生物氣溶膠核酸檢測(cè)技術(shù)分析

韓麗麗 齊秀麗 徐 莉

(防化學(xué)院 北京 102205)

生物氣溶膠核酸檢測(cè)技術(shù)分析

韓麗麗 齊秀麗 徐 莉

(防化學(xué)院 北京 102205)

生物氣溶膠由一些細(xì)菌、真菌、病毒等微生物粒子構(gòu)成,有時(shí)又被稱為微生物氣溶膠。生物氣溶膠作為絕大多數(shù)生物戰(zhàn)劑的施放形式,經(jīng)常在生物恐怖襲擊中扮演重要角色。論文在介紹生物氣溶膠定義、來源、特點(diǎn)的基礎(chǔ)上,深入分析生物氣溶膠核酸檢測(cè)技術(shù)原理、優(yōu)缺點(diǎn)、裝備應(yīng)用及國內(nèi)外研究現(xiàn)狀,并針對(duì)我國生物氣溶膠檢測(cè)技術(shù)的研究提出自己的幾點(diǎn)建議。

生物氣溶膠; 核酸檢測(cè)技術(shù); 建議

Class Number X831

1 引言

當(dāng)前,國際戰(zhàn)略環(huán)境錯(cuò)綜復(fù)雜,戰(zhàn)爭(zhēng)的非對(duì)稱性和作戰(zhàn)手段的多樣性更加明顯,盡管從1972年以來已有162個(gè)國家簽署了《禁止生物武器公約》,但是不少國家仍在致力于生物武器的研制,造成了一定的生物威脅。2001年的“美國炭疽粉末郵件事件”引起了全球范圍內(nèi)的恐慌,標(biāo)志著生物恐怖襲擊己經(jīng)成為現(xiàn)實(shí)威脅。生物氣溶膠作為絕大多數(shù)生物戰(zhàn)劑的施放形式,經(jīng)常在生物恐怖襲擊中扮演重要角色。如何對(duì)生物氣溶膠實(shí)施快速、準(zhǔn)確的檢測(cè),已經(jīng)成為防生物戰(zhàn)和反生物恐怖襲擊的重要課題。對(duì)此,世界各國都越來越重視對(duì)生物氣溶膠檢測(cè)技術(shù)的研究,以最大限度地杜絕生物恐怖襲擊的發(fā)生。

2 生物氣溶膠概述

2.1 生物氣溶膠的定義

具有生命的氣溶膠粒子(包括細(xì)菌、真菌、病毒等微生物粒子)和活性粒子(花粉、孢子等)以及由有生命活性的機(jī)體所釋放到空氣中的各種質(zhì)粒被統(tǒng)稱為生物氣溶膠。由于空氣微生物是大氣生物氣溶膠的主要組成部分,所以生物氣溶膠有時(shí)又被稱為微生物氣溶膠,依其種類可劃分為細(xì)菌氣溶膠、真菌氣溶膠、病毒氣溶膠等。

2.2 生物氣溶膠的來源

由于空氣中缺少微生物直接可利用的養(yǎng)料,不能繁殖生長,因此空氣中無固有的微生物群系,其均由暫時(shí)懸浮于空氣中的塵埃攜帶著的微生物所構(gòu)成,所以大氣生物氣溶膠主要來源于土壤、灰塵、江河湖海、動(dòng)物、植物及人類本身。具有較大意義的生物氣溶膠的粒徑范圍是0.1μm～20.0μm。生物氣溶膠種類繁多,分布廣泛,涉及很多領(lǐng)域,與人類社會(huì)的關(guān)系較為密切。

2.3 生物氣溶膠的特點(diǎn)

體積小且無色無味,從而使得以此為施放形式的生物戰(zhàn)劑隱蔽性較強(qiáng);易滲透,使其對(duì)應(yīng)的生物戰(zhàn)劑難于防護(hù),尤其是難于進(jìn)行物理防護(hù);易擴(kuò)散,直接噴灑的生物氣溶膠可隨風(fēng)飄到較遠(yuǎn)地區(qū),殺傷范圍可達(dá)數(shù)百至數(shù)千平方公里。

3 核酸檢測(cè)技術(shù)

