAP分析

夏法剛1，衷興旺2，吳鋒1，季彪俊1

1. 福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院，福建福州350002；2. 武夷山市茶葉產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，福建武夷山354300

本研究利用SRAP-PCR反應(yīng)體系，從88對(duì)SRAP引物組合中篩選出43對(duì)引物組合，對(duì)武夷巖茶主要的30份種質(zhì)資源進(jìn)行SRAP分析，共擴(kuò)增出385條帶，其中具有多態(tài)性的有236條帶，占總數(shù)的61.30%，表明30份武夷巖茶種質(zhì)呈現(xiàn)一定的遺傳多樣性。武夷巖茶種質(zhì)資源間遺傳距離變幅在0.31~0.98之間，平均為0.63，基于SRAP標(biāo)記利用系統(tǒng)聚類法把武夷巖茶分為三大類，為武夷巖茶遺傳研究、品種選育與資源保護(hù)提供參考。

武夷巖茶；種質(zhì)資源；SRAP標(biāo)記；遺傳多樣性；親緣關(guān)系

武夷山是烏龍茶的發(fā)源地，保存有大量茶樹種質(zhì)資源，是烏龍茶種質(zhì)保存的核心區(qū)[1]。武夷巖茶的品質(zhì)主要取決于茶樹品種和其獨(dú)特的制作工藝。其中，起決定作用的是茶樹品種的特征品質(zhì)。武夷山獨(dú)特的環(huán)境條件孕育了大量?jī)?yōu)質(zhì)茶樹種質(zhì)資源，素有“茶樹品種王國(guó)”之稱[2]，但這些優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源需進(jìn)一步開發(fā)利用[3]，才能充分發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)武夷巖茶的生物學(xué)特性[1]、營(yíng)養(yǎng)成分[4]、烘焙技術(shù)[5-6]、品質(zhì)形成[7-8]等方面進(jìn)行了大量的研究，但對(duì)武夷巖茶種質(zhì)資源遺傳多樣性方面的研究比較少。本研究以武夷巖茶中主要的30份種質(zhì)資源為研究對(duì)象，通過(guò)SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)武夷巖茶的遺傳多樣性進(jìn)行研究，為武夷巖茶種質(zhì)資源的鑒定和評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)，并從中篩選優(yōu)質(zhì)資源，為武夷巖茶種質(zhì)資源的保護(hù)、利用和遺傳改良等方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

30份武夷巖茶種質(zhì)資源試驗(yàn)材料收集自武夷山茶葉科學(xué)研究所資源圃，各材料編號(hào)見表1。

表1 試驗(yàn)材料名稱及編號(hào)

1.2 試劑與儀器

Taq DNA聚合酶、dNTP、10×PCR buffer、MgCl2及標(biāo)準(zhǔn)分子量（Marker）B030t和植物基因組DNA提取試劑盒等購(gòu)自鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司，溴酚藍(lán)、氯化鈉、β-巰基乙醇、無(wú)水乙醇、異戊醇等其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

PCR儀為美國(guó)伯樂（BIO-RAD）S1000 Thermal Cycler，電泳儀采用北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，索福Legend Micro17微量臺(tái)式離心機(jī)，eppendorf 5415R冷凍離心機(jī)，DYY-6C型電泳儀，美國(guó)伯樂（BIO-RAD）凝膠成像儀，電熱恒溫水浴鍋，eppendorf移液槍，冰箱，微波爐，高壓滅菌鍋等。

1.3 引物

SRAP正反向引物采用Li和Quiros[9]、Vandemark等[10]和Ferriol等[11]發(fā)表的引物序列（表2），SRAP引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 基因組DNA的提取步驟

基因組DNA提取按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.4.2 DNA質(zhì)量檢測(cè)

