王彥利 李紀(jì)明 羅進(jìn)光

急性心肌梗死是全世界死亡和致殘的主要原因之一。在急性心肌梗死患者中，心肌再灌注可以打開(kāi)閉塞的冠狀動(dòng)脈，但會(huì)誘發(fā)心肌缺血再灌注（Ischemia reperfusion，IR）損傷［1-2］。心肌IR損傷是在缺氧或缺血一段時(shí)間后，當(dāng)血液供應(yīng)回到心臟組織時(shí)，導(dǎo)致額外的心肌損傷［3］。目前，對(duì)于心肌IR損傷的分子機(jī)制尚未完全闡明。因此，探究心肌IR損傷的細(xì)胞和分子機(jī)制對(duì)于發(fā)現(xiàn)新的心肌IR損傷治療策略具有重要意義。微小RNA（MicroRNA，miRNA/miR）是一類(lèi)高度保守的短鏈RNA［4］，多項(xiàng)研究已證明miRNA參與心肌IR損傷過(guò)程［5-6］。資料顯示，miR-137與缺氧誘導(dǎo)相關(guān)［7］，可以保護(hù)神經(jīng)元免受IR損傷［8］。但關(guān)于miR-137在心肌IR損傷中的作用鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以缺氧復(fù)氧刺激心肌細(xì)胞H9C2，構(gòu)建心肌IR損傷模型，觀察miR-137在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞增殖和凋亡的影響，進(jìn)一步探索其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

心肌細(xì)胞H9C2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，RIPA裂解液、MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Lipofectamine 2000、qPCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾有限公司，TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）檢測(cè)試劑盒、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所，β肌動(dòng)蛋白（β-actin）、SETD7、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3）抗體購(gòu)自美國(guó)Cellular Signaling Technology公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自博士德生物公司，miR-137、anti-miR-137、pcDNASETD7購(gòu)自廣州銳博生物有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

H9C2細(xì)胞加入DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)約80%時(shí)，加入胰酶消化、傳代。細(xì)胞轉(zhuǎn)染前，在6孔板接種1×105個(gè)/mL H9C2細(xì)胞，當(dāng)密度達(dá)約80%，按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)的指示，將miR-137、anti-miR-137、pcDNA-SETD7及各自陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。H9C2細(xì)胞隨機(jī)分為空白組（H9C2細(xì)胞）、缺氧復(fù)氧組（缺氧復(fù)氧處理H9C2細(xì)胞）、缺氧復(fù)氧組+miR-con（轉(zhuǎn)染miR-con，并進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理）、缺氧復(fù)氧+miR-137組（轉(zhuǎn)染miR-137，并進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理）、缺氧復(fù)氧+miR-137+pcDNA組（共轉(zhuǎn)染miR-137和pcDNA，并進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理）、缺氧復(fù)氧+miR-137+pcDNA-SETD7組（共轉(zhuǎn)染miR-137和pcDNA-SETD7，并進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理）。其中，缺氧復(fù)氧處理為缺氧6 h，復(fù)氧6 h。

1.3 qPCR檢測(cè)miR-137和SETD7 mRNA表達(dá)

TRIzol試劑提取H9C2細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以制成的cDNA為模板，U6為參照，依據(jù)qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行檢測(cè)。miR-137上游引物序列 5′-ACTCTCTTCGGTGACGGGTA-3′，下游引物序列5′-CGCTGGTACTCTCCTCGACT-3′，SETD7 mRNA上游引物序列 5′-CCCTGATGAAAGGACTGCCC-3′，下游引物序列 5，-TACACCGAACTTCCAGGCATC-3′。以 2-ΔΔCt法計(jì)算miR-137和SETD7 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 Western blot檢測(cè) SETD7、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)

RIPA裂解液提取H9C2細(xì)胞總蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDSPAGE），將其轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，5%脫脂奶粉封閉 1 h，加入1∶1 000稀釋的一抗，同時(shí)加入內(nèi)參β-actin一抗，4℃孵育過(guò)夜，次日充分洗膜，加入1∶5 000稀釋的二抗，孵育1 h，充分洗膜，進(jìn)行顯色，顯影，分析SETD7、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

96孔板中接種1×105個(gè)/mL H9C2細(xì)胞，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL MTT溶液，37℃培養(yǎng)4 h，棄上清，加150 μL DMSO，37℃搖床振蕩培養(yǎng)10 min，于酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔細(xì)胞在490 nm波長(zhǎng)處的吸光值（OD值），細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.6 比色法檢測(cè)LDH、MDA水平

H9C2細(xì)胞接種于96孔板，待密度達(dá)80%，按照LDH檢測(cè)試劑盒指示測(cè)定LDH活性。PBS裂解H9C2細(xì)胞，離心獲取上清，依據(jù)MDA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定MDA含量。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒步驟，H9C2細(xì)胞重懸后，加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，10 μL PI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育20 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

