枯草芽孢桿菌J-4菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)發(fā)酵條件優(yōu)化

翟玉潔，鄧祖麗穎，姜軍坡，王世英*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河北 保定 071001; 2.鄭州幼兒師范高等?？茖W(xué)校，河南 鄭州 450000)

枯草芽孢桿菌J-4菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)發(fā)酵條件優(yōu)化

翟玉潔1，鄧祖麗穎2，姜軍坡1，王世英1*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河北 保定 071001; 2.鄭州幼兒師范高等?？茖W(xué)校，河南 鄭州 450000)

為了提高枯草芽孢桿菌J-4菌株發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的含量，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法，對(duì)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽含量)和發(fā)酵條件(發(fā)酵時(shí)間、裝液量、發(fā)酵溫度、接種量)進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成為葡萄糖1.00%、黃豆餅粉1.00%、MgSO40.15%、Na2HPO40.10%、NaH2PO40.10%；發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間36 h、裝液量100 mL(250 mL)、發(fā)酵溫度37 ℃、搖瓶接種量5%。在此條件下，枯草芽孢桿菌J-4菌株抑菌圈面積提高50.25%。

枯草芽孢桿菌； 抑菌物質(zhì)； 優(yōu)化； 正交試驗(yàn)

枯草芽孢桿菌具有生物奪氧、拮抗致病微生物、增強(qiáng)動(dòng)物體免疫功能、產(chǎn)生多種消化酶等作用[1]?？莶菅挎邨U菌J-4菌株是從健康青年雞糞便中分離篩選出的具有體外抗大腸桿菌活性的優(yōu)良菌株[2]；飼料中添加0.1%的J-4菌劑，可使肉雞的平均日增體質(zhì)量提高11.99%，料重比降低11.03%[3]。研究發(fā)現(xiàn)，J-4菌株胞外產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)可以被60%飽和度硫酸銨所沉淀，并可被胃蛋白酶和胰蛋白酶所降解，故初步推測(cè)該菌株所分泌的抗菌物質(zhì)為肽類物質(zhì)。目前，關(guān)于枯草芽孢桿菌J-4菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)的發(fā)酵條件研究較少。為此，以抑菌圈面積為指標(biāo)，利用瓊脂打孔擴(kuò)散法[4]，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，研究枯草芽孢桿菌J-4菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)的適宜發(fā)酵條件，以期為該菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)的分離純化和抑菌機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)J-4菌株篩選自健康肉雞糞便；大腸桿菌(Escherichiacoli)由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程系實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基的組成及配制方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[5]。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基組成：蔗糖1.00%、蛋白胨1.00%、Na2HPO40.20%、NaH2PO40.20%、MgSO40.05%、CaCl20.02%，pH值7.0～7.2。

1.3 J-4菌株種子液的制備

將活化好的J-4菌株用滅菌竹簽刮取斜面菌苔接種到含有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12 h，備用。

1.4 J-4菌株產(chǎn)抑菌物活性測(cè)定

1.4.1 病原指示菌平板的制備 將5 mL無(wú)菌水加入活化好的大腸桿菌的斜面試管中，用滅菌竹簽刮取大腸桿菌菌苔后倒入另一支滅菌試管中，在漩渦振蕩器上振蕩30～60 s，制成均勻的單細(xì)胞菌懸液。按照5%的接種量將菌懸液加入55 ℃的NA培養(yǎng)基中，搖勻，立即倒平板。

1.4.2 抑菌物質(zhì)活性測(cè)定 在病原菌平板上用打孔器按一定間距均勻打孔。將發(fā)酵液5 000 r/min離心10 min，取上清液50 μL，加入到以上平板的孔中，然后水平放置37 ℃恒溫箱中，24 h后觀察測(cè)定抑菌圈的面積。

1.5 J-4菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)培養(yǎng)條件的優(yōu)化

采用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，分別測(cè)量并記錄抑菌圈面積。基礎(chǔ)發(fā)酵條件：培養(yǎng)時(shí)間48 h、裝液量50 mL(250 mL)、接種量2%、溫度37 ℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、pH值7.0。

1.5.1 搖瓶裝液量 利用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量分別為25 mL(250 mL)、50 mL(250 mL)、75 mL(250 mL)、100 mL(250 mL)、125 mL(250 mL)、150 mL(250 mL)，其余發(fā)酵條件同基礎(chǔ)發(fā)酵。

1.5.2 搖瓶溫度 利用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基和最優(yōu)裝液量，分別于25、28、31、34、37、40、43 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)，其余條件同基礎(chǔ)發(fā)酵。

1.5.3 接種量 利用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基、最優(yōu)裝液量和最優(yōu)培養(yǎng)溫度，分別接入1%、3%、5%、7%、9%、11%的J-4菌株的種子液，其余條件同基礎(chǔ)發(fā)酵。

1.5.4 發(fā)酵時(shí)間 利用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基和以上最優(yōu)條件，分別發(fā)酵12、18、24、30、36、42、48、54、60 h，其余條件同基礎(chǔ)發(fā)酵。