電泳檢測(cè)提取的基因組DNA質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)茶葉基因組DNA濃度：將待測(cè)樣品適當(dāng)稀釋（茶葉DNA 10?μL用TE緩沖液稀釋至2?000?μL）后，TE緩沖液進(jìn)行調(diào)零，設(shè)定紫外光波長(zhǎng)，分別測(cè)定230、260、280?nm波長(zhǎng)時(shí)的OD值，并計(jì)算DNA的純度和濃度。根據(jù)計(jì)算的濃度稀釋至20?mg·L-1，然后放入－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 SRAP-PCR體系

SRAP擴(kuò)增反應(yīng)體系：Mg2+濃度3.0?mmol·L-1，Taq酶2.0?U，dNTPs濃度0.2?mmol·L-1，引物濃度2.0?μmol·L-1，10×Buffer 2.0?μL，模板DNA 20?ng；反應(yīng)總體積為25?μL。經(jīng)過(guò)重復(fù)試驗(yàn)，確定SRAP-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5?min；94℃變性1?min，35℃復(fù)性1?min，72℃延伸100?s，5個(gè)循環(huán)；94℃變性1?min，50℃復(fù)性1?min，72℃延伸100?s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5?min。對(duì)30份資源DNA進(jìn)行SRAP擴(kuò)增，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

表2 武夷巖茶遺傳多樣性研究的SRAP引物序列

1.4.4 種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

引物序列見表2。首先從30份茶樹種質(zhì)資源中選出6份形態(tài)特征差別比較大的2、3、6、7、8、16共計(jì)6個(gè)品種，對(duì)88對(duì)引物進(jìn)行篩選，從88對(duì)引物中篩選出多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物用于PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系見1.4.3，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)7.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳，進(jìn)行觀察并拍照。

1.4.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

對(duì)獲得的SRAP-PCR擴(kuò)增條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在相同遷移位置，當(dāng)出現(xiàn)清晰可辨的電泳條帶時(shí)標(biāo)記為1，模糊或不存在條帶記為0。通過(guò)DPS7.05計(jì)算各品種之間的遺傳距離，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入MEGA7，構(gòu)建進(jìn)化樹[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的提取與檢測(cè)

利用試劑盒提取的茶葉DNA整體質(zhì)量良好，DNA拖尾現(xiàn)象不明顯（圖1中的1~10泳道），證明RNA的干擾比較小，DNA的條帶整體清晰、帶型好，而且DNA溶液呈無(wú)色透明，說(shuō)明DNA中雜質(zhì)較少，可用于進(jìn)行SRAP相關(guān)試驗(yàn)。

2.2 SRAP多態(tài)性引物的篩選

首先從30份茶樹種質(zhì)資源中選出6份形態(tài)特征差別比較大的2、3、6、7、8、16共計(jì)6個(gè)品種對(duì)88對(duì)引物進(jìn)行篩選，從88對(duì)引物中篩選出多態(tài)性高、重復(fù)性好的43對(duì)引物用于PCR擴(kuò)增。利用上述6個(gè)品種分別對(duì)Me8/Em7、Me8/Em8、Me8/Em9、Me8/Em10、Me8/Em11共5對(duì)引物進(jìn)行篩選（圖2）。從圖中可以看出，Me8/Em7、Me8/Em9、Me8/Em10、Me8/Em11這4對(duì)引物擴(kuò)增的多態(tài)性比較高。從88對(duì)引物中共篩選出多態(tài)性高的43對(duì)引物，并用這43對(duì)引物對(duì)30份烏龍茶種質(zhì)資源進(jìn)行擴(kuò)增。

2.3 武夷巖茶種質(zhì)資源的SRAP擴(kuò)增結(jié)果

用獲得的43對(duì)能產(chǎn)生清晰可辨別擴(kuò)增條帶的引物組合對(duì)30份武夷巖茶種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出385條帶，其中具有多態(tài)性的有236條，占總數(shù)的61.30%，表明30份武夷巖茶種質(zhì)呈現(xiàn)一定的遺傳多樣性。平均來(lái)看，每對(duì)引物可擴(kuò)增出8.95條帶，其中具有多態(tài)性的有5.49條帶。43對(duì)SRAP引物擴(kuò)增的條帶見表3。其中Me3/Em6這對(duì)引物擴(kuò)增出15條帶，在所有引物中擴(kuò)增出條帶數(shù)最多。