TargetScan 軟件（http：//www.targetscan.org/）預(yù)測(cè)出miR-137與SETD7的3′非編碼區(qū)（3′untranslated region，3′UTR）中部分堿基存在互補(bǔ)配對(duì)現(xiàn)象。構(gòu)建野生型 SETD7 3′UTR（WT-SETD7）和突變型SETD7 3′UTR（MUT-SETD7）報(bào)告質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染miR-con或miR-137，48 h后檢測(cè)雙熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與分析，結(jié)果以（）表示。兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧復(fù)氧處理對(duì)心肌細(xì)胞miR-137和SETD7表達(dá)的影響

與空白組比較，缺氧復(fù)氧明顯降低H9C2細(xì)胞中 miR-137表達(dá)量（P＜0.05，表 1），顯著提高SETD7 mRNA和蛋白水平（P＜0.05，表1、圖1）。

表1 缺氧復(fù)氧處理心肌細(xì)胞影響miR-137和SETD7表達(dá)（±s，n=9）Table 1 Effects of hypoxia-reoxygenation on the expression of miR-137 and SETD7 in cardiomyocytes（±s，n=9）

表1 缺氧復(fù)氧處理心肌細(xì)胞影響miR-137和SETD7表達(dá)（±s，n=9）Table 1 Effects of hypoxia-reoxygenation on the expression of miR-137 and SETD7 in cardiomyocytes（±s，n=9）

與空白組比較，aP＜0.05。

組別空白組缺氧復(fù)氧組t值P值miR-137 1.00±0.05 0.29±0.06a 27.272 0.000 SETD7 mRNA 1.00±0.14 4.78±0.08a 70.328 0.000 SETD7蛋白0.44±0.04 0.76±0.08a 10.733 0.000

圖1 心肌細(xì)胞中SETD7蛋白表達(dá)Figure 1 SETD7 protein expression in cardiomyocytes

2.2 上調(diào)miR-137表達(dá)促進(jìn)缺氧復(fù)氧處理心肌細(xì)胞增殖

相比于空白組，缺氧復(fù)氧顯著降低H9C2細(xì)胞中miR-137、Cyclin D1表達(dá)量和細(xì)胞存活率（P＜0.05，表 2、圖 2），明顯提高 LDH、MDA 水平（P＜0.05，表2）。相比于缺氧復(fù)氧+miR-con組，轉(zhuǎn)染miR-137顯著提高H9C2細(xì)胞內(nèi)miR-137、Cyclin D1表達(dá)量和細(xì)胞存活率（P＜0.05，圖2、表2），明顯降低LDH、MDA水平（P＜0.05，表2）。

圖2 心肌細(xì)胞中Cyclin D1蛋白表達(dá)Figure 2 Cyclin D1 protein expression in cardiomyocytes

2.3 上調(diào)miR-137表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡

與空白組相比，缺氧復(fù)氧顯著增加H9C2細(xì)胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平和細(xì)胞凋亡率（P＜0.05，表3、圖3）。與缺氧復(fù)氧+miR-con組相比，轉(zhuǎn)染miR-137明顯減少H9C2細(xì)胞中Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量和細(xì)胞凋亡率（P＜0.05，表3、圖3）。

表2 轉(zhuǎn)染miR-137促進(jìn)缺氧復(fù)氧處理心肌細(xì)胞存活率（±s，n=9）Table 2 Transfection of miR-137 promoted the survival rate of myocardial cells treated with hypoxia-reoxygenation（±s，n=9）

表2 轉(zhuǎn)染miR-137促進(jìn)缺氧復(fù)氧處理心肌細(xì)胞存活率（±s，n=9）Table 2 Transfection of miR-137 promoted the survival rate of myocardial cells treated with hypoxia-reoxygenation（±s，n=9）

與空白組比較，aP＜0.05；與缺氧復(fù)氧+miR-con組比較，bP＜0.05。

組別空白組缺氧復(fù)氧組缺氧復(fù)氧組+miR-con缺氧復(fù)氧+miR-137組F值P值miR-137 1.00±0.11 0.31±0.05a 0.28±0.04 4.97±0.50b 681.458 0.000 Cyclin D1 0.83±0.08 0.38±0.05a 0.42±0.04 0.68±0.06b 117.511 0.000 LDH（U/L）489.43±34.14 823.82±56.28a 842.78±63.39 621.58±52.77b 92.761 0.000 MDA（nmol/mL）4.67±0.43 13.58±1.28a 14.29±3.04 7.78±1.07b 63.423 0.000細(xì)胞存活率（%）100.00±5.37 56.46±4.86a 59.72±5.16 78.69±7.08b 112.307 0.000

