模擬干濕交替對(duì)水稻土古菌群落結(jié)構(gòu)的影響*

包麗君賈仲君

（1 中國科學(xué)院南京土壤研究所，南京 210008）

（2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

模擬干濕交替對(duì)水稻土古菌群落結(jié)構(gòu)的影響*

包麗君1，2賈仲君1?

（1 中國科學(xué)院南京土壤研究所，南京 210008）

（2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

干濕交替是自然界普遍存在的現(xiàn)象，但長(zhǎng)期以來由于技術(shù)的限制，復(fù)雜土壤中微生物對(duì)水分變化的響應(yīng)規(guī)律仍不清楚。針對(duì)我國江蘇常熟湖泊底泥發(fā)育的典型水稻土，在室內(nèi)開展?jié)駶?rùn)-風(fēng)干以及風(fēng)干-濕潤(rùn)各三次循環(huán)，每次循環(huán)中濕潤(rùn)、風(fēng)干狀態(tài)各維持7d，利用微生物核糖體rRNA的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過高通量測(cè)序分析土壤古菌多樣性變化，同時(shí)結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，在DNA和RNA水平研究古菌數(shù)量對(duì)干濕交替過程的響應(yīng)規(guī)律。結(jié)果表明：水稻土濕潤(rùn)-風(fēng)干過程中，在DNA水平土壤古菌數(shù)量降幅約為149倍～468倍，而在RNA水平降幅最高僅為2.06倍；水稻土風(fēng)干-濕潤(rùn)過程中，在DNA水平古菌數(shù)量增幅在147倍～360倍之間，而在RNA水平增幅最高僅為2.95倍。表明在干濕交替過程中，DNA水平的古菌16S rRNA基因數(shù)量變化遠(yuǎn)高于RNA水平?；诟咄繙y(cè)序多樣性的結(jié)果表明，在DNA和RNA水平，濕潤(rùn)土壤3次風(fēng)干、以及風(fēng)干土壤3次加水濕潤(rùn)7d恢復(fù)后，土壤古菌群落結(jié)構(gòu)均發(fā)生統(tǒng)計(jì)顯著性改變。在微生物門、綱、目、科和屬的不同分類水平下，水稻土古菌主要包括3、10、13、14、10種不同的類群，在RNA和DNA水平的結(jié)果基本一致。干濕交替導(dǎo)致部分古菌類群發(fā)生顯著變化，其中在微生物分類學(xué)目水平發(fā)生顯著變化的古菌最高達(dá)到6種，主要包括產(chǎn)甲烷古菌和氨氧化古菌，如Methanobacteriales、Methanosarcinales、Methanomicrobiales和Nitrososphaerales等。這些研究結(jié)果表明，反復(fù)的干濕交替并未顯著改變水稻土中古菌的主要類群組成，古菌類群的絕對(duì)數(shù)量和相對(duì)豐度發(fā)生了一定程度的變化，但這些變化與微生物生理作用的聯(lián)系仍需進(jìn)一步研究；風(fēng)干土壤中古菌RNA序列極可能來自于完整的古菌細(xì)胞，暗示了這些古菌細(xì)胞能夠較好地適應(yīng)水稻土中水分的劇烈變化，風(fēng)干狀態(tài)的土壤在一定程度也可用于土壤古菌群落組成研究。

高通量測(cè)序；水稻土；16S rRNA；16S rRNA基因；干濕交替；古菌

20世紀(jì)以來，由于全球氣候變化，包括溫度與降水在內(nèi)的主要?dú)夂蛱卣髦蛋l(fā)生了變化，全球范圍內(nèi)的降水和干旱模式可能持續(xù)發(fā)生改變［1］。1958年Birch發(fā)現(xiàn)干旱的土壤加水培養(yǎng)后，二氧化碳的排放量顯著增加，這一現(xiàn)象隨后被學(xué)術(shù)界稱為Birch效應(yīng)或者干土效應(yīng)［2］。二氧化碳排放量的改變對(duì)全球碳循環(huán)以及氣候變化有著重要影響。然而，Birch效應(yīng)的基本原理迄今仍未有明確的結(jié)論。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為Birch效應(yīng)是一個(gè)物理化學(xué)過程，當(dāng)土壤風(fēng)干后，不同團(tuán)聚體孔隙中充滿大量的空氣，而土壤經(jīng)歷降雨后，雨水會(huì)逐漸滲入土壤，將閉蓄在土壤中包括CO2等在內(nèi)的空氣壓出，造成CO2排放量在短時(shí)間內(nèi)迅速增加［3］。然而，近年來也有研究表明微生物在其中發(fā)揮了更大的作用。一般認(rèn)為，干旱脅迫下微生物細(xì)胞能 夠自動(dòng)調(diào)節(jié)滲透壓，積累并產(chǎn)生高濃度的溶質(zhì)（例如氨基酸、多元醇等）以防止細(xì)胞脫水凋亡［3］。而土壤經(jīng)加水再濕潤(rùn)后，水分迅速滲入導(dǎo)致細(xì)胞膨脹裂解，部分細(xì)胞溶質(zhì)外流，從而被其他微生物利用［4］，導(dǎo)致風(fēng)干土壤加水濕潤(rùn)后，微生物呼吸作用增強(qiáng)，短期內(nèi)CO2排放量顯著增加。同時(shí)也有報(bào)道認(rèn)為，風(fēng)干土壤加水濕潤(rùn)時(shí)，滯留在團(tuán)聚體空隙中的空氣，由于大氣壓力差導(dǎo)致土壤團(tuán)聚體的膨脹裂解，使新的有機(jī)質(zhì)被暴露，從而被微生物利用，土壤呼吸作用增加［5］。微生物種類多、分布廣、代謝強(qiáng)、繁殖快，被認(rèn)為是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最活躍的部分，是生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)主要驅(qū)動(dòng)者［6］，對(duì)外界環(huán)境干擾的響應(yīng)十分敏感。同時(shí)，微生物呼吸作為土壤呼吸的重要組成部分，可能會(huì)強(qiáng)烈影響大氣二氧化碳濃度，被認(rèn)為是陸地生態(tài)系統(tǒng)光合固定大氣碳的幾乎唯一輸出途徑。因此，外界環(huán)境如土壤水分的動(dòng)態(tài)變化，不僅會(huì)影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，也會(huì)影響生態(tài)系統(tǒng)碳氮循環(huán)過程［6-7］。稻麥輪作是我國南方重要的水稻管理方式，水稻生長(zhǎng)中期烤田也是一種常見農(nóng)業(yè)耕作制度，由此產(chǎn)生的干濕交替過程極可能對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其活性產(chǎn)生一定的影響，但長(zhǎng)期以來由于技術(shù)手段的限制，相關(guān)研究報(bào)道較少。

