李春桃 唐蘇婷 喻淋淋 徐云柯 郭 勇 李 波

(1 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院肝膽外科，四川省瀘州市 646000，電子郵箱：373632809@qq.com；2 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科，四川省瀘州市 646000)

肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI)是各種臨床病理過(guò)程和肝臟手術(shù)的主要并發(fā)癥，例如失血性休克、創(chuàng)傷、肝移植和肝切除術(shù)[1-3]。由于激活了氧化應(yīng)激、免疫應(yīng)答和細(xì)胞凋亡等過(guò)程，HIRI具有高發(fā)病率和高死亡率的特征[4-6]。目前，臨床上采用缺血預(yù)處理和藥物制劑來(lái)預(yù)防和減輕HIRI[7]，但是缺血預(yù)處理并不適用于所有HIRI患者，且目前可用的藥物制劑對(duì)HIRI的療效也有限[8]。目前尚無(wú)有效、規(guī)范的方法用于預(yù)防和減輕HIRI[9]。因此，明確HIRI發(fā)展的作用機(jī)制顯得尤為迫切。

細(xì)胞焦亡由Zychlinsky等[10]發(fā)現(xiàn)并命名，是一種有別于細(xì)胞凋亡的細(xì)胞程序性死亡，其典型特征是細(xì)胞膜快速破裂以及促炎因子的釋放[11]。目前，已經(jīng)在腦、心臟、腎臟、肝臟等多種臟器缺血再灌注損傷中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞焦亡的現(xiàn)象[12-18]。由此推測(cè)細(xì)胞焦亡參與HIRI的發(fā)生發(fā)展并可能發(fā)揮重要作用。黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)屬于具有200個(gè)氨基酸重復(fù)序列的造血干擾素誘導(dǎo)性核抗原家族，蛋白質(zhì)編碼區(qū)全長(zhǎng)1 032 bp，共編碼344個(gè)氨基酸，能響應(yīng)外源性病原微生物以及內(nèi)源性免疫應(yīng)激，形成炎性體復(fù)合物，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[19]。已有研究表明，HIRI小鼠肝組織中的AIM2蛋白表達(dá)水平上調(diào)[20]。然而，AIM2在HIRI介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡中是否發(fā)揮作用尚不清楚。本研究利用缺氧復(fù)氧干預(yù)L02細(xì)胞系以構(gòu)建HIRI體外模型，探究AIM2在缺氧復(fù)氧損傷介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 人正常肝細(xì)胞系L02購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)基(批號(hào)：42401042)、胎牛血清(批號(hào)：10099133C)、青鏈霉素雙抗(批號(hào)：15070063)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS；批號(hào)：10010023)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒購(gòu)自日本DOJINDO公司(批號(hào)：CK04)；FAM-FLICA半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-1試劑盒購(gòu)自美國(guó)ImmunoChemistry Technologies公司(批號(hào)：1904D)；組織裂解液(批號(hào)：R0010)以及高效化學(xué)發(fā)光試劑盒(批號(hào)：SW2020)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。二喹啉甲酸試劑盒(批號(hào)：23227)、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑(批號(hào)：L3000015)、針對(duì)AIM2的小干擾RNA(si-AIM2，批號(hào)：4392420)以及相應(yīng)的陰性對(duì)照(si-NC，批號(hào)：4457287)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fishier Scientific公司；抗Caspase-1兔多克隆抗體(批號(hào)：ab1872)、抗AIM2兔多克隆抗體(批號(hào)：ab93015)、抗白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β兔單克隆抗體(批號(hào)：ab9722)、抗IL-18兔多克隆抗體(批號(hào)：ab191152)、抗β-肌動(dòng)蛋白兔多克隆抗體(批號(hào)：ab5694)以及辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(批號(hào)：ab205718)均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：L02細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的培養(yǎng)瓶中，放置于5%二氧化碳、37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。每2 d換液1次，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至90%融合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2 缺氧復(fù)氧細(xì)胞模型的建立：將部分L02細(xì)胞接種在6孔板中(1×106個(gè)/孔)，常規(guī)培養(yǎng)24 h，400倍AE31型倒置顯微鏡(廈門(mén)麥克奧迪實(shí)業(yè)有限公司)下觀察細(xì)胞并收集細(xì)胞備用，設(shè)為空白對(duì)照。其余L02細(xì)胞轉(zhuǎn)入缺氧環(huán)境培養(yǎng)箱中，條件設(shè)置為37℃、1% O2、5%二氧化碳、94% N2，培養(yǎng)6 h后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)至37℃、5%二氧化碳、95%空氣的恒溫培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)，分別在復(fù)氧1 h、3 h、6 h、12 h、24 h后在400倍顯微鏡下觀察并收集細(xì)胞備用。

