王明晶，王曉磊，徐永清，李鳳蘭，王 旭，彭麗娜，李 飛，董佳敏，張俊峰，胡寶忠,*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030; 2.哈爾濱學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150086)

冬小麥膨脹素基因TaEXPB8、TaEXPB10的克隆及低溫表達(dá)分析

王明晶1，王曉磊2，徐永清1，李鳳蘭1，王 旭1，彭麗娜1，李 飛1，董佳敏1，張俊峰1，胡寶忠1,2*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030; 2.哈爾濱學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150086)

以冬小麥強(qiáng)抗寒品種東農(nóng)冬麥1號為試驗(yàn)材料，從其根中克隆膨脹素基因TaEXPB8、TaEXPB10，并分析其在低溫條件下的表達(dá)情況，為研究膨脹素基因與植物抗寒性之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明，在冬小麥強(qiáng)抗寒品種東農(nóng)冬麥1號根中克隆得到膨脹素基因TaEXPB8、TaEXPB10，二者分別編碼273、271個氨基酸，二者序列與GenBank上公布的序列同源性分別達(dá)到99.2%、99.6%。4 ℃、-10 ℃和-20 ℃的低溫脅迫處理均可誘導(dǎo)TaEXPB8、TaEXPB10基因在冬小麥強(qiáng)抗寒品種東農(nóng)冬麥1號根中表達(dá)，尤其是TaEXPB10基因，其受誘導(dǎo)程度高于TaEXPB8；兩基因在低抗寒品種濟(jì)麥22號中總體上不受誘導(dǎo)，甚至受到抑制。綜合比較發(fā)現(xiàn)，4 ℃、-10 ℃和-20 ℃低溫脅迫下，TaEXPB8、TaEXPB10基因在強(qiáng)抗寒品種東農(nóng)冬麥1號中的表達(dá)量均明顯高于低抗寒品種濟(jì)麥22號。據(jù)此推測膨脹素基因TaEXPB8、TaEXPB10與冬小麥根系的低溫脅迫耐受能力具有重要的相關(guān)性，有助于進(jìn)一步深入了解冬小麥根系的抗寒機(jī)制。

冬小麥； 膨脹素； 低溫處理； 表達(dá)分析

小麥?zhǔn)俏覈匾募Z食作物，可分為春小麥和冬小麥，我國以冬小麥的種植為主[1]。低溫是影響冬小麥生長的主要因素之一[2-3]。在寒冷的黑龍江省，只有強(qiáng)抗寒冬小麥品種東農(nóng)冬麥1號可以越冬，其可耐-30 ℃低溫，返青率大于85%[4-5]。因此，挖掘強(qiáng)抗寒冬小麥品種東農(nóng)冬麥1號中的抗寒基因?qū)τ谥参锟购N具有重要意義[6-8]。判斷寒地冬小麥經(jīng)歷了寒冷的冬季后第2年能否存活的關(guān)鍵是分蘗節(jié)和根系是否遭到侵害及損害[9]。根對植物的地上部分起著固著與支撐的作用，也是植物與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的場所，根還具有貯存合成有機(jī)物質(zhì)的功能，對植株生長、發(fā)育具有重要作用[10]。因此，研究強(qiáng)抗寒冬小麥品種東農(nóng)冬麥1號中的根系生長發(fā)育相關(guān)基因?qū)τ谥参锟购N具有重要意義。

