蔥白提取物調(diào)節(jié)非酒精性脂肪肝脂質(zhì)水平的機(jī)制研究

許思思　時(shí)昭紅　郭潔

摘要：目的 觀察蔥白提取物對非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）脂質(zhì)水平的影響，探討其防治NAFLD的作用機(jī)制。方法 采用高脂飼料喂養(yǎng)法復(fù)制非酒精性脂肪肝大鼠模型，造模成功后予以蔥白提取物及易善復(fù)進(jìn)行治療，同時(shí)用PKA抑制劑H89和cAMP激動劑Forskolin（FSK）作為對照，分為8組（正常對照組、模型組、易善復(fù)組、蔥白組、FSK組、H89組、蔥白-FSK組、蔥白-H89組）。結(jié)果 模型組大鼠血清TG、TC、肝組織TG、FFA、MDA含量明顯高于正常組，肝組織SOD含量明顯低于正常組；蔥白組、易善復(fù)組、蔥白-FSK組、蔥白-H89組大鼠血清TG、TC、肝組織TG、FFA、MDA含量顯著低于模型組，肝組織SOD含量高于模型組。其中蔥白-FSK組改善情況顯著高于蔥白組，蔥白-H89組低于蔥白組。結(jié)論 蔥白提取物能抑制脂肪在肝臟的過度蓄積，減輕脂質(zhì)過氧化，起到治療NAFLD的作用，其機(jī)制可能是與激活cAMP信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：非酒精性脂肪肝；蔥白提取物；cAMP；脂質(zhì)

非酒精性脂肪肝是指無過量飲酒史，以肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床綜合征，被認(rèn)為是代謝綜合征在肝臟的組成部分。其危害在于，隨著病情的進(jìn)展，NAFLD患者可發(fā)生不同程度的肝纖維化，并可發(fā)展成肝硬化，甚至導(dǎo)致肝癌[1]，并且易于并發(fā)心腦血管疾病而導(dǎo)致相關(guān)的致死致殘率上升。本研究將通過探討蔥白提取物對非酒精性脂肪肝脂質(zhì)沉積水平的影響及相關(guān)分子機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 SPF級SD雄性大鼠36只，體質(zhì)量（150±20）g，購自湖北省疾病控制中心（合格證編號：SCXK鄂2008-0005）。

1.2藥物與試劑 高脂飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司；易善復(fù)膠囊（多烯磷脂酰膽堿，由北京賽諾菲制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字：H20059010）配置成14.25 g/L的溶液；蔥白提取物（由武漢市第一醫(yī)院制劑中心提供，批號080304）用植物油調(diào)勻配置成5 g/L的混懸液；FSK及H89（由谷歌生物有限公司提供，購自Sigma-Aldrich公司，貨號分別為F6886，B1427）分別配制成1×104 ng/ml及1×103 ng/ml的溶液；過氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、甘油三酯（TG）試劑盒、游離脂肪酸（FFA）試劑盒及蛋白測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3主要儀器 電熱恒溫水箱（S648型，上海醫(yī)療器械廠），TU-1800S紫外可見分光光度計(jì)（由北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)），ZX6006臺式高速離心機(jī)（法國Jouan公司產(chǎn)品）。

1.4造模 36只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為兩組：空白組6只，模型組30只。空白組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)，所有大鼠均自由飲水進(jìn)食。12 w后隨機(jī)處死空白組及模型組大鼠各2只，根據(jù)肝組織病理切片及生化檢測結(jié)果，以30%以上的肝細(xì)胞均已形成大泡伴小泡性脂肪變性，及肝臟脂肪含量水平上升為標(biāo)準(zhǔn)，確定造模成功[3]。