注：M：DL15000，1~10泳道：1~10號(hào)烏龍茶基因組DNA。

注：品種從左到右依次為2、3、6、7、8、16，引物分別為Me8/Em7、Me8/Em8、Me8/Em9、Me8/Em10、Me8/Em11。

2.4 武夷巖茶種質(zhì)資源的遺傳距離分析

利用DPS7.05版本計(jì)算武夷巖茶種質(zhì)資源間的平均遺傳距離，遺傳距離變幅在0.31~0.98之間，平均為0.63，說(shuō)明武夷巖茶種質(zhì)資源間遺傳差異較大。根據(jù)遺傳距離矩陣表計(jì)算出30份武夷巖茶種質(zhì)資源間的平均遺傳距離（表4）在0.53~0.95之間。其中1號(hào)平均0.95，排在第1位，11號(hào)和24號(hào)排在第2和第3位，分別達(dá)到0.76和0.71，說(shuō)明這3個(gè)種質(zhì)資源與其他種質(zhì)資源的差異較大，關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.5 基于SRAP的30份武夷巖茶種質(zhì)資源聚類分析

將獲得的武夷巖茶種質(zhì)資源的SRAP標(biāo)記轉(zhuǎn)化成[0, 1]原始矩陣，并通過(guò)DPS7.05計(jì)算出遺傳距離，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入MEGA7，構(gòu)建系統(tǒng)樹（圖3）。從圖中可以看出，30份武夷巖茶可分為三大類，其中1號(hào)北斗單獨(dú)歸于第I類群，北斗原產(chǎn)北斗峰，后經(jīng)引種栽培，與其他武夷巖茶種質(zhì)資源差異較大，性狀特征差別也比較明顯。11號(hào)半天妖和17號(hào)奇蘭歸為第Ⅱ類群，半天妖為武夷山傳統(tǒng)五大名叢之一，原產(chǎn)三花峰之第三峰絕頂崖上，相傳“此茶非人所植，系古時(shí)飛鳥由他山喙銜茶籽，落此生成”，因此與其他種質(zhì)資源區(qū)別比較大。剩余27份種質(zhì)資源歸于第Ⅲ類群，其中26號(hào)梅占與29號(hào)金毛猴遺傳親緣關(guān)系較近，8號(hào)水金龜和21號(hào)黃玫瑰、4號(hào)矮腳烏龍和27號(hào)毛蟹、9號(hào)金鎖匙和22號(hào)丹桂親緣關(guān)系較近，18號(hào)金牡丹、19號(hào)金觀音和20號(hào)黃觀音都是鐵觀音的后代，因此遺傳親緣關(guān)系也較近。

表3 43對(duì)引物組合的SRAP擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性信息

表4 30份武夷巖茶種質(zhì)資源與其他種質(zhì)資源的平均遺傳距離

3 討論

SRAP標(biāo)記是根據(jù)基因的外顯子和內(nèi)含子特點(diǎn)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的一種分子標(biāo)記技術(shù)，具有穩(wěn)定、簡(jiǎn)單、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，已在玉米[13]、小麥[14]、青稞[15]等糧食作物的遺傳多樣性分析中證實(shí)。沈程文等[16-17]利用SRAP技術(shù)對(duì)廣東25份地方茶樹種質(zhì)資源和5個(gè)不同地區(qū)的對(duì)照品種進(jìn)行了遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)廣東茶樹種質(zhì)資源間存在一定的遺傳多樣性，共擴(kuò)增出127條帶，多態(tài)性比率達(dá)88.67%，證明了SRAP標(biāo)記在茶樹種質(zhì)資源分析中的可行性。