1.2.3 si-AIM2、si-NC轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞：按照說(shuō)明書(shū)的操作步驟，用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑分別將si-AIM2、si-NC轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞，分別作為缺氧復(fù)氧+si-AIM2組、缺氧復(fù)氧+si-NC組。轉(zhuǎn)染6 h后，更換為含10%胎牛血清但不含雙抗的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h，之后進(jìn)行缺氧培養(yǎng)6 h，復(fù)氧培養(yǎng)12 h并收集細(xì)胞備用，缺氧、復(fù)氧的方法同1.2.2。另取L02細(xì)胞分別作為缺氧復(fù)氧模型組、空白對(duì)照組，均不進(jìn)行轉(zhuǎn)染，前者采用1.2.2的方法進(jìn)行缺氧培養(yǎng)6 h、復(fù)氧培養(yǎng)12 h，而后者則在常氧條件下培養(yǎng)等量時(shí)長(zhǎng)，最后收集細(xì)胞備用。

1.2.4 細(xì)胞活性測(cè)定：采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性。將L02接種到96孔板中(7×103個(gè)/孔)，預(yù)培養(yǎng)24 h，然后分別按照1.2.2及1.2.3對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組及處理后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，避光孵育3 h。將MK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)設(shè)置在450 nm波長(zhǎng)并記錄OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.5 細(xì)胞焦亡率測(cè)定：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞焦亡率。參照文獻(xiàn)[21]，根據(jù)L02細(xì)胞中活化的Caspase-1和碘化丙啶的雙陽(yáng)性染色情況來(lái)評(píng)估細(xì)胞焦亡情況。收集經(jīng)1.2.2及1.2.3步驟干預(yù)后的L02細(xì)胞，用1 mL胰酶在37℃條件下消化1 min。消化后吸出胰酶，加入PBS，在室溫條件下1 000 r/min離心5 min，吸出PBS，重復(fù)3次。PBS重懸細(xì)胞，用FAM-FLICA Caspase-1和碘化丙啶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙染色，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。然后通過(guò)FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)：收集經(jīng)1.2.2及1.2.3步驟干預(yù)后的L02細(xì)胞，用裂解液裂解并提取蛋白質(zhì)，使用二喹啉甲酸試劑盒進(jìn)行蛋白定量，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)定量的蛋白進(jìn)行分離。將分離的蛋白轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯膜上，再將聚偏氟乙烯膜用5%脫脂乳封閉1 h，在4℃條件下將封閉后的聚偏氟乙烯膜分別與抗AIM2(1 ∶1 000)、Caspase-1(1 ∶1 000)、IL-1β(1 ∶1 000)、IL-18(1 ∶500)、β-肌動(dòng)蛋白(1 ∶200)的一抗共同孵育過(guò)夜，之后與二抗(1 ∶5 000)在室溫下孵育1 h，用高效化學(xué)顯影試劑盒使條帶可見(jiàn)，利用Image-Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計(jì)蛋白條帶灰度，根據(jù)β-肌動(dòng)蛋白灰度值對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行歸一化處理。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同復(fù)氧時(shí)間下L02細(xì)胞的形態(tài) 隨缺氧后復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)，L02細(xì)胞的形態(tài)損傷逐漸加劇，漂浮細(xì)胞團(tuán)塊逐漸增多。見(jiàn)圖1。

圖1 缺氧后復(fù)氧對(duì)L02細(xì)胞狀態(tài)的影響

2.2 不同復(fù)氧時(shí)間下L02細(xì)胞的活性 與空白對(duì)照組、缺氧復(fù)氧1 h組、缺氧復(fù)氧3 h組相比，缺氧復(fù)氧6 h、12 h、24 h組細(xì)胞活力下降(P<0.05)。缺氧復(fù)氧6 h、12 h、24 h組細(xì)胞活力依次下降(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同復(fù)氧時(shí)間對(duì)L02細(xì)胞活力的影響(x±s)

2.3 不同復(fù)氧時(shí)間下L02細(xì)胞的焦亡情況 與空白對(duì)照組比較，缺氧復(fù)氧 3 h、6 h、12 h、24 h組的Caspase-1/碘化丙啶陽(yáng)性率上升(P<0.05)；與缺氧復(fù)氧1 h、3 h組比較，缺氧復(fù)氧6 h、12 h、24 h組的Caspase-1/碘化丙啶陽(yáng)性率上升；缺氧復(fù)氧6 h、12 h、24 h組的Caspase-1/碘化丙啶陽(yáng)性率依次上升(均P<0.05)。見(jiàn)圖2和表2。

表2 不同復(fù)氧時(shí)間L02細(xì)胞Caspase-1/碘化丙啶陽(yáng)性率比較(x±s，%)

