張敏

[摘要]目的 探討普伐他汀對人胰腺癌細胞SW1990的作用及其聯(lián)合順鉑對該細胞增殖的影響。方法 采用MTT比色法檢測普伐他汀對SW1990細胞生長的抑制作用，采用流式細胞儀測定細胞的周期分布和凋亡率。順鉑、普伐他汀聯(lián)合順鉑作用細胞48 h后，采用MTT法測定各處理組的OD值，并計算相互作用指數(shù)（CI）。結果 1、5、10、15、25 μmol/L普伐他汀作用于SW1990細胞24～72 h，隨著藥物濃度增加和作用時間延長，處理組OD值不同程度下降（P<0.05），生長抑制率逐漸增大。0、5、15、25 μmol/L普伐他汀處理細胞48 h后，G0/G1期細胞逐漸增多，S期和G2/M期細胞逐漸減少，凋亡率由（2.74±0.92）%增加至（27.85±1.56）%。普伐他汀聯(lián)合順鉑作用細胞后，兩者的CI值均<1。結論 普伐他汀具有抑制胰腺癌細胞SW1990增殖和誘導該細胞凋亡的作用，并可阻滯細胞周期于G1期。普伐他汀聯(lián)合順鉑對SW1990細胞具有協(xié)同抗瘤作用。

[關鍵詞]普伐他??；順鉑；胰腺癌；增殖；凋亡；SW1990

[中圖分類號] R735.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）11（a）-0004-04

Influence of Pravastatin on human pancreatic cancer cell SW1990 and its synergistic antitumor effects with Cisplatin

ZHANG Min

Department of Internal Medicine-Oncology，People′s Hospital of Xingtai City in Hebei Province，Xingtai 054001，China

[Abstract]Objective To study the effects of Pravastatin on human pancreatic cancer cell SW1990 and the influence of combining Pravastatin and Cisplatin on the cells proliferation.Methods Inhibition of Pravastatin on SW1990 cells was measured by MTT colorimetric method，apoptosis rate and distribution of cell cycle were shown by flow cytometry.After the cells were treated with cisplatin，combining Pravastatin with Cisplatin for 48 hours，Proliferation was examined with MTT test，the OD values were computed，the combination index （CI） was calculated.Results SW1990 cells were treated with 1，5，10，15，25 μmol/L Pravastatin for 24 hours to 72 hours，with the increase of drug concentration and the prolongation of time，different levels of OD value in each treatment group decreased （P<0.05），the growth inhibition rate increased gradually.After the cells were treated with 0，5，15，25 μmol/L Pravastatin for 48 hours，the number of cells in G0/G1 phase increased gradually，while the number of cells in S phase and G2/M phase decreased gradually，and the apoptosis rate increased from （2.74±0.92）% to （27.85±1.56）%.The CI values of Cisplatin and Pravastatin were all less than 1 when the cells were treated with two drugs.Conclusion Pravastatin can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of SW1990 cells in vitro，and show an arrest of cell cycle in G1 phase.Combining Pravastatin with Cisplatin show a synergistic antitumor effect on SW1990 cells.

[Key words]Pravastatin；Cisplatin；Pancreatic cancer；Proliferation；Apoptosis；SW1990

胰腺癌預后差，在西方國家居惡性腫瘤死亡第4位，預計在未來十年內將上升至第2位[1]。在我國，胰腺癌位于惡性腫瘤死亡第9位。他汀類藥物是20世紀80年代研發(fā)的一類調脂藥物，可降低細胞內膽固醇生成。研究表明，他汀類藥物除了具有降低膽固醇的作用外，還具有抗腫瘤作用。本研究旨在探討普伐他汀對人胰腺癌細胞SW1990的影響及其聯(lián)合順鉑的抗瘤作用。

1材料與方法

1.1主要材料

人胰腺癌細胞株SW1990由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院科研中心惠贈；普伐他汀購自美國Sigma公司；胎牛血清為杭州四季青生物技術公司產品；四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）均購自美國Sigma公司；順鉑為市售齊魯制藥公司產品。

1.2細胞培養(yǎng)

在37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱內，將SW1990細胞置于含10%胎牛血清、含青霉素100 U/ml、含鏈霉素100 U/ml的RPMI-1640培養(yǎng)基中常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.3實驗方法

1.3.1 MTT比色法檢測細胞增殖 將對數(shù)生長期細胞接種于96孔板，用含不同濃度普伐他汀的RPMI-1640培養(yǎng)基換液培養(yǎng)24、48、72 h。實驗設空白對照組（空白培養(yǎng)基）、細胞對照組（不含普伐他?。┮约昂?、5、10、15、25 μmol/L普伐他汀的處理組，每組設6個平行孔。培養(yǎng)完成后加入MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h棄上清，上機于波長570 nm處測定吸光度（OD）值，并根據(jù)OD值計算細胞生長抑制率。生長抑制率（%）=（細胞對照組OD值-處理組OD值）/（細胞對照組OD值-空白對照組OD值）×100%。