微生物基因組內(nèi)均含有特異的、有別于其他種或?qū)俚暮怂嵝蛄?這些特征序列相當(dāng)于微生物的“身份證”或者“指紋”。利用核酸檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)微生物樣品中的特征序列及豐度即可實(shí)現(xiàn)微生物的鑒別從而進(jìn)一步檢測(cè)生物氣溶膠。

3.1 核酸雜交技術(shù)

核酸雜交技術(shù)依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原理,將帶有標(biāo)志物的核酸探針與被檢樣品中的目標(biāo)核酸序列特異性地結(jié)合,然后利用特定手段測(cè)定標(biāo)志物,通過確定樣品中目標(biāo)核酸序列的豐度來實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的鑒別。如果以某種微生物的特征序列為探針,那么通過雜交技術(shù)就可以檢測(cè)樣品中是否含有該微生物。核酸雜交技術(shù)具有高特異性、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn),能在幾分鐘至幾小時(shí)內(nèi)檢測(cè)出pg水平的基因組DNA;利用熒光原位雜交還可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列的定位與可視化。

如今,核酸雜交技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于致病微生物中,以生物氣溶膠形式施放的病毒、細(xì)菌、立克次體等多種生物戰(zhàn)劑都可以被成功檢測(cè)出來。

3.2 PCR技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是一種能在體外快速擴(kuò)增特定基因片段的方法,即通過高溫變性、低溫退火、適溫延伸三個(gè)步驟,對(duì)寡核苷酸引物所界定的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增,通過檢測(cè)出來的DNA和RNA來實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的鑒別。Haug-land第一次用PCR技術(shù)檢測(cè)了人工發(fā)生真菌Stachybotry chartarum的氣溶膠,檢測(cè)值與直接鏡檢和已知濃度值相符,證明PCR可以快速定量空氣中某種生物氣溶膠的濃度。隨后他又研究了真菌孢子不同DNA提取方法對(duì)PCR技術(shù)結(jié)果的影響。Cruz-perez研究了應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)環(huán)境真菌的引物和探針,并評(píng)價(jià)了各種DNA純化方法對(duì)PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果的影響。Sou-ichi人為地把炭疽直接加入到空氣微生物采樣液中,然后用PCR技術(shù)進(jìn)行了分析,結(jié)果1個(gè)炭疽細(xì)胞在1小時(shí)內(nèi)就可檢出。Yadav應(yīng)用PCR技術(shù)直接檢測(cè)工作環(huán)境中導(dǎo)致職業(yè)病的分枝桿菌和假單孢菌的氣溶膠總數(shù),用于對(duì)氣溶膠暴露的危險(xiǎn)評(píng)估。Zeng用PCR技術(shù)檢測(cè)了農(nóng)場(chǎng)環(huán)境空氣中walleniasebi并與培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)PCR技術(shù)比培養(yǎng)計(jì)數(shù)法更靈敏,可以檢測(cè)出更小濃度的氣溶膠。由于生物氣溶膠沉降在物體表面可再次形成氣溶膠造成二次污染,Buttner研究了生物氣溶膠的二次污染對(duì)PCR技術(shù)的影響以及利用PCR技術(shù)檢測(cè)物體表面消毒前后污染菌的數(shù)量以評(píng)價(jià)消毒措施是否有效。

PCR技術(shù)具有特異、快速、靈敏度高并可對(duì)初始生物氣溶膠濃度進(jìn)行定量分析,在生物氣溶膠的檢測(cè)中具有很好的應(yīng)用前景。

如今,PCR技術(shù)及其改進(jìn)技術(shù)(如熒光定量PCR技術(shù)、多重PCR技術(shù)等)已廣泛應(yīng)用于致病微生物的檢測(cè)與鑒定領(lǐng)域。隨著自動(dòng)化與集成化程度的提高,基于PCR技術(shù)的生物戰(zhàn)劑檢測(cè)裝備已開始應(yīng)用于戰(zhàn)場(chǎng)。例如,Idah公司研制的耐用型病原菌檢測(cè)裝備能夠在30min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)炭疽菌、肉毒梭菌、布魯菌屬、沙門菌屬和李斯特菌屬等的檢測(cè),目前已有40多個(gè)國家的軍隊(duì)配備了該裝備。

