艾碧琛，何宜榮，曹蓉，何棟，趙國榮，賀又舜

1.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學研究生院 湖南 長沙 410208

甘露消毒丹及其拆方對感染腸道病毒71型細胞miR-146a和Toll樣受體4 mRNA表達的影響

艾碧琛1，何宜榮1，曹蓉1，何棟2，趙國榮1，賀又舜1

1.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學研究生院 湖南 長沙 410208

目的探討甘露消毒丹及其拆方對腸道病毒71型（EV71）感染后免疫及炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。方法運用細胞培養(yǎng)技術(shù)，設(shè)甘露消毒丹組（甘全方組）、清殘方組、利殘方組、病毒唑組、正常組、模型組，進行病毒毒力和藥物細胞毒性測定后，以藥物作用于EV71感染后的RD細胞，24 h后RT-PCR檢測各組細胞miR-146a、Toll樣受體4（TLR4）mRNA表達。結(jié)果與正常組比較，模型組miR-146a mRNA表達降低，TLR4 mRNA表達升高；與模型組比較，甘全方組、清殘方組、利殘方組miR-146a mRNA表達升高、TLR4 mRNA表達降低，病毒唑組與模型組比較差異不明顯；與甘全方組比較，清殘方組miR-146a、TLR4 mRNA表達降低，利殘方組miR-146a mRNA表達升高、TLR4 mRNA表達降低；與清殘方組比較，利殘方組miR-146a mRNA表達升高，TLR4 mRNA表達無明顯差異。結(jié)論甘露消毒丹可能通過調(diào)節(jié)miR-146a、TLR4 mRNA表達從而影響EV71感染所致免疫反應(yīng)，其中清殘方與利殘方可能存在互相拮抗效應(yīng)。

甘露消毒丹；拆方；腸道病毒71型；miRNA-146a；Toll樣受體4

手足口病是由多種腸道病毒引起的一種嬰幼兒和兒童常見傳染病，近年手足口病的發(fā)病率及病死率有增高趨勢[1]。腸道病毒71型（EV71）及柯薩奇病毒A組16型（CoxAl6）為手足口病最主要的致病病毒，其中重癥手足口病病情進展快，死亡率較高，多由EV71感染引起，致死原因主要為腦干腦炎及神經(jīng)源性肺水腫。目前缺乏特異高效的抗手足口病病毒藥物，對手足口病尚無特異性治療方法，主要以對癥治療為主，療效并不理想。中醫(yī)學者大多認為手足口病屬中醫(yī)學“濕溫”“時疫”“春溫”等范疇，提出用衛(wèi)氣營血辨證或三焦辨證進行辨治，其中濕熱困阻中焦或毒在氣分時，甘露消毒丹為臨床常用選方之一[2-3]。但甘露消毒丹治療手足口病的作用機制尚不十分明確。前期研究發(fā)現(xiàn)，甘露消毒丹能影響EV71復(fù)制的多個環(huán)節(jié)而發(fā)揮直接抗病毒作用[4-5]。本研究以在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)及抗病毒中發(fā)揮重要作用的miR-146a和Toll樣受體4（TLR4）mRNA為切入點，探討甘露消毒丹對EV71感染免疫與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用；同時，進行拆方研究，希望有助于闡釋方中有效組分或功能團的配伍機理，全面闡釋其多靶點治療作用，或可助于科學簡化處方行為要素。

1 實驗材料

1.1 細胞

人惡性胚胎橫紋肌瘤細胞（RD細胞），美國ATCC公司，DMEM培養(yǎng)液（含10%牛血清）培養(yǎng)，連續(xù)傳代3次。細胞維持液為含1%雙抗（青霉素、鏈霉素）、2%新生牛血清的DMEM，消化液為0.25%胰蛋白酶溶液。

1.2 病毒

EV71病毒，武漢大學基礎(chǔ)醫(yī)學院醫(yī)學病毒學研究所提供。EV71接種于單層RD細胞上，加維持液后置于35 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待出現(xiàn)75%以上的病變時收獲，凍融3次后吹打離心，4000 r/min離心10 min，取上清液，分裝后-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 藥物及制備

甘露消毒丹（以下簡稱“甘全方”，劑量參照《方劑學》[6]記載）：滑石15 g，茵陳11 g，黃芩10 g，石菖蒲6 g，木通5 g，川貝母5 g，藿香4 g，豆蔻4 g，連翹4 g，射干4 g，薄荷4 g。甘露消毒丹清熱解毒殘方（以下簡稱“清殘方”）：黃芩10 g，薄荷4 g，連翹4 g，川貝母5 g，射干4 g。甘露消毒丹化濁利濕殘方（以下簡稱“利殘方”）：滑石15 g，茵陳11 g，木通5 g，豆蔻4 g，石菖蒲6 g，藿香4 g。上述飲片由湖南中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院藥劑科提供，湖南中醫(yī)藥大學潘清平教授鑒定均為正品。中藥常規(guī)煎煮法煎煮2次，合并藥液，制備成含原藥材0.25 g/mL的藥液，濾紙過濾后再以0.22 μm微孔濾膜過濾。病毒唑注射液，規(guī)格100 mg/mL，江蘇蘇星制藥有限公司，批號0110409，以蒸餾水配制成3 mg/mL溶液。