20世紀(jì)80年代，Woese和Fox［8］根據(jù)核糖體rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，提出了古菌（Archaea）、細(xì)菌（Bacteria）和真核生物（Eukarya）的三域分類系統(tǒng)。然而，長(zhǎng)期以來，古菌一直被認(rèn)為僅存在于極端條件下，如極端高鹽、強(qiáng)堿或者強(qiáng)酸環(huán)境。1992年，研究者利用16S rRNA引物擴(kuò)增海水微生物群落的基因組DNA，首次發(fā)現(xiàn)了非極端環(huán)境中存在與極端環(huán)境古菌高度相似的“泉古菌”，隨后陸地生態(tài)系統(tǒng)中也發(fā)現(xiàn)存在大量的泉古菌，改變了古菌僅棲息于極端環(huán)境的傳統(tǒng)認(rèn)知。據(jù)估算，每克土壤最多可能含有約100 億個(gè)微生物細(xì)胞，上百萬種不同的微生物物種［9］，而古菌數(shù)量占所有微生物的比例最高可達(dá)12%～38%［10］，且古菌在土壤元素轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要作用，如氨氧化古菌、產(chǎn)甲烷古菌等。然而，古菌對(duì)土壤環(huán)境中水分變化的適應(yīng)策略和響應(yīng)程度研究報(bào)道較少，其環(huán)境影響規(guī)律及驅(qū)動(dòng)機(jī)制仍不清楚［11］。

2007年以來，以高通量測(cè)序?yàn)榇淼姆肿由鷳B(tài)學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，為研究土壤古菌對(duì)干濕交替的適應(yīng)規(guī)律提供了重要的技術(shù)支撐。此外，RNA較DNA水平的靈敏度更高，細(xì)胞分泌到環(huán)境中的游離RNA降解快，通常以秒計(jì)，而DNA相對(duì)穩(wěn)定，游離的DNA也可在土壤中保留較長(zhǎng)時(shí)間，因此，RNA常被用來評(píng)價(jià)微生物的活性，而DNA通常被用于微生物多樣性的資源評(píng)價(jià)。此外，土壤中的DNA來自于完整細(xì)胞內(nèi)和游離于細(xì)胞外的兩部分，在一定程度上，DNA分析并不能準(zhǔn)確反映細(xì)胞水平的微生物種群數(shù)量變化，并且土壤DNA提取可能與環(huán)境樣品的狀態(tài)、胞外游離DNA數(shù)量等緊密相關(guān)，單一的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)無法準(zhǔn)確反映土壤微生物種群數(shù)量的變化。新一代高通量測(cè)序技術(shù)的數(shù)據(jù)通量大、并且能同時(shí)分析上百個(gè)不同樣品，是研究復(fù)雜環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)和物種組成的重要工具［12］。據(jù)此，本研究針對(duì)江蘇常熟典型水稻土，設(shè)置了濕潤(rùn)-風(fēng)干、風(fēng)干-濕潤(rùn)干濕循環(huán)3次，每次持續(xù)7d后提取土壤微生物DNA和RNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和高通量測(cè)序多樣性技術(shù)，研究水稻土古菌對(duì)干濕交替過程的響應(yīng)規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品概況

水稻土采自江蘇常熟湖泊底泥發(fā)育的土壤（31°33′N，120°42′E），采樣小區(qū)的農(nóng)業(yè)耕種方式為冬小麥-夏水稻的水旱輪作，2014年4月采集0～20cm表層的新鮮土壤，研磨過2mm篩并保存。土壤的基本理化性質(zhì)如下：pH7.3，有機(jī)質(zhì)36.2 g kg-1，全氮1.9g kg-1，硝態(tài)氮0.04g kg-1，銨態(tài)氮0.007g kg-1，土壤最大持水量為53.6%。