近年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個與植物根系生長發(fā)育相關(guān)的基因，而膨脹素基因就是最典型的一類[11]。膨脹素是一類重要的引起細(xì)胞壁松弛的蛋白質(zhì)，在植物的生長發(fā)育方面特別是根形態(tài)建成方面具有非常重要的作用，如細(xì)胞生長、根毛形成、根系生長、種子萌發(fā)、葉原基形成、葉子生長發(fā)育、果實(shí)成熟、器官脫離、花粉管生長等[12-13]；另外，其在細(xì)胞壁修飾過程中及植物抗逆方面也具有不可忽視的作用[14-20]。膨脹素基因多屬于誘導(dǎo)表達(dá)型基因，易受激素、溫度、干旱、病原菌、機(jī)械損傷等各種因素誘導(dǎo)表達(dá)[21-24]。研究發(fā)現(xiàn)，膨脹素基因TaEXPB8、TaEXPB10在農(nóng)大3338號根中表達(dá)量較高[25]。為此，克隆強(qiáng)抗寒冬小麥品種東農(nóng)冬麥1號根中膨脹素基因TaEXPB8、TaEXPB10，并分析其在低溫條件下的表達(dá)情況，這對研究膨脹素基因與植物抗寒性之間的關(guān)系具有重要意義，同時也可為抗寒育種提供抗寒基因資源。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為寒地冬小麥品種東農(nóng)冬麥1號,屬強(qiáng)抗寒品種(Ⅰ級)；對照試驗(yàn)材料濟(jì)麥22號，為正常冬小麥品種(Ⅳ級)，均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥育種研究室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 低溫處理及取樣 東農(nóng)冬麥1號、濟(jì)麥22號種子經(jīng)過精選后，在培養(yǎng)室盆栽種植，按照常規(guī)種植管理。待其分蘗，分別將其移植到低溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)箱溫度分別為4 ℃、-10 ℃和-20 ℃，在處理0(對照)、6、12、24、36、48 h時取小麥根系，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 小麥根總RNA的提取使用天澤基因植物RNA提取試劑盒(天澤基因工程有限公司)，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(?；锟萍加邢薰?說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.3TaEXPB8、TaEXPB10基因的克隆 根據(jù)GenBank中TaEXPB8(登錄號為AY543542.1)、TaEXPB10(登錄號為AY543544.1)的序列，使用Primer Premier 5.0軟件在CDS兩側(cè)設(shè)計(jì)特異性引物，各得到1對能有效擴(kuò)增TaEXPB8、TaEXPB10編碼區(qū)的引物(表1)，引物由上海博仕生物醫(yī)學(xué)服務(wù)中心合成。以第1鏈cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為20 μL,包含cDNA 4.52 μL、RNase-free water 2.48 μL、隨機(jī)引物(100 pmol/L)1 μL、2×TS Reaction Mix 10 μL、Enzyme Mix 1 μL、gDNA Remover 1 μL；PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、61 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s，35個循環(huán)；72 ℃10 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收，連接到pEASY-T3克隆載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒鑒定后由北京金唯智公司測序。測序結(jié)果用DNAMAN軟件分析，并利用NCBI(http：//ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST在線進(jìn)行序列比對。

1.2.4 Real-time PCR(RT-PCR)擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中TaEXPB8(登錄號為AY543542.1)、TaEXPB10(登錄號為AY543544.1)的序列，通過Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)RT-PCR引物(表2)，引物由上海博仕生物醫(yī)學(xué)服務(wù)中心合成。所用內(nèi)參基因?yàn)棣?actin。采用SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為20 μL，包含SYBR?qPCR Mix 10 μL、PCR 上下游引物(10 pmol/μL)各 0.5 μL、ROX Reference Dve(50×) 0.4 μL、cDNA 2.0 μL、ddH2O 6.6 μL；擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s， 40個循環(huán)；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、95 ℃ 30 s。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

表2 RT-PCR引物及其序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)方差分析釆用DPS 7.05，差異顯著性多重比較釆用Duncan氏新復(fù)極差法，相關(guān)性分析釆用SPSP 19.0，圖表制作采用Excel 2013。

2 結(jié)果與分析

2.1TaEXPB8和TaEXPB10基因的克隆及序列分析

將強(qiáng)抗寒冬小麥品種東農(nóng)冬麥1號根總RNA反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA，然后用設(shè)計(jì)好的TaEXPB8、TaEXPB10編碼區(qū)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到大約820、810 bp的條帶(圖1)，與預(yù)期TaEXPB8、TaEXPB10的大小相符，初步推測為目的基因。將PCR產(chǎn)物與pEASY-T3載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α后，經(jīng)藍(lán)白斑篩選挑選陽性克隆進(jìn)行測序。測序發(fā)現(xiàn)，寒地冬小麥東農(nóng)冬麥1號的TaEXPB8、TaEXPB10基因CDS分別為819、813 bp，分別編碼273、271個氨基酸。將其序列經(jīng)DANMAN及BLAST進(jìn)行序列比對發(fā)現(xiàn)，所測序列與GenBank中的TaEXPB8(登錄號為AY543542.1)、TaEXPB10(登錄號為AY543544.1)序列的同源性分別達(dá)到99.2%、99.6%，表明TaEXPB8和TaEXPB10克隆成功。

M．DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)2000; 1.TaEXPB8; 2.TaEXPB10圖1 TaEXPB8、TaEXPB10基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2TaEXPB8和TaEXPB10基因在低溫條件下的表達(dá)分析

2.2.1 4 ℃ 由圖2可知，在正常條件下，東農(nóng)冬麥1號和濟(jì)麥22號根中TaEXPB8、TaEXPB10基因表達(dá)量基本一致。在4 ℃條件下，東農(nóng)冬麥1號根中TaEXPB8基因表達(dá)量總體隨低溫處理時間延長先升高后降低并趨于平穩(wěn)，在6 h迅速升高，達(dá)到最大值，而后迅速下降，推測4 ℃條件下東農(nóng)冬麥1號根中TaEXPB8基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應(yīng)是一個快速的過程；而濟(jì)麥22號根中TaEXPB8基因表達(dá)量總體隨脅迫時間延長無明顯變化；TaEXPB8基因在東農(nóng)冬麥1號根中的誘導(dǎo)表達(dá)程度高于濟(jì)麥22號，尤其在低溫脅迫6 h時。