3.3 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)的基本原理是利用核酸探針捕獲靶基因來識(shí)別生物體的種類。它通過平面微加工技術(shù)將大量的核酸探針有規(guī)律地排列固定于硅片或玻片等固相支持物上,構(gòu)成二維探針陣列,用于捕獲預(yù)先經(jīng)過熒光物質(zhì)或核素標(biāo)記的靶基因,再通過激光共聚焦顯微等技術(shù)對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)與分析。該技術(shù)結(jié)合了微電子、微機(jī)械、化學(xué)合成、光學(xué)、計(jì)算機(jī)等一系列現(xiàn)代科學(xué)前沿技術(shù),利用構(gòu)建的基因芯片及其表面微流分析系統(tǒng),快速、準(zhǔn)確地完成對(duì)微生物的鑒定。2005年,Zhou等根據(jù)GenBank中SARS-CoV基因組序列,設(shè)計(jì)了靶向SARS-CoV保守序列的寡核苷酸探針,并將這些探針整合到70-mer基因芯片上,實(shí)現(xiàn)了對(duì)SARS-CoV的早期檢測(cè)。通過對(duì)臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果表明,基于基因芯片的SARS-CoV早期檢測(cè)方法特異、有效,對(duì)SARS患者的檢測(cè)敏感性約為91%。2009年,Felder等建立了基于基因芯片技術(shù)檢測(cè)環(huán)境樣品中炭疽菌的方法,其構(gòu)建的基因芯片包含靶向炭疽菌質(zhì)粒毒力基因rpoB以及各亞型炭疽菌、蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌16S rDNA的寡核苷酸探針,并利用該芯片對(duì)158份環(huán)境樣品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明:該方法可將炭疽菌與其他桿菌有效區(qū)分,整個(gè)檢測(cè)過程僅需12小時(shí)。

目前基因芯片已在生物戰(zhàn)劑氣溶膠檢測(cè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。多國權(quán)威媒體和刊物中都已有采用基因芯片技術(shù)檢測(cè)大腸埃希菌、霍亂弧菌、炭疽桿菌、鼠疫桿菌、西部馬腦炎病毒、出血熱病毒等和采用免疫芯片技術(shù)檢測(cè)葡萄球菌腸毒素的研究報(bào)道。

但是基因芯片的制作成本還很高,并且需要昂貴的檢測(cè)儀器,因此該技術(shù)主要局限于實(shí)驗(yàn)室研究而未能廣泛應(yīng)用于臨床致病微生物的檢測(cè)與鑒定。

3.4 核酸檢測(cè)技術(shù)特點(diǎn)分析

核酸檢測(cè)技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn):和免疫學(xué)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)相同,該技術(shù)具有高特異性、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn),能在幾分鐘至幾小時(shí)內(nèi)檢測(cè)出pg水平的基因組DNA。

可是核酸檢測(cè)技術(shù)也有自身的缺陷:該技術(shù)本身的專業(yè)要求較高,導(dǎo)致形成裝備的難度偏大,一定程度上限制了該技術(shù)的應(yīng)用。

3.5 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀

早在20世紀(jì)90年代初期,西方發(fā)達(dá)國家便已發(fā)明了以PCR技術(shù)為代表的核酸檢測(cè)技術(shù)。在隨后的20多年里,核酸檢測(cè)技術(shù)以其高特異性、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)得到廣泛關(guān)注和良好發(fā)展。

汪曉輝等于1996年利用逆轉(zhuǎn)錄半套式PCR技術(shù)對(duì)風(fēng)疹病毒氣溶膠進(jìn)行檢測(cè)。但隨后,由于各種條件的限制,遲遲未能有創(chuàng)新進(jìn)展,與西方發(fā)達(dá)國家的水平差距較大。

4 對(duì)我國研究生物氣溶膠檢測(cè)技術(shù)的幾點(diǎn)建議

通過對(duì)生物氣溶膠檢測(cè)技術(shù)國內(nèi)外研究現(xiàn)狀的分析,本文認(rèn)為國內(nèi)生物氣溶膠檢測(cè)技術(shù)與發(fā)達(dá)國家相比,存在起步較晚、發(fā)展較慢、研究較淺、技術(shù)較為落后的問題。為提高我國生物氣溶膠檢測(cè)水平,需要做的工作還有很多,本文針對(duì)我國實(shí)際研究情況,提出以下建議。