圖2 缺氧復(fù)氧對(duì)L02細(xì)胞Caspase-1/碘化丙啶陽(yáng)性率的影響

2.4 不同復(fù)氧時(shí)間下L02細(xì)胞AIM2蛋白及焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況 與空白對(duì)照組相比，缺氧復(fù)氧3 h、6 h、12 h、24 h組的AIM2蛋白表達(dá)水平上升(均P<0.05)；與缺氧復(fù)氧1 h組相比，缺氧復(fù)氧12 h、24 h組AIM2蛋白表達(dá)水平上升(均P<0.05)。與缺氧復(fù)氧3 h組相比，缺氧復(fù)氧24 h組AIM2蛋白表達(dá)水平上升(均P<0.05)；與空白對(duì)照組相比，缺氧復(fù)氧 6 h、12 h、24 h組的焦亡標(biāo)志物Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)水平上升(均P<0.05)；與缺氧復(fù)氧1 h組相比，缺氧復(fù)氧12 h、24 h組的Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)水平上升(均P<0.05)；與缺氧復(fù)氧3 h組相比，缺氧復(fù)氧12 h組的IL-1β以及缺氧復(fù)氧24 h組的Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)水平上升(均P<0.05)；與缺氧復(fù)氧6 h組相比，缺氧復(fù)氧24 h組Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)水平上升(均P<0.05)；與缺氧復(fù)氧12 h組相比，缺氧復(fù)氧24 h組Caspase-1、IL-1β表達(dá)水平上升(均P<0.05)。見(jiàn)表3和圖3。

表3 不同復(fù)氧時(shí)間L02細(xì)胞AIM2、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較(x±s)

圖3 缺氧復(fù)氧對(duì)L02細(xì)胞AIM2、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)的影響

2.5 干擾AIM2基因?qū)θ毖鯊?fù)氧后L02細(xì)胞活性的影響 與空白對(duì)照組相比，缺氧復(fù)氧模型組、缺氧復(fù)氧+si-NC組、缺氧復(fù)氧+si-AIM2組細(xì)胞活性下降(P<0.05)；缺氧復(fù)氧模型組和缺氧復(fù)氧+si-NC組細(xì)胞活性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而與缺氧復(fù)氧模型組、缺氧復(fù)氧+si-NC組相比，缺氧復(fù)氧+si-AIM2組細(xì)胞活性上升(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 4組L02細(xì)胞活性比較(x±s)

2.6 干擾AIM2基因?qū)θ毖鯊?fù)氧后L02細(xì)胞焦亡 與空白對(duì)照組相比，缺氧復(fù)氧模型組、缺氧復(fù)氧+si-NC組、缺氧復(fù)氧+si-AIM2組Caspase-1/碘化丙啶陽(yáng)性率升高(P<0.05)；缺氧復(fù)氧模型組和缺氧復(fù)氧+si-NC組Caspase-1/碘化丙啶陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與缺氧復(fù)氧模型組、缺氧復(fù)氧+si-NC組相比，缺氧復(fù)氧+si-AIM2組的Caspase-1/碘化丙啶陽(yáng)性率降低(P<0.05)。見(jiàn)表5和圖4。

表5 4組L02細(xì)胞Caspase-1/碘化丙啶陽(yáng)性率比較(x±s，%)

圖4 干擾AIM基因2對(duì)缺氧復(fù)氧下L02細(xì)胞Caspase-1/碘化丙啶陽(yáng)性率的影響

2.7 干擾AIM2基因?qū)θ毖鯊?fù)氧后L02細(xì)胞Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)水平 與空白對(duì)照組相比，缺氧復(fù)氧模型組、缺氧復(fù)氧+si-NC組的Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)水平，以及缺氧復(fù)氧+si-AIM2組的Caspase-1、IL-18蛋白表達(dá)水平升高(均P<0.05)；缺氧復(fù)氧模型組和缺氧復(fù)氧+si-NC組的Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與缺氧復(fù)氧模型組相比，缺氧復(fù)氧+si-AIM2組Caspase-1、IL-1β蛋白水平降低(均P<0.05)；與缺氧復(fù)氧+si-NC組相比，缺氧復(fù)氧+si-AIM2組Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)水平均下降(均P<0.05)。見(jiàn)圖5和表6。

圖5 干擾AIM2對(duì)缺氧復(fù)氧下L02細(xì)胞Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)的影響