1.2 水稻土的干濕交替過程

土壤的干濕交替培養(yǎng)過程具體如下：濕潤(rùn)（F1）-風(fēng)干（D1）-濕潤(rùn)（F2）-風(fēng)干（D2）-濕潤(rùn)（F3）-風(fēng)干（D3）-濕潤(rùn)（F4），其中濕潤(rùn)-風(fēng)干過程3次，包括F1-D1、F2-D2和F3-D3，風(fēng)干-濕潤(rùn)過程3次，包括D1-F2、D2-F3和D3-F4。每個(gè)過程大約持續(xù)7 d并開展分子生態(tài)學(xué)分析。主要流程如下：首先，稱取210g新鮮稻田土壤于無菌托盤置于通風(fēng)處晾干，將晾干土壤保持7d，隨后，將這些風(fēng)干土壤加水濕潤(rùn)并恢復(fù)到新鮮狀態(tài)保持7d，然后繼續(xù)進(jìn)行風(fēng)干培養(yǎng)7d，并循環(huán)培養(yǎng)。每次濕潤(rùn)或風(fēng)干作為一個(gè)處理，每次處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。每個(gè)重復(fù)收集大約10g土，其中3g土壤樣品，加入RNA later （Ambion）后，-20℃保存用于RNA 提取，其余樣品保存于-20℃，用于DNA提取以及后續(xù)分析。

1.3 水稻土核酸DNA/RNA的提取

利用FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒（MP Bio）提取土壤總DNA，稱取干重約為0.5 g的土樣，按照試劑盒內(nèi)說明書的方法操作，提取土壤微生物的總DNA，并溶解于100 μl無菌水后-20℃保存待用。通過微量紫外分光光度計(jì)（NanoDrop?ND-1000）測(cè)定DNA 濃度和純度（OD260/OD280和OD260/OD230），其中每個(gè)樣品濃度均保證30 ng μl-1，大部分DNA樣品OD260/OD280值在1.8～2之間以保證DNA質(zhì)量。同時(shí)，利用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分析DNA 的完整性和相對(duì)濃度。

根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道的方法［13］，提取土壤微生物的總RNA，具體如下：（1）將保存于-20℃冰箱中，裝有等量干重的0.5g土樣并加入了500 μlRNA later的2.0 ml帶螺帽口的裂解管置于冰上解凍后，13722 rmin-1離心2 min棄上清液，去除RNA later；（2）在土壤沉淀物中加入0.5 g 玻璃珠（0.5mm∶0.1mm=3∶2，Sigma）和預(yù)冷的700 μl TPM buffer（50 mmolL-1Tris-HCl pH5.0，1.7% polyvinylpyrrolidone，20 mmolL-1MgCl2），使用Fast PrepTMFP120 核酸提取儀以6 m s-1的速度裂解土壤微生物細(xì)胞35 s，隨后將裂解混合物在4℃低溫下13722 r min-1離心2 min，上清液轉(zhuǎn)移至2.0 ml的無菌離心管；（3）向裂解管中的土壤沉淀物加入預(yù)冷的700 μlPBL buffer（5 mmol L-1pH 5.0 Tris-HCl，5 mmolL-1pH 8.0 EDTA Na2，0.1% SDS，6%水飽和酚），重復(fù)步驟（2），連續(xù)2次提取土壤核酸以提高DNA/RNA回收效率［14］；（4）依次利用500 μl的3 種有機(jī)試劑清洗（2）（3）步驟合并后的上清液：水飽和酚（p H 4.5），苯酚∶氯仿∶異物醇（25∶24∶1）（pH 4.5），氯仿∶異物醇（24∶1），充分混勻后4℃低溫下13722 r min-1離心2 min 并將上清液轉(zhuǎn)移至新的2.0ml無菌離心管中；（5）加入2倍體積PEGNaCl（30% PEG-6000，1.6 molL-1NaCl）于上清液中并混勻，室溫下靜置2h 后離心10 min，棄上清液后加入400 μl 70% 乙醇清洗沉淀，并再次13 722 r min-1離心5 min；（6）棄上清液后，離心管置于無菌臺(tái)吹干沉淀并加入50 μlDNase /RNasefree H2O 溶解；（7）利用Recombinant DNaseⅠ（TaKaRa）去除總核酸中的DNA，隨后，通過RNeasyMinElute cleanup Kit（QIAGEN）試劑盒純化土壤總RNA，并利用微生物16S rRNA基因的通用引物（515F/907R）擴(kuò)增土壤總RNA，確?？俁NA中不存在DNA污染；（8）利用微量紫外分光光度計(jì)（NanoDrop?ND-1000）測(cè)定RNA 濃度，采用PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit（Takara）試劑盒將土壤RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并于-20℃保存待用。

1.4 高通量測(cè)序土壤微生物16S rRNA及其基因

針對(duì)濕潤(rùn)-風(fēng)干、風(fēng)干-濕潤(rùn)處理的7個(gè)過程，分別提取土壤總RNA和DNA后開展16S rRNA基因和cDNA的多樣性分析。如表1所示，首先利用通用引物515F和907R擴(kuò)增土壤微生物的16S rRNA基因，盡可能無偏差覆蓋土壤中的所有微生物群落，以便后續(xù)從中提取古菌序列。用于焦磷酸測(cè)序的通用引物前端含有12個(gè)堿基的特異Barcode標(biāo)簽，用以區(qū)分不同的土壤樣品。PCR擴(kuò)增體系為：25 μl的TaKaRa 2×SYBR?Premix EX TaqTM（dNTP Mixture，Buffer，Mg2+Plus）0.5 μl的引物（20 μmolL-1），加入2.0 μl DNA模板和無菌水至50 μl反應(yīng)體系，每次PCR反應(yīng)均設(shè)置無菌水的陰性對(duì)照。PCR擴(kuò)增條件為：94℃，5.0 min；30× （94℃，30s；55℃，30s；72℃，45s）；72℃，10 min。