濟(jì)麥22號和東農(nóng)冬麥1號根中TaEXPB10基因表達(dá)量總體均隨著低溫脅迫時間的延長先升高后降低，濟(jì)麥22號在低溫脅迫6 h達(dá)到最大值，東農(nóng)冬麥1號在24 h達(dá)到最大值，但濟(jì)麥22號峰值提高幅度遠(yuǎn)低于東農(nóng)冬麥1號；TaEXPB10基因在東農(nóng)冬麥1號根中的誘導(dǎo)表達(dá)程度高于濟(jì)麥22號，尤其在低溫脅迫24 h時，其表達(dá)量迅速升高，推測4 ℃條件下在東農(nóng)冬麥1號根中TaEXPB10基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應(yīng)是一個緩慢的過程。

綜合比較發(fā)現(xiàn)，4 ℃低溫脅迫可以誘導(dǎo)TaEXPB8、TaEXPB10基因在東農(nóng)冬麥1號根中表達(dá)，尤其是TaEXPB10基因，其受誘導(dǎo)程度高于TaEXPB8基因；4 ℃低溫脅迫可以誘導(dǎo)TaEXPB10基因在濟(jì)麥22號根中表達(dá)。推測在4 ℃低溫脅迫條件下TaEXPB8、TaEXPB10基因可能促進(jìn)冬小麥根系生長，尤其是TaEXPB10基因。

A.TaEXPB8; B.TaEXPB10; DN1.東農(nóng)冬麥1號; JM22.濟(jì)麥22號；**、*分別表示與對照差異極顯著(P<0.01)、顯著(P<0.05)，下同圖2 4 ℃條件下TaEXPB8和TaEXPB10基因在冬小麥根中的表達(dá)情況

2.2.2 -10 ℃ 由圖3可知，在-10 ℃條件下，東農(nóng)冬麥1號根中TaEXPB8基因表達(dá)量總體隨著低溫脅迫時間的延長先升高后降低，在24 h時迅速升高，達(dá)到峰值，而后迅速下降，推測-10 ℃條件下東農(nóng)冬麥1號根中TaEXPB8基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應(yīng)是一個緩慢的過程；而濟(jì)麥22號根中TaEXPB8基因表達(dá)量總體隨脅迫時間延長無明顯變化，僅48 h明顯降低。東農(nóng)冬麥1號根中TaEXPB10基因表達(dá)量總體隨著低溫脅迫時間的延長先升高后降低，在6 h時出現(xiàn)明顯的升高，在12 h時達(dá)到最大值，而后有所下降，但表達(dá)量仍處于相對較高的水平，推測-10 ℃條件下東農(nóng)冬麥1號根中TaEXPB10基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應(yīng)是一個快速且持久的過程；而濟(jì)麥22號根中TaEXPB10基因表達(dá)量總體隨脅迫時間延長呈降低趨勢而后趨于平穩(wěn)。綜上，東農(nóng)冬麥1號根中TaEXPB8、TaEXPB10基因受-10 ℃低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，且TaEXPB10基因持續(xù)高表達(dá)時間比較久。

2.2.3 -20 ℃ 由圖4可知,在-20 ℃條件下，東農(nóng)冬麥1號根中TaEXPB8基因表達(dá)量總體隨著低溫脅迫時間的延長先升高后降低，在12 h時迅速升高，達(dá)到最大值，而后迅速下降，推測-20 ℃條件下東農(nóng)冬麥1號根中TaEXPB8基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應(yīng)是一個緩慢的過程；而濟(jì)麥22號根中TaEXPB8基因表達(dá)量總體隨脅迫時間延長無明顯變化。東農(nóng)冬麥1號根中TaEXPB10基因表達(dá)量總體隨著低溫脅迫時間的延長先升高后降低，在6 h時出現(xiàn)明顯的升高，而后有所下降，但表達(dá)量仍處于相對較高的水平，48 h時才明顯下降，推測-20 ℃條件下東農(nóng)冬麥1號根中TaEXPB10基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應(yīng)是一個快速且持久的過程；而濟(jì)麥22號根中TaEXPB10基因表達(dá)量總體隨脅迫時間延長無明顯變化。綜上，東農(nóng)冬麥1號根中TaEXPB8、TaEXPB10基因受-20 ℃低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，且TaEXPB10基因持續(xù)高表達(dá)時間比較久。