武夷巖茶種質(zhì)資源遺傳多樣性研究未見相關(guān)報(bào)道，本研究利用43對(duì)SRAP引物組合對(duì)30份武夷巖茶種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出385條帶，其中具有多態(tài)性的有236條，占總數(shù)的61.30%。平均來(lái)看，每對(duì)引物可擴(kuò)增出8.95條帶，其中具有多態(tài)性的帶有5.49條，這與沈程文等[16]對(duì)廣東茶樹（4.83條）種質(zhì)資源的研究相近，進(jìn)一步證明了SRAP技術(shù)比較適合茶樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析。

李振剛[18]通過(guò)RAPD分析將30份茶樹種質(zhì)資源中的26份歸為一類群，其中部分為目前的主栽品種，親緣關(guān)系較近，而且30份品種中多數(shù)原產(chǎn)于安溪。而在本研究中，30份武夷巖茶種質(zhì)資源有27份歸為一大類，這些武夷巖茶種質(zhì)資源的地理分布與聚類分析并不完全一致，這可能是由于地區(qū)間引種交流所致，可能表明福建烏龍茶種質(zhì)資源和加工技術(shù)是由武夷山傳播到安溪的傳播路徑具有一定的關(guān)系[19]。種質(zhì)資源引入后，經(jīng)過(guò)后天的人工選擇和種質(zhì)資源對(duì)環(huán)境條件選擇進(jìn)化，從而表現(xiàn)出不同的性狀特征，由于武夷山和安溪兩地的氣候條件差異明顯，所以茶樹種質(zhì)資源群體間在萌芽期、開花期、種子成熟期、花器、果實(shí)、種子等性狀等方面存在一定差異[20]。如何篩選優(yōu)異武夷巖茶種質(zhì)資源，合理選擇優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)、親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的父母本是當(dāng)前巖茶茶樹育種中的重要問(wèn)題，SRAP分子標(biāo)記從分子水平上揭示了品種的特征特性及親緣關(guān)系，具有不受生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期、部位和環(huán)境等因素的限制，可以快速、高效、靈敏地鑒定品種間的親緣關(guān)系，結(jié)合生物學(xué)特征特性進(jìn)行雜交，可獲得遺傳基礎(chǔ)廣泛、變異豐富的后代，從而為新品種選育、品種鑒定和種質(zhì)保存奠定基礎(chǔ)。

圖3 烏龍茶種質(zhì)資源的聚類圖

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SRAP Marker Analysis of Genetic Diversity and Relationship in Wuyi Rock Tea Germplasm Resources

XIAFagang1, ZHONG Xingwang2, WU Feng1, JI Biaojun1

1. Crop Science College of Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2. Tea products Quality Inspection Institute of Wuyishan City, Wuyishan 354300, China

The genetic diversity and relationship of 30 Wuyi rock tea germplasms were analyzed by Sequence-related amplified polymorphism (SRAP) markers. Forty three pairs of primers selected from 88 pairs of candidate SRAP primers produced 385 amplified fragments. Among them, 236 were polymorphic, accounting for 61.30% of the total fragments. The results showed that there was distinct genetic diversity within Wuyi rock tea germplasms. The genetic distance ranged from 0.31 to 0.98 with an average of 0.63. Thirty Wuyi rock tea germplasms were classified as three categories basing on the UPGMA cluster analysis. This study was of great significance for genetic research, breeding and resource protection of Wuyi rock tea.

Wuyi rock tea, germplasms, SRAP marker, genetic diversity, genetic relationship

S571.1；Q52

A

1000-369X(2017)01-078-08

2016-06-17

2016-08-09

國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013QK311）

夏法剛，男，講師，主要從事茶樹遺傳育種及品質(zhì)分析。E-mail：sdxfm@163.com