獲得PCR產(chǎn)物后，利用AgaroseMiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0試劑盒（Takara）切膠純化，并將純化產(chǎn)物溶于30μl DNase-free H2O。通過微量紫外分光光度計(jì)（NanoDrop?ND-1000）測(cè)定濃度后，采用TruSeq Nano DNA LT Sample Prep Kit試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行建庫后，等摩爾數(shù)混合，利用Illumina公司MiSeq測(cè)序系統(tǒng)上機(jī)分析。對(duì)測(cè)序所得總序列進(jìn)行去除嵌合體處理，根據(jù)不同標(biāo)簽提取樣品序列，并進(jìn)行后續(xù)分析。

本研究中3次濕潤(rùn)-風(fēng)干、風(fēng)干-濕潤(rùn)過程中共7個(gè)處理土壤樣品的DNA和cDNA進(jìn)行Miseq高通量測(cè)序，利用Qiime對(duì)原始序列進(jìn)行分析，去除低質(zhì)量序列后，分別獲得1395262和757425條高質(zhì)量序列，平均每個(gè)樣品分別獲得66441和36067條序列［15］。同時(shí)利用Qiime進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，在97%置信度下將每個(gè)樣品所有的16S rRNA基因序列進(jìn)行分類，獲得門、綱、目、科和屬各水平下的分類單元。以其中一個(gè)濕潤(rùn)土壤的一個(gè)重復(fù)樣品為例，N為所有高質(zhì)量序列總和，劃分到某個(gè)分類單元的序列數(shù)為ni，根據(jù)公式Pi=ni/ N，得到各個(gè)分類單元的相對(duì)豐度開展后續(xù)分析。進(jìn)一步通過R軟件分別對(duì)樣品進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)分析。

表1 PCR擴(kuò)增引物Table 1 Primers used in this study

1.5 土壤總DNA和cDNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法與已有的報(bào)道一致［14］。將土壤的總DNA和cDNA樣品，根據(jù)NanoDrop測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行稀釋，使最終濃度保證在1～10 ng μl-1，作為定量PCR的模板。定量PCR的標(biāo)線利用含有古菌和細(xì)菌16S rRNA基因的克隆進(jìn)行制備。首先利用特定引物進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，構(gòu)建克隆文庫后，將含有目的基因的克隆在LB營(yíng)養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒純化并測(cè)定質(zhì)粒的濃度，根據(jù)摩爾常數(shù)計(jì)算出目的基因的拷貝數(shù)，隨后用DNase-free H2O將質(zhì)粒連續(xù)稀釋8個(gè)數(shù)量級(jí)，從而得到各個(gè)目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)時(shí)熒光定量PCR于CFX96 Optical Real-Time Detection System（Bio-Rad）上完成。定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：10μl的SYBR?Premix EX TaqTM（Takara），上、下游引物（10 pmolμl-1）各0.5μl，1.0μl土壤總DNA/cDNA模板，加入8μl滅菌雙蒸水至20 μl反應(yīng)體系。每次試驗(yàn)均采用滅菌雙蒸水代替DNA 作為反應(yīng)模板設(shè)置嚴(yán)格的陰性對(duì)照。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用Origin8.1和SPSS16.0進(jìn)行處理分析，處理之間的平均值差異采用one-way ANOVA單因素方差分析，p＜0.05表示顯著差異。非度量多維尺度 （NMDS，Non-metric multidimensional scaling）圖譜利用R軟件統(tǒng)計(jì)繪制。

2 結(jié) 果

2.1 水稻土干濕交替過程中古菌數(shù)量的變化

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分別對(duì)水稻土3次濕潤(rùn)-風(fēng)干以及3次風(fēng)干-濕潤(rùn)過程中古菌數(shù)量進(jìn)行分析。如圖1所示，在風(fēng)干過程中，古菌數(shù)量顯著降低；而在濕潤(rùn)過程則顯著增加。3次風(fēng)干過程中，古菌數(shù)量在DNA水平降幅149倍至468倍，然而，在RNA水平的下降僅發(fā)生在第1次和第3次風(fēng)干過程，降幅最大僅為2.06倍，而在第2次風(fēng)干過程，古菌rRNA數(shù)量基本不變，在統(tǒng)計(jì)上未有顯著性差異。類似的，濕潤(rùn)過程中，土壤加水濕潤(rùn)后DNA水平古菌數(shù)量顯著增加，增幅147倍～360倍，而在RNA水平古菌數(shù)量的顯著增加僅發(fā)生在第2次濕潤(rùn)過程中，增幅2.95倍；第1次和第3次加水濕潤(rùn)后，古菌rRNA數(shù)量甚至出現(xiàn)了下降趨勢(shì)。總體而言，風(fēng)干和濕潤(rùn)過程中古菌群落的16S rRNA及其基因數(shù)量呈相反的趨勢(shì)，尤其在DNA水平古菌數(shù)量的變化遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于RNA水平。

2.2 水稻土干濕交替過程中古菌群落的變化

如表2所示，3次濕潤(rùn)-風(fēng)干、以及風(fēng)干-濕潤(rùn)過程中，在DNA和RNA水平分別獲得土壤古菌高質(zhì)量序列共計(jì)38839和17213條。在微生物分類門、綱、目、科和屬的分類水平下，零時(shí)刻濕潤(rùn)土壤F1在DNA水平含有3、9、13、12、8不同的古菌類群，而在RNA水平則包括了3、7、10、9、7種不同的古菌類群。對(duì)古菌16S rRNA基因進(jìn)行非度量多維尺度NMDS分析表明，在DNA和RNA水平下（圖2A，圖2B），古菌微生物的群落結(jié)構(gòu)均發(fā)生了顯著性改變（p＜0.05）。這一結(jié)果表明，本研究中的新鮮土壤樣品進(jìn)行3次風(fēng)干及加水濕潤(rùn)培養(yǎng)后不僅影響了土壤古菌16S rRNA基因的數(shù)量，也對(duì)其群落結(jié)構(gòu)有一定的影響。