1.6 發(fā)酵培養(yǎng)基組成的優(yōu)化

1.6.1 單因素試驗(yàn) 采用上述優(yōu)化的發(fā)酵條件，每個(gè)因素進(jìn)行3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，分別測(cè)量J-4菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌圈面積。

1.6.1.1 碳源種類 分別用葡萄糖、糊精、玉米粉、淀粉、乳糖、甘露醇代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的蔗糖，加入比例均為1.00%，其余成分不變。

1.6.1.2 氮源種類 用酵母粉、黃豆餅粉、尿素、胰蛋白胨、硝酸鈉、硫酸銨、牛肉膏代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨，加入比例均為1.00%，碳源為依據(jù)試驗(yàn)確定的最適碳源，含量均為1.00%，其余成分不變。

1.6.1.3 無(wú)機(jī)鹽種類 用MgSO4、CaCl2、MnSO4、FeSO4、ZnSO4、CuSO4代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的MgSO4，加入比例均為0.10%，依據(jù)試驗(yàn)確定出的最適碳源和氮源，含量均為1.00%，其余成分不變。

1.6.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及作為緩沖對(duì)的Na2HPO4-NaH2PO4(1∶1)進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，采用1.5優(yōu)化后的培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵，以抑菌圈面積為指標(biāo)，比較不同配比組合對(duì)抑菌能力的影響。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 培養(yǎng)基組成的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) %

2 結(jié)果與分析

2.1 J-4菌株發(fā)酵產(chǎn)抑菌物質(zhì)培養(yǎng)條件的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 搖瓶裝液量 從圖1可以看出，搖瓶裝液量在25 mL(250 mL)～100 mL(250 mL)時(shí)，抑菌圈面積隨裝液量增加逐漸增大；當(dāng)裝液量為100 mL(250 mL)時(shí)，抑菌圈面積最大；當(dāng)裝液量大于100 mL(250 mL)時(shí)，抑菌圈面積隨裝液量增加逐漸減少。因此，確定該菌株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)抑菌物質(zhì)的最適裝液量為100 mL(250 mL)。

圖1 不同搖瓶裝液量對(duì)抑菌圈面積的影響

2.1.2 搖瓶溫度 從圖2可以看出，當(dāng)發(fā)酵溫度小于37 ℃時(shí)，隨著發(fā)酵溫度的升高，抑菌圈面積不斷增大；當(dāng)發(fā)酵溫度大于37 ℃時(shí)，隨著發(fā)酵溫度的升高，抑菌圈面積反而減??；當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，抑菌圈面積達(dá)到最大，故37 ℃為最適發(fā)酵溫度。

圖2 不同搖瓶溫度對(duì)抑菌圈面積的影響

2.1.3 接種量 從圖3可以看出，接種量在1%～5%時(shí)，隨接種量增加，抑菌圈面積逐漸增加；接種量在5%～12%時(shí)，隨接種量增加，抑菌圈面積逐漸減小，最終趨于平穩(wěn)；接種量為5%時(shí)，抑菌圈面積最大。因此，以接種量5%作為最佳接種量。

圖3 不同接種量對(duì)抑菌圈面積的影響

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間 從圖4可以看出，在0～36 h，隨發(fā)酵時(shí)間增加，抑菌圈面積逐漸增大，36 h對(duì)應(yīng)的抑菌圈面積最大，為4.32 cm2，36 h后抑菌圈面積逐漸減小，說(shuō)明36 h的發(fā)酵效果最好。故選擇36 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌圈面積的影響

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基組成的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 單因素試驗(yàn)

2.2.1.1 碳源 由圖5可知，供試的7種碳源中葡萄糖為碳源時(shí)所產(chǎn)生的抑菌圈面積最大，且價(jià)格低廉，適于發(fā)酵生產(chǎn)。因此，確定葡萄糖為最適碳源。

圖5 不同碳源對(duì)抑菌圈面積的影響

2.2.1.2 氮源 由圖6可知，以尿素為氮源時(shí)無(wú)抑菌圈，說(shuō)明該菌株不能利用無(wú)機(jī)氮源，在所有供試氮源中，以黃豆餅粉的效果最好，抑菌圈面積最大。因此，選擇黃豆餅粉為最適氮源。

圖6 不同氮源對(duì)抑菌圈面積的影響

2.2.1.3 無(wú)機(jī)鹽 由圖7可知，供試的5種無(wú)機(jī)鹽均可產(chǎn)生透明的抑菌圈，MgSO4產(chǎn)生的抑菌圈面積最大。因此，選擇MgSO4為最適無(wú)機(jī)鹽。

圖7 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)抑菌圈面積的影響

2.2.2 正交試驗(yàn)

2.2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析 由表2可知，4種因素對(duì)抑菌圈面積的影響大小為：C>A>B>D，即MgSO4>葡萄糖>黃豆餅粉>緩沖對(duì)。其最優(yōu)組合為A3B3C3D1，即葡萄糖1.50%、黃豆餅粉1.50%、MgSO40.15%、Na2HPO4-NaH2PO40.30%。

2.2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證 將正交試驗(yàn)的最優(yōu)結(jié)果A3B3C3D1與正交表中抑菌圈面積最大組合A2B2C3D1