1.3.2流式細胞儀檢測細胞周期分布和凋亡率 將對數(shù)生長期細胞接種于培養(yǎng)瓶中，加入0、5、15、25 μmol/L的普伐他汀處理48 h后收獲細胞，采用流式細胞儀對細胞進行DNA分析，計算細胞周期的時相分布和凋亡率。

1.3.3 MTT比色法檢測普伐他汀聯(lián)合順鉑對SW1990細胞的影響 將對數(shù)生長期的細胞制成單細胞懸液，接種于96孔板上。細胞貼壁生長后，加入含不同組別、不同濃度藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞，上機測OD值并計算不同組別細胞生長抑制率。實驗分組：空白對照組，細胞對照組，濃度為0.1、0.5、1.0 μg/ml單藥順鉑組，濃度為1、5、10 μmol/L普伐他汀分別聯(lián)合0.1、0.5、1.0 μg/ml順鉑組。

計算普伐他汀和順鉑的相互作用指數(shù)（combination index，CI），CI值=普伐他汀a/普伐他汀b+順鉑a/順鉑b，其中，普伐他汀a、順鉑a為兩藥聯(lián)合達到某一生長抑制率時各自的濃度，普伐他汀b、順鉑b為兩藥單獨應用達到相同生長抑制率時的各自的濃度。CI>1.0表明兩藥聯(lián)合具有拮抗作用，CI=1.0表明兩藥聯(lián)合具有相加作用或無關作用，CI<1.0表明兩藥聯(lián)合具有協(xié)同作用。

1.4統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1普伐他汀對SW1990細胞生長抑制率的影響

1、5、10、15、25 μmol/L普伐他汀處理細胞24～72 h，隨著藥物濃度的增加和作用時間延長，各處理組OD值不同程度下降（P<0.05），生長抑制率逐漸增高（圖1）。

2.2普伐他汀對SW1990細胞周期分布的影響

5、15、25 μmol/L普伐他汀作用SW1990細胞48 h后，和對照組比較，隨藥物濃度增大，G0/G1細胞逐漸增多，S期和G2/M期細胞逐漸減少（圖2）。

2.3普伐他汀對SW1990細胞凋亡的影響

SW1990細胞經(jīng)過不同濃度普伐他汀處理48 h后，空白對照組（0 μmol/L普伐他汀）的凋亡率為（2.74±0.92）%，5 μmol/L普伐他汀處理組的凋亡率為（7.34±1.23）%，15 μmol/L普伐他汀處理組的凋亡率為（15.76±2.18）%，25 μmol/L普伐他汀處理組的凋亡率為（27.85±1.56）%。各組的凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=800.971，P<0.05）。5 μmol/L普伐他汀處理組的凋亡率高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。15、25 μmol/L普伐他汀處理組的凋亡率顯著高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

2.4普伐他汀聯(lián)合順鉑對SW1990細胞增殖的影響

采用MTT比色法分析普伐他汀聯(lián)合順鉑對SW1990細胞增殖的作用，如表1所示。0.1、0.5、1.0 μg/ml順鉑作用于細胞后的OD值顯著低于對照組（0 μmol/L普伐他汀+0 μg/ml順鉑），差異有統(tǒng)計學意義（F=311.139，P<0.05）。1、5、10 μmol/L普伐他汀分別配伍聯(lián)合0.1、0.5、1.0 μg/ml順鉑，不同濃度普伐他汀聯(lián)合某一濃度順鉑后，聯(lián)合組的OD值顯著低于該濃度單藥順鉑組（0.1、0.5、1.0 μg/ml順鉑組，差異有統(tǒng)計學意義（F=404.575、383.930、88.359，均P<0.05）。

2.5普伐他汀聯(lián)合順鉑對SW1990細胞生長抑制率的影響

根據(jù)公式計算出普伐他汀聯(lián)合順鉑作用SW1990細胞后的生長抑制率并繪制成抑制率曲線（圖3）。結果顯示，普伐他汀聯(lián)合順鉑達到細胞生長抑制率為50%時的CI值，普伐他汀聯(lián)合順鉑的CI值均<1，提示普伐他汀和順鉑可協(xié)同抑制SW1990細胞增殖。

3討論

他汀類藥物通過抑制HMG-CoA還原酶阻滯內源性膽固醇合成過程中的甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）途徑，從而影響許多重要的生物學功能如細胞膜構成、蛋白異戊二烯化、細胞內信號轉導、細胞周期進程等[2]。越來越多的研究證實，他汀類藥物對多種腫瘤細胞具有抑制增殖、誘導分化和凋亡、抑制新生血管、預防浸潤轉移的作用[3-8]，且其對正常細胞沒有顯著毒副作用，具有良好的抗腫瘤前景。本實驗證明，普伐他汀對胰腺癌細胞SW1990具有抑制增殖、誘導凋亡的作用并能阻滯該細胞周期進程。