圖1 干濕交替下土壤古菌16S rRNA基因在DNA（A）和RNA（B）水平下的數(shù)量變化規(guī)律Fig. 1 Change of archaeal 16S rRNA genes in abundance at DNA（A）and RNA levels（B），respectively，in soils under wet-dry alternation

表2 MiSeq高通量測(cè)序樣品描述Table 2 Summary of pyrosequencing results

針對(duì)干濕交替過程中顯著增加的古菌類群進(jìn)行分析，如圖3所示，風(fēng)干過程中，在RNA水平下，門、綱、目、科和屬水平統(tǒng)計(jì)上顯著增加的古菌類群明顯高于DNA水平。同時(shí)，在第3次濕潤(rùn)-風(fēng)干（FD-3）過程中，在DNA水平未檢測(cè)到有顯著增加的古菌，但是在RNA水平下，門、綱、目、科和屬水平均有顯著增加的古菌類群。在風(fēng)干-濕潤(rùn)（DF）過程中，DNA水平下，門、綱、目、科和屬水平均有古菌類群發(fā)生顯著增加，但是在RNA水平卻未檢測(cè)到顯著增加的古菌。以第1次濕潤(rùn)-風(fēng)干過程為例，在DNA水平，在目水平有2個(gè)古菌類群發(fā)生顯著增加，其相對(duì)豐度從0.005%，增加了0.023%，增加4.60倍；在RNA水平，目水平有4個(gè)古菌類群發(fā)生顯著增加，其相對(duì)豐度從0.786%增加了1.637%，增加2.08倍。

圖2 干濕交替過程中古菌微生物16S rRNA基因在DNA（A）和RNA（B）水平下的非度量多維尺度分析Fig. 2 NMDS（non-metric multidimensional scaling）analysis of compositional structure of 16S rRNA genes of the soil archaea under wet-dry alternationat DNA level（A）and RNA level（B），respectively

圖3 干濕交替過程中顯著增加的古菌相對(duì)豐度變化規(guī)律Fig. 3 Rules of the soil archaea varying in relative abundance with processes of dry-wet alternation

圖4 干濕交替過程中顯著減少的古菌類群變化規(guī)律Fig. 4 Rules of the soil archaea decreasing during the process of wet-dry alternation

進(jìn)一步針對(duì)干濕交替過程中顯著降低的古菌類群進(jìn)行分析，如圖4所示，在濕潤(rùn)-風(fēng)干過程中，在RNA水平未檢測(cè)到顯著減少的古菌，而在DNA水平下，門、綱、目、科和屬均檢測(cè)到顯著減少的古菌類群，但DNA水平第2次濕潤(rùn)-風(fēng)干過程中也未檢測(cè)到有顯著性減少的古菌類群。表明在RNA水平濕潤(rùn)-風(fēng)干過程中，門、綱、目、科和屬水平的不同類群古菌均發(fā)生明顯增加或未有統(tǒng)計(jì)顯著變化。同時(shí)，在風(fēng)干-濕潤(rùn)過程中，在DNA和RNA水平下均出現(xiàn)了顯著減少的古菌類群，且RNA水平顯著減少的古菌數(shù)量以及豐度減少值要明顯高于DNA水平。結(jié)合圖3，表明在風(fēng)干-濕潤(rùn)過程中，在RNA水平下，門、綱、目、科和屬水平受顯著影響的古菌，相對(duì)豐度均是降低。

2.3 水稻土干濕交替過程中古菌主要組成的變化

如圖5所示，干濕交替過程中，水稻土古菌主要包括泉古菌門（Crenarchaeota）和廣古菌門（Euryarchaeota），而前者以氨氧化古菌為主，后者則主要由產(chǎn)甲烷古菌組成。在微生物分類目的水平，水稻土在D N A和R N A水平分別包括了1 4和1 3種主要功能群，主要包括pGrfC26和Nitrososphaerales類群（泉古菌門），Methanosarcinales、Methanobacteriales、YCE6、E2和Methanocellales（廣古菌門），這些功能群占水稻土古菌百分比高達(dá)80%以上。此外，在風(fēng)干處理的DNA樣品中，也檢測(cè)到耐鹽古菌Halobacteriales，其相對(duì)豐度隨著風(fēng)干次數(shù)的增加而不斷增長(zhǎng)，但在RNA水平未能檢測(cè)到耐鹽古菌。

圖5 干濕交替過程中土壤古菌在目水平下分類單元的相對(duì)豐度。A和B分別是在DNA和RNA水平下的高通量序列分析Fig. 5 Variation of the soil archaea at order level in relative abundance during the processes of dry-wet alternation，and high-throughput sequencing at DNA level（A）and RNA level（B），respectively