1.5給藥 造模結(jié)束后，將模型組大鼠隨機(jī)分為7組：模型組、易善復(fù)組、蔥白組、Camp激動劑Froskolin（FSK）組、PKA抑制劑H89組、蔥白-FSK組、蔥白-H89組，分別進(jìn)行灌胃及腹腔注射治療。模型組：生理鹽水10 ml/（kg·d）灌胃，生理鹽水0.5 ml/（kg·d）腹腔注射；易善復(fù)組：多烯磷脂酰膽堿溶液142.5 mg/（kg·d）灌胃，生理鹽水0.5 ml/（kg·d）腹腔注射；蔥白組：蔥白提取物混懸液50 mg/（kg·d）灌胃，生理鹽水0.5ml/（kg·d）腹腔注射；FSK組：生理鹽水10 ml/（kg·d）灌胃，F(xiàn)SK溶液0.5 ml/（kg·d）腹腔注射；H89組：生理鹽水10 ml/（kg·d）灌胃，H89溶液0.5 ml/（kg·d）腹腔注射；蔥白-FSK組：蔥白提取物混懸液50 mg/（kg·d）灌胃，F(xiàn)SK溶液0.5 ml/（kg·d）腹腔注射；蔥白-H89組：蔥白提取物混懸液50 mg/（kg·d）灌胃，H89溶液0.5 ml/（kg·d）腹腔注射。4 w后處死所有大鼠，采集血液和肝臟標(biāo)本，做好標(biāo)記后放入-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6觀察指標(biāo)及檢測

1.6.1一般情況 觀察大鼠毛發(fā)、精神及食欲等情況。

1.6.2血生化 測定血清甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）含量，采集血液標(biāo)本送交武漢市中西結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科完成。

1.6.3組織學(xué)病檢 肉眼觀察肝臟的外觀，將每只大鼠肝臟剪取1 cm×1 cm大小，4%多聚甲醛固定標(biāo)本，石蠟切片進(jìn)行HE染色，在光鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)情況。

1.6.4比色法測定肝組織TG、FFA、SOD、MDA含量 在相同部位精確稱取肝臟100 mg加入勻漿器中，用無水乙醇/生理鹽水0.9 ml在冰水浴中制成10%的均漿，4℃3000r/min離心10min，提取上清液測定TG、FFA及SOD、MDA的含量。余下操作按試劑盒說明書進(jìn)行。紫外分光光度計(jì)下比色，記錄吸光度值，按試劑盒給出的公式計(jì)算出組織中TG、FFA、SOD、MDA的含量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以mean±SD來表示，結(jié)果用單因素方差分析，組間用q檢驗(yàn)，P<0.05為有顯著差異性；P<0.01為有非常顯著差異性；P>0.05則為無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。軟件選用SPSS 19.0軟件包。

2 結(jié)果

2.1研究對象 正常對照組大鼠毛發(fā)光澤，食欲、食量、糞便及活動情況均正常，體重持續(xù)平穩(wěn)增加。模型組大鼠出現(xiàn)不同程度的精神萎靡，毛發(fā)黯淡，體重較正常大鼠減輕，食欲下降，活動度減少，反應(yīng)遲鈍。

2.2肝組織病理學(xué)變化 肉眼觀察正常組大鼠肝臟呈鮮紅色，表面光滑，邊緣銳利。模型組大鼠肝臟較正常明顯增大，呈淺黃色，邊緣變鈍，切面有明顯的油膩感，與周圍組織粘連明顯。在光鏡下，正常組大鼠肝臟基本無異常變化，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，無明顯脂滴分布。與正常組相比，模型組大鼠肝細(xì)胞可見重度的脂肪樣變性，肝細(xì)胞體積變大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見散在大小不等的圓形脂肪滴，匯管區(qū)可見炎癥細(xì)胞浸潤。與模型組比較，易善復(fù)組、蔥白組、蔥白-FSK組、蔥白-H89組肝細(xì)胞的脂肪變性程度均有不同程度的改善，以蔥白-FSK組的改善程度最明顯。