表6 4組L02細(xì)胞Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

HIRI常見(jiàn)于肝臟切除或肝移植手術(shù)中，目前仍缺乏有效的干預(yù)手段[22]。細(xì)胞焦亡途徑可能是HIRI發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制，但在細(xì)胞層面上HIRI與細(xì)胞焦亡的關(guān)系，尚未見(jiàn)有研究報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)正常肝細(xì)胞系L02進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理以建立HIRI體外模型，發(fā)現(xiàn)隨缺氧后復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)，L02細(xì)胞的形態(tài)損傷逐漸加劇，漂浮細(xì)胞團(tuán)塊逐漸增多，CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組、缺氧復(fù)氧1 h組、缺氧復(fù)氧3 h組相比，缺氧復(fù)氧 6 h、12 h、24 h組細(xì)胞活力下降(P<0.05)，提示HIRI體外模型構(gòu)建成功，可用于后續(xù)研究。

細(xì)胞焦亡是新發(fā)現(xiàn)的一種伴隨炎癥的細(xì)胞程序性裂解死亡[23]。已有研究證實(shí)，細(xì)胞焦亡依賴于胱天蛋白酶家族的激活，其中經(jīng)典通路是Caspase-1激活并切割促炎性細(xì)胞因子前體以產(chǎn)生大量活性形式的IL-1β和IL-18[24]。此外，Caspase-1還可以切割熱解成孔蛋白-消皮素D，產(chǎn)生消皮素D的N端和C端，其中N端可以轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜，與細(xì)胞膜上的磷脂蛋白結(jié)合，觸發(fā)細(xì)胞膜穿孔，促進(jìn)炎性因子的釋放從而引發(fā)細(xì)胞焦亡[25-26]。本研究參照相關(guān)文獻(xiàn)[21]，以Caspase-1和碘化丙啶雙陽(yáng)性率來(lái)評(píng)估細(xì)胞焦亡率，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，缺氧復(fù)氧 3 h、6 h、12 h、24 h組的Caspase-1/碘化丙啶陽(yáng)性率上升；缺氧復(fù)氧6 h、12 h、24 h組的Caspase-1/碘化丙啶陽(yáng)性率高于缺氧復(fù)氧1 h、3 h組，且依次升高(P<0.05)。這提示隨缺氧后復(fù)氧時(shí)間的增加，Caspase-1/碘化丙啶陽(yáng)性率總體呈上升趨勢(shì)，表明L02細(xì)胞的細(xì)胞焦亡與缺氧后復(fù)氧有關(guān)。

AIM2是胞質(zhì)雙鏈DNA的傳感器，被病原微生物雙鏈DNA或自身免疫激活后，與細(xì)胞凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白和Caspase-1前體組成炎性小體復(fù)合物，剪切炎性細(xì)胞因子IL-1β前體和IL-18前體，并引發(fā)細(xì)胞焦亡[27-28]。Gao等[19]發(fā)現(xiàn)，由AIM2介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在放射性肺損傷中發(fā)揮重要作用，抑制AIM2的活化可以減輕放射性肺損傷。Liang等[29]則提出，抑制AIM2活性可以改善腦缺血再灌注損傷。本研究結(jié)果顯示，復(fù)氧6～24 h后，L02細(xì)胞AIM2蛋白和焦亡相關(guān)蛋白Caspase-1、IL-1β和IL-18表達(dá)水平升高，尤其是復(fù)氧24 h后，L02細(xì)胞以上蛋白的表達(dá)水平高于2個(gè)或2個(gè)以上不同復(fù)氧時(shí)間組，表明隨著缺氧復(fù)氧時(shí)間的增加，細(xì)胞焦亡不斷加劇，同時(shí)AIM2可能參與了細(xì)胞焦亡。

然而，缺氧復(fù)氧造成的細(xì)胞焦亡是否由AIM2介導(dǎo)還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究進(jìn)一步應(yīng)用小干擾RNA內(nèi)源性干擾AIM2基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，與缺氧復(fù)氧模型組和缺氧復(fù)氧+si-NC組比較，缺氧復(fù)氧+si-AIM2組細(xì)胞活性升高，而Caspase-1/碘化丙啶陽(yáng)性率、焦亡相關(guān)蛋白Caspase-1和IL-1β的表達(dá)水平均降低(P<0.05)，但缺氧復(fù)氧模型組和缺氧復(fù)氧+si-NC組之間差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；且缺氧復(fù)氧+si-AIM2組焦亡相關(guān)蛋白IL-18的表達(dá)水平亦低于缺氧復(fù)氧+si-NC組(P<0.05)。提示缺氧復(fù)氧引起的細(xì)胞焦亡與AIM2的活化有關(guān)，AIM2可能通過(guò)Caspase-1及炎性細(xì)胞因子誘發(fā)細(xì)胞焦亡。

綜上所述，AIM2參與缺氧后復(fù)氧誘導(dǎo)的L02細(xì)胞焦亡；干擾AIM2基因的表達(dá)可能通過(guò)抑制Caspase-1、IL-1β、IL-18的表達(dá)水平來(lái)改善缺氧后復(fù)氧引起的L02細(xì)胞焦亡。