圖4 -20 ℃條件下TaEXPB8和TaEXPB10基因在冬小麥根中的表達(dá)情況

3 結(jié)論與討論

低溫寒害是冬小麥生長過程中經(jīng)常遇到的逆境危害，嚴(yán)重時會造成冬小麥死亡。因此，研究冬小麥抗寒基因的表達(dá)對高寒地區(qū)尤為重要[26-28]。本研究結(jié)果表明，低溫脅迫會誘導(dǎo)TaEXPB8和TaEXPB10基因在東農(nóng)冬麥1號的根系中表達(dá)，4 ℃低溫脅迫條件下，TaEXPB8基因快速響應(yīng)低溫脅迫，但持續(xù)時間較短；TaEXPB10基因慢速響應(yīng)低溫脅迫，且持續(xù)時間較長。-10 ℃低溫脅迫下，TaEXPB8基因緩慢響應(yīng)低溫脅迫，持續(xù)時間較短且不平穩(wěn)；TaEXPB10基因快速響應(yīng)低溫脅迫，持續(xù)時間持久且相對穩(wěn)定。-20 ℃低溫脅迫下，TaEXPB8基因緩慢響應(yīng)低溫脅迫，持續(xù)時間短；TaEXPB10基因快速響應(yīng)低溫脅迫，持續(xù)時間持久且相對穩(wěn)定。說明這2個膨脹素基因可能參與東農(nóng)冬麥1號抵御低溫脅迫的過程。TaEXPB8和TaEXPB10基因在不同的溫度、時期，其表達(dá)量存在一些明顯差異，說明雖是同一個亞家族的成員，但其功能也存在著一些明顯的差異。其中，TaEXPB10基因與寒地冬小麥根系生長和發(fā)育的關(guān)系更緊密一些，且可能與東農(nóng)冬麥1號具有抗寒性的特性有較大的關(guān)系。

已有研究表明，冬小麥根系的生長發(fā)育與膨脹素基因以及土壤中水分含量均有著密切的關(guān)系[29]。就整個生長期來看，單個基因及單種外界因素不能決定冬小麥的抗寒性，冬小麥的抗寒性應(yīng)該是多個基因以及多種外界因素共同協(xié)作的結(jié)果[30-31]。在膨脹素基因家族中，不同的亞家族成員之間可能還存在著主效基因和從效基因的區(qū)別。從本研究結(jié)果來看，TaEXPB10基因的表達(dá)相對更重要一些。綜合本研究結(jié)果推測，TaEXPB8和TaEXPB10基因的過量表達(dá)有可能促進(jìn)寒地冬小麥根系生長發(fā)育，提高其抗寒性，但這還需要進(jìn)一步的深入研究驗(yàn)證。

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Cloning of TaEXPB8 and TaEXPB10 in Winter Wheat and Their Expression Analysis under Low Temperature Condition

WANG Mingjing1,WANG Xiaolei2,XU Yongqing1,LI Fenglan1,WANG Xu1,PENG Lina1,LI Fei1,DONG Jiamin1,ZHANG Junfeng1,HU Baozhong1,2*

(1.College of Life Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Harbin University,Harbin 150086,China)

The cold-resistant winter wheat variety Dongnongdongmai No.1 was used as experimental material.The expansin genesTaEXPB8 andTaEXPB10 were cloned from its roots,and their expression profiles were analyzed under low temperature conditions,so as to lay a foundation for study of the relationship between expansin genes expression and the plant cold resistance.The results showed that the expansin genesTaEXPB8 andTaEXPB10 were cloned from cold-resistant winter wheat variety Dongnongdongmai No.1,which coded 273 and 271 amino acids,respectively.In addition,they shared 99.2% and 99.6% homology separately with the published sequence in GenBank.Besides,4 ℃,-10 ℃ and -20 ℃ could induce the expression ofTaEXPB8 andTaEXPB10 in roots of Dongnongdongmai No.1.Especially forTaEXPB10,it had higher inducing level thanTaEXPB8.However,these two genes were not induced in Jimai No.22 (cold susceptible variety) on a whole,even were suppressed.Taken together,we found that under 4 ℃,-10 ℃ and -20 ℃,the expression level ofTaEXPB8 andTaEXPB10 in Dongnongdongmai No.1 (cold resistant variety) were all significantly higher than that in Jimai No.22(cold susceptible variety).Thus,it had been postulated that the expansin genesTaEXPB8 andTaEXPB10 had great relevance with low temperature stress tolerance ability of the roots of Dongnongdongmai No.1.It also provided further understanding on the cold resistance mechanism in winter wheat root system.

winter wheat； expansin； low temperature treatment； expression analysis

2016-07-20

國家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金(J1210069)

王明晶(1989-)，女，黑龍江鐵力人，在讀碩士研究生，研究方向：植物學(xué)。E-mail：648336388@qq.com

*通訊作者：胡寶忠(1962-)，男，吉林吉林人，教授，博士，主要從事植物學(xué)研究。E-mail：bzhu@neau.edu.cn

S512

A

1004-3268(2017)02-0006-06