4.1 加大對(duì)生物氣溶膠檢測(cè)技術(shù)的研究力度

我國對(duì)生物氣溶膠檢測(cè)技術(shù)的研究起步較晚,在人力物力投入方面明顯不夠,導(dǎo)致一些關(guān)鍵技術(shù)較發(fā)達(dá)國家相比落后較多。而隨著生物氣溶膠檢測(cè)技術(shù)向自動(dòng)化、實(shí)時(shí)化、遠(yuǎn)程化的趨勢(shì)發(fā)展,其在技術(shù)上的要求必定越來越高,這更是需要我國加大對(duì)此的研究力度,緊緊追蹤國外生物氣溶膠檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展動(dòng)態(tài)和前沿水平,將積極引進(jìn)先進(jìn)技術(shù)和自主研制有機(jī)結(jié)合起來,集中力量,聯(lián)合攻關(guān),以期在不久的將來研究出具有國際先進(jìn)水平和我軍特色的生物氣溶膠檢測(cè)技術(shù)。

4.2 重點(diǎn)發(fā)展核酸檢測(cè)技術(shù)

檢測(cè)生物氣溶膠的技術(shù)很多,遙測(cè)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、核酸技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)、生物發(fā)光技術(shù)等。每種技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn),從目前檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的現(xiàn)狀來看,核酸檢測(cè)技術(shù)在分析時(shí)間、靈敏性、可靠性、特異性等方面均優(yōu)于其他技術(shù),結(jié)果如表1所示。

表1 各種檢測(cè)技術(shù)的比較

雖然核酸檢測(cè)技術(shù)有以上多方面的優(yōu)勢(shì),但是其對(duì)專業(yè)技術(shù)的要求較高,一些關(guān)鍵技術(shù)尚未得到優(yōu)化,仍需廣大科研人員繼續(xù)攻堅(jiān)克難。因此,本文認(rèn)為我國的研究重點(diǎn)應(yīng)放在核酸檢測(cè)技術(shù)上,做到優(yōu)化技術(shù),簡(jiǎn)化流程,高效地完成對(duì)生物氣溶膠的檢測(cè)。

4.3 嘗試發(fā)展集多種檢測(cè)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)于一身的新型技術(shù)

生物氣溶膠的檢測(cè)已經(jīng)發(fā)展為一個(gè)涉及多種學(xué)科與技術(shù)的系統(tǒng)工程,它包括遙測(cè)、免疫、核酸、質(zhì)譜等多種技術(shù)。每種技術(shù)都含有其特定的優(yōu)缺點(diǎn),經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),有時(shí)僅靠一種技術(shù)很難高效地完成對(duì)生物氣溶膠的檢測(cè)。因此,早在20世紀(jì)80年代美國等先進(jìn)國家已開始研究由幾種技術(shù)、幾種儀器組成的JBPDS系統(tǒng)來解決某些復(fù)雜的生物氣溶膠檢測(cè)難題。我國應(yīng)跟隨國際先進(jìn)水平的步伐,嘗試發(fā)展集多種檢測(cè)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)于一身的新型技術(shù),以期高效的完成對(duì)生物氣溶膠的檢測(cè)。

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Analysis of Biological Aerosoldetection Technology

HAN Lili QI Xiuli XU Li

(Institute of Chemical Defence, Beijing 102205)

Biological aerosol is composed of bacteria, fungi and viruses and is sometimes referred to as microbial aerosol. As a releasing form of most biological warfare agents, bioaerosol often plays an important role in the biological terrorist attacks. This paper based on the introduction to the definition, source, and the characteristics of the bioaerosol, summarizes the current biological aerosol detection technology. It also makes a deep analysis on the principles, strengths and weaknesses, the employment of equipment as well as the current research of each technology at home and abroad, and put forward suggestions on the detection of bioaerosol are put forward.

biological aerosol, nucleic acid testing technique, suggestions

2016年8月3日,

2016年9月17日

韓麗麗,女,碩士,講師,研究方向:生物防護(hù)與安全。齊秀麗,女,碩士,副教授,研究方向:生物防護(hù)與安全。徐莉,女,博士,副教授,研究方向:生物防護(hù)與安全。

X831

10.3969/j.issn.1672-9730.2017.02.005