2.3血清TC、TG變化 與正常組相比，模型組TG、TC顯著增高；與模型組相比較，易善復(fù)組、蔥白組、蔥白-FSK組、蔥白-H89組TG、TC有不同程度的下降；與蔥白組相比較，蔥白-FSK組TG、TC水平下降，其差異有顯著性意義（P<0.05）；同樣與蔥白組相比，蔥白-H89組TG、TC含量則較高，其差異有顯著性意義（P<0.05）。見表1。

2.4肝組織中TG、FFA、SOD、MDA含量變化 與正常組相比，模型組大鼠肝組織TG、FFA、MDA含量明顯增高，SOD含量明顯下降；與模型組相比較，易善復(fù)組、蔥白組、蔥白-FSK組、蔥白-H89組TG、FFA、MDA水平均有不同程度的下降，SOD的活性有不同程度的提高；與蔥白組相比較，蔥白-FSK組TG、FFA、MDA水平下降，SOD水平升高，其差異有顯著性意義（P<0.05）；而與蔥白組比較，蔥白-H89組TG、FFA、MDA含量升高，SOD活性降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

NAFLD是各種原因?qū)е碌母闻K脂肪蓄積過多的一種病理狀態(tài)，主要是以肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)貯積為特征。目前公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制為"二次打擊"學(xué)說[2]：第一次打擊主要是各種原因引起的甘油三酯在肝臟中蓄積、排出障礙，引起脂肪肝的發(fā)生，這讓肝細(xì)胞變得容易受損傷；第二次打擊是氧化應(yīng)激導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，大量脂肪因子和細(xì)胞因子產(chǎn)生，使得脂肪變的肝細(xì)胞發(fā)生炎癥、壞死和纖維化。

祖國醫(yī)學(xué)多將NAFLD歸屬于"積聚"、"痰濁"、"瘀血"、"肝癖"、"脅痛"等病證的范疇，認(rèn)為其發(fā)生與機(jī)體陽氣不足或陽氣郁閉、氣機(jī)不暢有關(guān)。"陽氣不通"貫穿于疾病的始終，是疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4]。蔥白提取物為百合科植物蔥的近根部莖萃取處理后的產(chǎn)物，有很強(qiáng)的通陽作用[5]。筆者實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蔥白提取物能降低NAFLD大鼠脂質(zhì)水平，進(jìn)而改善肝臟脂肪過度堆積的狀態(tài)，降低肝組織中MDA的含量，提高SOD的活性，抑制NAFLD的進(jìn)一步發(fā)展，促進(jìn)肝組織的修復(fù)。

環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）是一種環(huán)狀核苷酸，被稱為細(xì)胞內(nèi)的第二信使。cAMP介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑即是其中之一。cAMP信號傳導(dǎo)通路在脂代謝的調(diào)節(jié)中起重要作用，它可將cAMP依賴的蛋白激酶A（cAMP-dependentprotein kinaseA，PKA）激活，進(jìn)而誘導(dǎo)一系列蛋白質(zhì)磷酸化，最后抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)合成。本試驗(yàn)采用cAMP激動劑FSK和PKA抑制劑H89作為對照，發(fā)現(xiàn)蔥白-FSK組比蔥白組更能改善肝臟脂肪沉積，減輕脂質(zhì)過氧化，而蔥白-H89組效果則及不上蔥白組，說明其機(jī)制可能與蔥白提取物激活了cAMP，介導(dǎo)了cAMP信號調(diào)節(jié)通路有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

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[3]江慶瀾，徐邦牢.多烯磷脂酰膽堿對非酒精性脂肪肝大鼠的干預(yù)效果[J].廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，33（4）：4-6.

[4]時(shí)昭紅，張介眉.鮮蔥白提取物防治非酒精性脂肪肝的實(shí)驗(yàn)研究[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2009，19（4）：229-231.

[5]時(shí)昭紅，王湘寧，張長弓，等.蔥白提取物對非酒精性脂肪肝大鼠的治療作用[J].世界華人消化雜志，2010，18（27）：2863-2868.

編輯/周蕓霏