在微生物分類目水平下，產(chǎn)甲烷古菌（Methanosarcinales和Methanobacteriales）和泉古菌（pGrfC26和Nitrososphaerales）對(duì)土壤風(fēng)干和加水濕潤(rùn)的響應(yīng)模式各有不同。如圖6所示，在濕潤(rùn)-風(fēng)干過程中，Methanobacteriales 在DNA水平豐度有增加趨勢(shì)，卻無顯著差異，但在R N A水平的豐度顯著增加（圖6 A）。Methanosarcinales在DNA水平豐度顯著減少，而在RNA水平豐度有增加趨勢(shì)，卻無顯著差異（圖6B）。Nitrososphaerales和pGrfC26在DNA水平豐度均出現(xiàn)過顯著降低，而在RNA水平正好相反，豐度呈現(xiàn)增加趨勢(shì)（圖6C，圖6D）。在風(fēng)干-濕潤(rùn)過程中Methanobacteriales、Methanosarcinales、Nitrososphaerales和pGrfC26在DNA和RNA水平豐度的變化與濕潤(rùn)-風(fēng)干過程正好相反（圖6E—圖6H）。以Methanobacteriales為例，在DNA水平，濕潤(rùn)-風(fēng)干過程中，Methanobacteriales豐度有增加趨勢(shì)，卻無顯著差異，而在風(fēng)干-濕潤(rùn)過程中正好相反，Methanobacteriales豐度有減少趨勢(shì)，卻無顯著差異；在RNA水平，濕潤(rùn)-風(fēng)干過程中，Methanobacteriales豐度顯著增加，而在風(fēng)干-濕潤(rùn)過程中，Methanobacteriales豐度顯著降低（圖6E）。

3 討 論

干濕交替是土壤中普遍發(fā)生的一種自然現(xiàn)象，它對(duì)于全球元素循環(huán)有著重要的影響［18-19］，且古菌在自然界重要元素的生物地球化學(xué)循環(huán)過程中發(fā)揮著重要作用。故本文就濕潤(rùn)土壤的風(fēng)干過程以及風(fēng)干土壤的加水濕潤(rùn)過程對(duì)古菌的影響展開了相關(guān)研究。在濕潤(rùn)-風(fēng)干（FD）過程中，古菌數(shù)量在DNA水平降幅要高于在RNA水平的降幅；在風(fēng)干-濕潤(rùn)（DF）過程中，DNA水平古菌數(shù)量增幅要明顯高于RNA水平的增幅，表明水分變化對(duì)古菌表達(dá)的影響要小于對(duì)其數(shù)量的影響。高通量測(cè)序結(jié)果表明，DNA和RNA水平，H2/CO2利用型的產(chǎn)甲烷古菌Methanobacteriales在濕潤(rùn)-風(fēng)干過程中，相對(duì)豐度有增加趨勢(shì)，且在RNA水平顯著增加；在風(fēng)干-濕潤(rùn)過程，相對(duì)豐度有減少趨勢(shì)，且在RNA水平顯著減少，說明Methanobacteriales在土壤水分匱乏時(shí)具有一定的耐受性，而當(dāng)土壤水分恢復(fù)時(shí)，具有較強(qiáng)緩沖能力。而乙酸利用型產(chǎn)甲烷古菌Methanosarcinales相對(duì)豐度在DNA水平顯著減少，在RNA水平無顯著差異，表明在水分脅迫下，Methanosarcinales仍然能夠正常表達(dá)。氨氧化古菌Nitrososphaerales在DNA水平相對(duì)豐度顯著減少，而在RNA水平顯著增加，表明風(fēng)干過程對(duì)Nitrososphaerales數(shù)量有一定影響的減少，但并沒有響應(yīng)其表達(dá)。在濕潤(rùn)-風(fēng)干過程，風(fēng)干土壤中古菌RNA水平明顯增加，表明古菌細(xì)胞能夠保持一定的完整性，并在適應(yīng)水分脅迫的過程中大量表達(dá)。此外，我們?cè)谒就林袡z測(cè)到了與極端嗜鹽古菌Halobacteria高度類似的16S rRNA序列，而極端嗜鹽古菌Halobacteria主要分布于天然或人工的高鹽環(huán)境，如鹽（堿）湖、曬鹽場(chǎng)、鹽礦、人工腌制品等。此外，干濕交替過程中也檢測(cè)到與海洋古菌MCG（Miscellaneous Crenarchaea Group）高度相似的序列，MCG通常分布在海洋底泥，可能參與全球范圍內(nèi)的沉積作用，同時(shí)具有較低的呼吸速率［20］。這些結(jié)果在一定程度上表明，古菌在地球環(huán)境中的分布極為廣泛，并且這些古菌對(duì)環(huán)境水分的變化具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力。

圖6 干濕交替過程中古菌主要組成的變化規(guī)律Fig. 6 Rules of the soil archaea varying in composition during the wet-dry alternation

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果表明，風(fēng)干過程均會(huì)使DNA水平的古菌16S rRNA基因拷貝數(shù)顯著性降低，而風(fēng)干土壤加水濕潤(rùn)培養(yǎng)后，土壤古菌16S rRNA基因的拷貝數(shù)均又出現(xiàn)了明顯的增加，這與已有的研究報(bào)道保持一致［21-22］。根據(jù)16S rRNA基因拷貝數(shù)推測(cè)，3次風(fēng)干土壤加水恢復(fù)培養(yǎng)后，DNA水平古菌數(shù)量變化要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于RNA水平數(shù)量變化。干濕交替過程中古菌RNA豐度變化較小，其原因可能與古菌對(duì)極端環(huán)境如干旱、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和高鹽等具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力有關(guān)［23］。早期有研究顯示，細(xì)胞通過植物進(jìn)行休眠階段的代謝轉(zhuǎn)換適應(yīng)干旱［24］。同時(shí)，有研究證實(shí)，休眠中的細(xì)胞仍然有大量核酸的累積，有利于古菌細(xì)胞延長(zhǎng)生存，快速恢復(fù)代謝活性等［25］。這些研究均暗示，土壤風(fēng)干過程可能導(dǎo)致部分細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，其轉(zhuǎn)錄豐度變化不明顯。值得注意的是，干濕交替過程中古菌16S rRNA基因數(shù)量變化高達(dá)468倍，一方面可能是由于古菌迅速增長(zhǎng)繁殖，但另一方面也可能是DNA提取中存在一定的實(shí)驗(yàn)誤差。例如，風(fēng)干土壤加水濕潤(rùn)土壤DNA提取極可能與其狀態(tài)緊密相關(guān)，濕潤(rùn)土壤和風(fēng)干土壤的DNA提取效率可能有著極大差異，并可能顯著影響后續(xù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果。此外，游離DNA的存在會(huì)高估土壤中古菌的16S rRNA基因數(shù)量，而濕潤(rùn)土壤和風(fēng)干土壤中的游離DNA提取效率可能具有極大的差異，導(dǎo)致干濕交替過程古菌16S rRNA基因數(shù)量的顯著差異。復(fù)雜水稻土中，古菌如何適應(yīng)水分的劇烈變化過程，在 DNA和RNA水平的響應(yīng)和適應(yīng)機(jī)制仍然需要進(jìn)一步研究［26］。