表3 轉(zhuǎn)染miR-137抑制缺氧復(fù)氧處理心肌細(xì)胞凋亡（±s，n=9）Table 3 Transfection of miR-137 inhibited apoptosis of myocardial cells treated with hypoxia-reoxygenation（±s，n=9）

表3 轉(zhuǎn)染miR-137抑制缺氧復(fù)氧處理心肌細(xì)胞凋亡（±s，n=9）Table 3 Transfection of miR-137 inhibited apoptosis of myocardial cells treated with hypoxia-reoxygenation（±s，n=9）

與空白組比較，aP＜0.05；與缺氧復(fù)氧+miR-con組比較，bP＜0.05。

組別空白組缺氧復(fù)氧組缺氧復(fù)氧+miR-con組缺氧復(fù)氧+miR-137組t值P值Cleaved Caspase-3蛋白0.28±0.04 0.67±0.06a 0.71±0.07 0.54±0.05b 107.619 0.000細(xì)胞凋亡率（%）4.78±0.39 20.68±1.25a 22.36±1.39 10.38±1.08b 527.099 0.000

圖3 轉(zhuǎn)染miR-137影響缺氧復(fù)氧處理心肌細(xì)胞Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡Figure 3 Transfection of miR-137 affected Cleaved caspase-3 protein expression and apoptosis in cardiomyocytes treated with hypoxia-reoxygenation

2.4 miR-137靶向調(diào)控SETD7的表達(dá)

TargetScan軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，SETD7 3′UTR中含有與miR-137互補(bǔ)的核苷酸序列（圖4A）。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，WT-SETD7熒光素酶相對(duì)活性被 miR-137顯著抑制（P＜0.05），MUTSETD7熒光素酶相對(duì)活性無(wú)顯著變化P＞0.05（表4）。上調(diào)或下調(diào)miR-137顯著調(diào)控SETD7蛋白水平（P＜0.05，圖4B、表5）。

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（±s，n=9）Table 4 Dual luciferase reporting experiment（±s，n=9）

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（±s，n=9）Table 4 Dual luciferase reporting experiment（±s，n=9）

與miR-con組比較，aP＜0.05。

組別miR-con組miR-137組t值P值WT-SETD7 1.06±0.09 0.39±0.05a 19.523 0.000 MUT-SETD7 1.06±0.11 1.09±0.12 0.553 0.588

圖4 miR-137靶向調(diào)控SETD7的表達(dá)Figure 4 miR-137 targeted to regulate the expression of SETD7

2.5 上調(diào)SETD7部分逆轉(zhuǎn)miR-137對(duì)缺氧復(fù)氧處理心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

缺氧復(fù)氧組和缺氧復(fù)氧+miR-137組明顯影響 H9C2細(xì)胞Cyclin D1、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)、LDH活性、MDA含量、細(xì)胞存活率和細(xì)胞凋亡率（P＜0.05，表6、圖5）。缺氧復(fù)氧處理H9C2細(xì)胞中SETD7蛋白表達(dá)量明顯增加，轉(zhuǎn)染miR-137后，其表達(dá)量顯著降低（P＜0.05，表6、圖5）。

表5 miR-137靶向SETD7調(diào)控其表達(dá)（±s，n=9）Table 5 miR-137 targeted SETD7 to regulate its expression（±s，n=9）

表5 miR-137靶向SETD7調(diào)控其表達(dá)（±s，n=9）Table 5 miR-137 targeted SETD7 to regulate its expression（±s，n=9）

與miR-con組比較，aP＜0.05；與anti-miR-con組比較，bP＜0.05。

組別miR-con組miR-137組anti-miR-con組anti-miR-137組F值P值SETD7蛋白0.46±0.04 0.18±0.03a 0.49±0.05 0.78±0.06b 251.826 0.000

3 討論

資料顯示，氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡在心肌IR損傷中扮演著重要角色［9］。因此，抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡可能成為針對(duì)心肌IR損傷的策略和目標(biāo)。目前，缺氧復(fù)氧損傷已被廣泛用作心肌IR損傷體外模型［10］。本研究也利用缺氧復(fù)氧處理H9C2細(xì)胞構(gòu)建體外心肌IR損傷模型，評(píng)價(jià)miR-137在其中的作用。

表6 過(guò)表達(dá)SETD7部分逆轉(zhuǎn)miR-137對(duì)缺氧復(fù)氧處理心肌細(xì)胞的保護(hù)作用（±s，n=9）Table 6 Overexpression of SETD7 partially reversed the protective effect of miR-137 on myocardial cells treated with hypoxia and reoxygenation（±s，n=9）