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)病隱匿，病情進展快，患者就診時多已發(fā)生局部浸潤或遠處轉移，80%以上的患者已無法行根治性手術。胰腺癌致死率高，5年生存率僅為1%～4%，即使手術聯(lián)合輔助化療，總生存率也≤30%[9-10]。近年來由于治療的進展，無法手術切除的局部晚期或轉移性胰腺癌患者的總生存期已延長至將近1年[11]，但總體而言，胰腺癌患者手術治愈率低，對放療不敏感，缺乏特異的靶點和高效的靶向藥物[12-13]，新興的免疫治療尚不成熟[14]，化療仍是進展期或轉移性胰腺癌的主要治療手段。順鉑為目前臨床最常用的化療藥物，抗瘤譜廣，順鉑聯(lián)合吉西他濱是治療胰腺癌常用的化療方案之一。

近年來，許多體內外實驗報道了他汀類藥物的放化療增敏作用。2012年的一項研究證實，在前列腺癌PC-3細胞中，阿伐他汀增強了放療的敏感性[15]。Martirosyan等[16]指出，洛伐他汀增強了阿霉素抑制卵巢癌細胞的作用。本實驗結果顯示，普伐他可增強順鉑的抑瘤作用。

綜上所述，普伐他汀具有抑制胰腺癌細胞SW1990增殖和誘導該細胞凋亡的作用，并可阻滯細胞周期于G1期。普伐他汀聯(lián)合順鉑對SW1990細胞具有協(xié)同抗瘤作用。

[參考文獻]

[1]Rahib L，Smith BD，Aizenberg R，et al.Projecting cancer incidence and deaths to 2030：the unexpected burden of thyroid，liver，and pancreas cancers in the United States[J].Cancer Res，2014，74（11）：2913-2921.

[2]Endo A.A historical perspective on the discovery of statins[J].Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci，2010，86（5）：484-493.

[3]Kotamaraju S，Williams CL，Kalyanaraman B.Statin-induced breast cancer cell death：role of inducible nitric oxide and arginase-dependent pathways[J].Cancer Res，2012，67（7）：7386-7394.

[4]Yamazaki H，Suzuki M，Aoki T，et al.Influence of 3-hy-droxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhitors on ubiquinone levels in rat skeletal muscle and heart：relationship to cytotoxicity and inhibitory activity for cholesterol synthesis in human skeletal muscle cells[J].J Atheroscler Thromb，2013，13（1）：295-307.

[5]Kah J，Wustenberg A，Keller AD，et al.Selective induction of apoptosis by HMG-GOA reductase inhibitors in hepatoma cells and dependence on p53 expression[J].Oncology，2012， 28（3）：1077-1083.

[6]Porfire A，Tomuta I，Muntean D，et al.Optimizing long-circulating liposomes for delivery of simvastatin to colon26 carcinoma cells[J].J Liposome Res，2014，25（4）：261-269.

[7]Yu X，Pan Y，Ma H，et al.Simvastatin inhibits proliferation and induces apoptosis in human lung cancer cells[J].Oncol Res，2013，20（8）：351-357.

[8]Spampanato C，Sarnataro M，Giordano E，et al.Simvastatin inhib- its cancer cell growth by inducing apoptosis correlated to activation of Bax and down-regulation of Bcl-2 gene expression[J].Int J Oncol，2012，40（4）：935-941.

[9]Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer statistics，2010[J].CA Cancer J Clin，2010，60（5）：227-300.

[10]Heberland J，Bertz J，Wolf U，et al.German cancer statistics 2004[J].BMC Cancer，2010，10：52.

[11]Li D，Xie K，Wolff R，et al.Pancreatic cancer[J].Lancet，2004，363（9414）：1049-1057.

[12]Rosell R，Carcereny E，Gervais R，et al.Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung caner（EURTAC）：a multicenter，open-label，randomized phase 3 trial[J].Lancet Oncol，2012， 13（3）：239-246.

[13]Zhou C，Wu YL，Chen G，et al.Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for pantients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung caner（OPTIMAL，CTONG-0802）：a multicentre，open-label，randomized，phase 3 study[J].Lancet Oncol，2011，12（8）：735-742.

[14]Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2015，65（1）：5-29.

[15]He Z，Mangala LS，Theriot CA，et al.Cell killling and radio-sensitizing effects of at orvastatin in PC-3 prostate cancer cells[J].J Radiat Res，2012，53（2）：225-233.

[16]Martirosyan A，Clendening JW，Goard CA，et al.Lovastatin induces apoptosis of ovarian cancer cells and synergizes with doxorubicin：potential therapeutic relevance[J].BMC Cancer，2010，10：103.

（收稿日期：2016-10-08 本文編輯：祁海文）