一般認(rèn)為，產(chǎn)甲烷古菌是嚴(yán)格厭氧微生物，但值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)在完全好氧條件下進(jìn)行，產(chǎn)甲烷古菌盡管在數(shù)量上可能發(fā)生明顯變化，但產(chǎn)甲烷生理過程幾乎不可能進(jìn)行。因此，產(chǎn)甲烷古菌數(shù)量的增加或者減少，極可能與其生理活性關(guān)聯(lián)度較小。以H2和CO2利用型產(chǎn)甲烷古菌Methanobacteriales為例，濕潤(rùn)-風(fēng)干過程中，在RNA水平古菌的相對(duì)豐度顯著增加，而產(chǎn)甲烷古菌失水過程中似乎很難具有生理活性，因此，RNA表達(dá)量的增加極有可能來自于產(chǎn)甲烷古菌對(duì)水分脅迫的響應(yīng)。此外，RNA降解極快，風(fēng)干土壤中幾乎不可能以游離狀態(tài)存在，因此，風(fēng)干土壤中RNA極有可能來自于完整的古菌細(xì)胞。古菌在RNA水平相對(duì)豐度的增加，在一定程度上表明風(fēng)干土壤中產(chǎn)甲烷古菌的細(xì)胞能夠保持一定的完整性，并在適應(yīng)水分逐漸喪失的脅迫過程中大量表達(dá)。相應(yīng)的，氨氧化古菌也表現(xiàn)出了類似的規(guī)律，在濕潤(rùn)-風(fēng)干過程中，RNA水平的相對(duì)豐度明顯增加，表明風(fēng)干土壤中可能存在較為完整的氨氧化古菌細(xì)胞并能夠較好地適應(yīng)水分喪失的脅迫過程。隨著單細(xì)胞技術(shù)的快速發(fā)展，結(jié)合其他一些先進(jìn)的物理化學(xué)方法，未來將有可能在更精細(xì)化的水平準(zhǔn)確描述復(fù)雜土壤中古菌細(xì)胞對(duì)干濕交替過程的適應(yīng)和響應(yīng)規(guī)律。

一般而言，自然環(huán)境中土壤微生物群落的形成是一個(gè)長(zhǎng)期的過程，特定土壤中的微生物群落在組成上也具有相對(duì)的穩(wěn)定性。因此，在短期的干濕交替條件下培養(yǎng)，土壤中不同的微生物物種可能具有不同的生長(zhǎng)策略和代謝速率，如在加水恢復(fù)培養(yǎng)后個(gè)別微生物繁殖較快并能迅速成為優(yōu)勢(shì)種群，但短期培養(yǎng)似乎很難改變絕大部分微生物，如古菌的物種組成。我們推測(cè)實(shí)驗(yàn)土壤中的古菌微生物是其長(zhǎng)期適應(yīng)自然環(huán)境變化的演化產(chǎn)物。然而，干濕交替過程中，本研究發(fā)現(xiàn)DNA和RNA水平下古菌數(shù)量變化規(guī)律具有極為顯著的差異，相差可能達(dá)到上百倍。由此帶來的問題是，風(fēng)干-濕潤(rùn)過程中，古菌數(shù)量在DNA水平的增幅高達(dá)數(shù)百倍，這種極顯著的數(shù)量變化是否來自于古菌細(xì)胞的大量繁殖，抑或是土壤DNA提取效率問題，目前仍不得而知。然而，一般認(rèn)為DNA片段在土壤中的存留時(shí)間較長(zhǎng)，甚至可保存幾十年，而RNA降解快，因此RNA極有可能來自于完整的細(xì)胞，而DNA也可能來自土壤中游離的DNA，風(fēng)干-濕潤(rùn)的加水濕潤(rùn)過程中促進(jìn)了土壤DNA提取效率，導(dǎo)致古菌16S rRNA基因的拷貝數(shù)增加上百倍。未來仍需開發(fā)先進(jìn)的技術(shù)方法，減少土壤中游離DNA的干擾，更加準(zhǔn)確地表征土壤微生物多樣性及其對(duì)干濕交替等環(huán)境干擾的響應(yīng)和適應(yīng)機(jī)制。