表6 過(guò)表達(dá)SETD7部分逆轉(zhuǎn)miR-137對(duì)缺氧復(fù)氧處理心肌細(xì)胞的保護(hù)作用（±s，n=9）Table 6 Overexpression of SETD7 partially reversed the protective effect of miR-137 on myocardial cells treated with hypoxia and reoxygenation（±s，n=9）

與空白組比較，aP＜0.05；與缺氧復(fù)氧+miR-con組比較，bP＜0.05；與缺氧復(fù)氧+miR-137+pcDNA組比較，cP＜0.05。

組別空白組缺氧復(fù)氧組缺氧復(fù)氧+miR-con組缺氧復(fù)氧+miR-137組缺氧復(fù)氧+miR-137+pcDNA組缺氧復(fù)氧+miR-137+pcDNA-SETD7組t值P值SETD7蛋白0.31±0.07 1.24±0.09a 1.14±0.11 0.64±0.07b 0.58±0.06 0.88±0.07c 176.638 0.000 Cyclin D1蛋白0.71±0.05 0.26±0.04a 0.19±0.03 0.58±0.06b 0.52±0.04 0.38±0.04c 180.671 0.000 Cleaved Caspase-3蛋白0.27±0.03 0.61±0.06a 0.71±0.07 0.47±0.06b 0.51±0.05 0.67±0.05c 77.640 0.000 LDH（U/L）467.27±36.29 853.14±50.25a 877.02±61.47 613.74±48.49b 602.78±62.37 751.58±49.61c 84.893 0.000 MDA（nmol/mL）4.55±0.46 14.21±1.33a 15.19±2.83 7.62±1.15b 7.08±1.28 11.25±1.28c 66.712 0.000細(xì)胞存活率（%）100.00±5.37 56.41±4.92a 59.35±5.44 78.56±7.37b 79.63±7.59 63.75±6.74c 60.796 0.000細(xì)胞凋亡率（%）3.54±0.32 21.46±4.86a 23.72±5.16 9.69±7.08b 11.72±5.16 16.69±7.08c 17.625 0.000

圖5 心肌細(xì)胞中SETD7、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)Figure 5 The protein expression of SETD7，Cyclin D1 and Cleaved caspase-3 in cardiomyocytes

大量證據(jù)表明，miRNA是心肌IR損傷等各種病理過(guò)程的重要調(diào)節(jié)因子［11］，如 miR-126［12］、miR-29b［13］。miR-137 被認(rèn)為是前列腺癌［14］、骨肉瘤［15］在內(nèi)的多種癌癥類(lèi)型的腫瘤抑制因子，同時(shí)參與缺血性星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷［16］和缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜疾?。?7］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-137在缺氧的小鼠腦中表達(dá)下調(diào)［7］，與本研究中缺氧復(fù)氧抑制miR-137表達(dá)一致。Cyclin D1是一種重要的有絲分裂原細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑，Cleaved Caspase-3與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，LDH是心肌損傷的標(biāo)志物，MDA是氧化應(yīng)激的產(chǎn)物之一，其含量高低可以反映細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷程度。在缺氧復(fù)氧刺激的心肌細(xì)胞損傷中，Cyclin D1蛋白表達(dá)、細(xì)胞存活率顯著降低，Cleaved Caspase-3蛋白水平、LDH、MDA水平、細(xì)胞凋亡率明顯提高［18-19］，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。miR-137促進(jìn)缺氧復(fù)氧處理H9C2細(xì)胞增殖、Cyclin D1表達(dá)，并抑制細(xì)胞凋亡、Cleaved Caspase-3、LDH和MDA水平，可以保護(hù)缺氧復(fù)氧刺激的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，其保護(hù)作用同樣出現(xiàn)在神經(jīng)元IR損傷中［8］。

miRNA通過(guò)轉(zhuǎn)錄后在各種生物活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。利用TargetScan工具和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)SETD7是miR-137的靶基因。研究表明，抑制SETD7表達(dá)顯著抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，減少ROS產(chǎn)生，通過(guò)下調(diào)Keap1和促進(jìn)Nrf2介導(dǎo)的抗氧化信號(hào)傳導(dǎo)，減弱缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷［20］。本實(shí)驗(yàn)中，缺氧復(fù)氧抑制SETD7表達(dá)，上調(diào)SETD7逆轉(zhuǎn)了miR-137對(duì)缺氧復(fù)氧處理心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。提示miR-137通過(guò)直接靶向SETD7實(shí)現(xiàn)對(duì)缺氧復(fù)氧處理心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

綜上所述，miR-137可以保護(hù)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)缺氧復(fù)氧處理的心肌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，機(jī)制與靶向調(diào)控SETD7表達(dá)有關(guān)，這為心肌IR損傷提供了新治療靶點(diǎn)。