進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，正交試驗(yàn)最優(yōu)培養(yǎng)基A3B3C3D1對(duì)應(yīng)的平均抑菌圈面積為5.74 cm2，而A2B2C3D1組合的平均抑菌圈面積為5.95 cm2，故最佳培養(yǎng)基配方為A2B2C3D1，即葡萄糖1.00%、黃豆餅粉1.00%、MgSO40.15%、Na2HPO4-NaH2PO40.10%。基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)的抑菌圈面積為3.96 cm2，最佳培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)的抑菌圈面積增加了1.99 cm2，比基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基提高50.25%。

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基組成的正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)最優(yōu)培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)抑菌物質(zhì)能力的驗(yàn)證結(jié)果

3 結(jié)論與討論

由于抑菌圈面積與胞外抑菌物質(zhì)含量的對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系[6]，所以通過(guò)培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件的優(yōu)化極大地提高了J-4菌株胞外抑菌物質(zhì)的產(chǎn)量。不同培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵條件均可影響抑菌物質(zhì)的產(chǎn)量。宋浩等[7]發(fā)現(xiàn)，用優(yōu)化后培養(yǎng)基對(duì)W10菌株進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)，比優(yōu)化前抑菌率提高22.3%。洪鵬等[8]在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，菌株HF-01的抑菌能力提高37.3%；25 ℃條件下，優(yōu)化后所得發(fā)酵濾液處理柑橘果實(shí)4 d后，發(fā)病率為31.7%，病斑直徑為25.9 mm，顯著低于優(yōu)化前對(duì)應(yīng)的發(fā)病率(56.7%)、病斑直徑(48.1 mm)。孫沙沙等[9]發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化培養(yǎng)條件后，CG24菌株代謝產(chǎn)物活性作用增強(qiáng)，抑菌圈直徑比優(yōu)化前提高了25.72%。

本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，MgSO4含量的變化會(huì)影響發(fā)酵物對(duì)應(yīng)的抑菌圈面積，這可能與Mg、S元素在抑菌物質(zhì)合成中起重要作用有關(guān)。其他研究人員也有類似的發(fā)現(xiàn)，如吳艷[10]研究表明，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中MgSO4含量為0.2 g/L時(shí)，芽孢桿菌菌株BCL-8對(duì)立枯絲核菌抑菌效價(jià)達(dá)833 UI；魏嬌洋[11]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中MgSO4含量為0.5%時(shí)，內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌X-278發(fā)酵液對(duì)棉花黃萎病的抑菌圈直徑為33.4 mm；王瑞霞[12]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MgSO4含量為0.05%時(shí)，枯草芽孢桿菌B-903菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)的量最多。

本試驗(yàn)利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)枯草芽孢桿菌J-4菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖1.00%、黃豆餅粉1.00%、MgSO40.15%、Na2HPO4-NaH2PO40.10%；優(yōu)化培養(yǎng)條件為發(fā)酵時(shí)間36 h、裝液量100 mL(250 mL)、發(fā)酵溫度37 ℃、接種量5%。培養(yǎng)基優(yōu)化后，J-4菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)應(yīng)的抑菌圈面積比基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)的抑菌圈面積增大50.25%。通過(guò)培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件的優(yōu)化，極大地提高了胞外抗菌物質(zhì)的產(chǎn)量，為枯草芽孢桿菌J-4菌株的抑菌機(jī)制研究及抑菌物質(zhì)的分離純化奠定了基礎(chǔ)。

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Optimization of Fermentation Conditions for Producing Antibacterial
Substance fromBacillussubtilisStrain J-4

ZHAI Yujie1,DENGZU Liying2,JIANG Junpo1,WANG Shiying1*

(1.College of Life Science,Hebei Agricultural University,Baoding 071001,China;2.Zhengzhou Infant Normal School,Zhengzhou 450000,China)

In order to improve the content of antibacterial substance in the fermentation broth ofBacillussubtilisstrain J-4,the combined method of single factor test and orthogonal test was used to optimize the factors,such as carbon source,nitrogen source,inorganic salts,fermentation time,media amount,fermentation temperature and inoculation amount.The medium composition and fermentation conditions after optimization were as follows:glucose 1%,soybean cake powder 1%,MgSO40.15%,Na2HPO40.10%,NaH2PO40.10%,fermentation time 36 h,media amount 100 mL(250 mL),fermentation temperature 37 ℃,inoculation amount 5%.The inhibition area after optimization increased by 50.25% compared with the inhibition area when using the basal fermentation medium.

Bacillussubtilis; antibacterial substance; optimization; orthogonal test

2016-08-18

石家莊市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(151500062A)

翟玉潔(1990-)，女，河北保定人，在讀碩士研究生，研究方向：飼用益生菌及其應(yīng)用。 E-mail:zhaiyujie901118@126.com

*通訊作者：王世英(1963-)，男，河北安平縣人，教授，主要從事農(nóng)牧微生物研究。E-mail:wsy99999@126.com

S816.7

A

1004-3268(2017)02-0131-05