4 結(jié) 論

新鮮水稻土經(jīng)過3次干濕交替處理后，古菌數(shù)量變化明顯，同時(shí)在微生物分類門、綱、目、科和屬各水平均有不同古菌發(fā)生顯著改變，進(jìn)而可能改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。本研究表明風(fēng)干以及加水恢復(fù)過程對(duì)古菌數(shù)量和活性均有一定程度的影響，但未來仍需在細(xì)胞水平準(zhǔn)確刻畫復(fù)雜土壤環(huán)境中古菌對(duì)水分變化的適應(yīng)和響應(yīng)規(guī)律。例如，干濕交替過程中古菌絕對(duì)數(shù)量的劇烈變化，是否來源于古菌適應(yīng)水分變化的生理生長(zhǎng)，抑或是來自于DNA/ RNA提取等分子技術(shù)的誤差。此外，干濕交替過程對(duì)古菌細(xì)胞活性的影響也是未來研究重點(diǎn)之一。

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（責(zé)任編輯：盧 萍）

《土壤學(xué)報(bào)》2015年度優(yōu)秀論文評(píng)選揭曉

《土壤學(xué)報(bào)》2015年度優(yōu)秀論文評(píng)選活動(dòng)已于近期結(jié)束。經(jīng)本刊編委推薦和評(píng)選，共評(píng)出優(yōu)秀論文獎(jiǎng)9篇，涵蓋土壤地理與土壤信息、土壤物理與土壤侵蝕、土壤化學(xué)、土壤生物、植物營(yíng)養(yǎng)、土壤肥力、土壤管理等版塊?，F(xiàn)將獲獎(jiǎng)名單公布如下（詳見附件），并授予年度優(yōu)秀論文證書，給予適當(dāng)獎(jiǎng)勵(lì)。

附件：

《土壤學(xué)報(bào)》編輯部

二〇一六年十二月二日

Changes of Archaeal Communities in a Paddy Soil under Drying and Re-wetting Cycles

BAO Lijun1，2JIA Zhongjun1?
（1 Institute of Soil Science，Chinese Academy of Sciences，Nanjing 210008，China）
（2 University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China）

【Objective】Dry-wet alternation is a common phenomenon existing in nature，especially in paddy soil. But it is still unclear about rule of the response of soil microorganisms to such variation of soil moisture in complex soil，because of limitations in technology. This study was aimed to investigate rules of changes inabundance and community of archaea in a typical paddy soil derived frnom lacustrine sediment，in Changshu of Jiangsu，experiencing three cycles of drying and wetting in lab. 【Method】Soil samples of the typical paddy soil from Changshu were subjected to three consective cycles of drying and wetting in lab. Each of the drying or wetting period lasted 7 days. Real-time quantitative polymerase chain reaction（Realtime PCR）and high-throughput sequencing of 16S rRNA genes were performed to analyze how the archaea in the soil samples changed in biodiversity，abundance and community in response to the dry-wet alternations at DNA and RNA levels. 【Result】The Real-time PCR analysis suggests that the abundance of archaeal 16S rRNA genes copy number changed in response to dry-wet alternation，dropping at DNA level by 149～468 times，but only by 2.06 times on RNA level during the process from wet to dry，and rising by 147～360 times at DNA level，but only by 2.95 times at RNA level during the process from dry to wet. These findings indicate that the change of archaea in 16S rRNA genes copy number was far greater at DNA level than at RNA level. Based on the high-throughput sequencing of 16S rRNA genes，it was found that the archaea community changed significantly in structure at both DNA level and RNA level after three consecutive dry-wet cycles and the changes may be described by non-metric multidimensional scaling（NMDS）（p＜0.05）. The archaea in the paddy soil could be sorted into 3，10，13，14 and 10 groups at either DNA or RNA level，when classified at phylum，class，order，family and genus level，respectively. The alternation caused significant changes in the archaeal community，especially the six groups at order level，including mainly Methanogenicarchaea and ammonia-oxidizing archaea，like Methanobacteriales，Methanosarcinales，Methanomicrobiales and Nitrososphaerales. The change varied by 2.1%，from 2.82% to 0.69% in total abundance and by 3.79 times，from 0.54% to 2.60%，in maximum fold. 【Conclusion】The Real-time PCR analysis demonstrates that the abundance of archaeal 16S rRNA genes copy number changed significantly in response to the alternation. The high-throughput sequencing of 16S rRNA genes indicates that the archaeal community in the soil changed significantly in structure with the soil alternating in soil moisture condition from dry to wet and from wet to dry. As in environment free extracellular RNAs decompose rapidly，while free extracellular DNAs may remain intact for quite a long time，it is quite probable that archaeal RNA sequence may come from intact microbial cells，and these archaeal cells are able to adapt to severe moisture changes in paddy soil. As the process of drying or wetting does have some impacts on abundance and composition of archaea communities，it is moreadvisable to unfold studies on changes in soil archaea at DNA and RNA levels simulataneously so as to expose rules of the soil archaea responding to dry-wet alternation of the soil.

High-throughput sequencing；Paddy soil；16S rRNA；16S rRNA gene；Dry-wet alternation；Archaea

《土壤學(xué)報(bào)》2015年度優(yōu)秀論文獎(jiǎng)獲獎(jiǎng)名單（以版塊順序排序）

Q938

A

10.11766/trxb201603140046

* 國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）項(xiàng)目（2015CB150501）資助 Supportedbythe National Key Basic Research Programof China（No.2015CB150501）

? 通訊作者Correspondingauthor，E-mail：jia@issas.ac.cn

包麗君（1990—），女，安徽安慶人，碩士研究生，主要從事微生物生態(tài)研究。E-mail：ljbao@issas.ac.cn

2016-03-14；

2016-07-04；優(yōu)先數(shù)字出版日期（www.cnki.net）：2016-11-08