1.4 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基，美國HyClone公司，批號SH30243.01B；胎牛血清，美國HyClone公司，批號SV30087.02；胰蛋白酶消化液，美國Sigma公司，批號11476232；二甲基亞砜（DMSO），上海生工生物工程公司，批號2924B239；四甲基偶氮唑藍（MTT），上海生工生物工程公司，批號TB0799；DnaseI，上海生工生物技術(shù)有限公司；SYBR?PremixExTaq?，寶生物工程（大連）有限公司；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit，加拿大Fermentas公司；RT-PCR試劑盒，上海生工生物技術(shù)有限公司；Trizol，Invitrogen公司；引物由寶生物工程（大連）有限公司代為設(shè)計、合成。生物安全柜（Haier公司），超微量紫外分光光度計（Thermo Fisher公司），Centrifuge5415R高速冷凍離心機（Eppendorf公司），熒光倒置顯微鏡（Olympus公司），7900HT熒光定量PCR儀（ABI公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（賽百奧科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 病毒毒力測定

計算半數(shù)組織培養(yǎng)感染量TCID50（Reed-Muench法），采用100TCID50進行本實驗[4-5]。

2.2 藥物細胞毒性測定

MTT法計算其細胞存活率（以不同濃度藥物的OD值計算），以細胞存活率（%）為縱坐標、藥物濃度為橫坐標（g/mL）繪制非線性回歸曲線。以90%細胞存活率濃度為各藥的實驗濃度[4-5]。

2.3 藥物干預(yù)實驗

取RD細胞接種于無菌6孔細胞板，100 μL/孔，置于35 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待細胞長成單層后吸棄培養(yǎng)液，每孔接種病毒液50 μL，輕混，待吸附1.5 h后吸棄病毒液，將90%細胞存活率的甘全方、清殘方、利殘方、病毒唑藥液50 μL與50 μL維持液混合，分別加到RD細胞上，各設(shè)4復(fù)孔。另每孔均設(shè)模型組、正常組，正常組孔內(nèi)加維持液100 μL，模型組孔內(nèi)接種病毒液50 μL，吸附1.5 h后吸棄病毒液，加入維持液100 μL。24 h后收集細胞，加入Trizol，待RT-PCR檢測miRNA-146a、TLR4 mRNA的相對表達。

2.4 RT-PCR檢測細胞miRNA-146a、TLR4 mRNA表達

采用Trizol法分別提取甘全方組、清殘方組、利殘方組、病毒唑組、模型組、正常組細胞總RNA，將所提取的總RNA用超微量紫外分光光度計分別測定酶標儀波長260 nm和280 nm處吸光度（A）值，計算各組OD260/OD280值，若樣品純度符合實驗要求，則行基因檢測。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒與miRNA-146a、U6、TLR4、β-actin反轉(zhuǎn)錄酶引物，以37 ℃、30 min，65 ℃、10 min，42 ℃、60 min，70 ℃、5 min進行孵育合成cRNA，-20 ℃保存。采用miRNA-146a、U6、TLR4 mRNA、β-actin的SYBR?Premix Ex Taq進行擴增，總體系30 μL，分三重復(fù)孔，95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40個循環(huán)（熒光定量PCR）。采用2-ΔΔCt法，以第一個樣為1，計算待測基因的相對定量（RQ）值。

3 統(tǒng)計學方法

4 結(jié)果

4.1 病毒毒力測定結(jié)果

根據(jù)Reed-Muench法計算得出TCID50＝10-2.89/mL。

4.2 藥物細胞毒性測定結(jié)果

通過回歸曲線獲得各實驗用藥90%細胞存活率濃度為甘全方0.003 7 g/mL、清殘方0.002 0 g/mL、利殘方0.008 1 g/mL和病毒唑0.64 mg/mL。

4.3 RNA電泳結(jié)果

6組28 s、18 s RNA的條帶均比較清晰，且28 s RNA均比18 s RNA清晰，見圖1。

圖1 各組RNA凝膠電泳圖

4.4 RNA鑒定結(jié)果

各組OD260/OD280在1.8～2.0之間，見表1。表明提取的RNA污染較少，純度較高。

表1 RNA鑒定結(jié)果

4.5 各組細胞miR-146a、Toll樣受體 mRNA相對定量值

miR-146a、U6、TLR4、β-actin的擴增曲線、融解曲線見圖2～圖5。從各基因的擴增曲線和融解曲線可見，每個基因擴增用的引物特異性強，該基因擴增引物進行了特異性擴增，擴增結(jié)果可信。

圖2 miR-146a擴增曲線和融解曲線

圖3 U6擴增曲線和融解曲線

圖4 TLR4擴增曲線和融解曲線

圖5 β-actin擴增曲線和融解曲線

各組miR-146a mRNA RQ值比較：模型組、病毒唑組較正常組明顯降低（P＜0.05），甘全方組、清殘方組、利殘方組均較正常組明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；甘全方組、清殘方組、利殘方組均較模型組明顯升高（P＜0.01），病毒唑組與模型組差異不明顯；清殘方組較甘全方組明顯降低（P＜0.05），利殘方組較甘全方組明顯升高（P＜0.01），利殘方組較清殘方組明顯升高（P＜0.01）；病毒唑組較甘全方組、清殘方組、利殘方組明顯降低（P＜0.01）。各組TLR4 mRNA RQ值比較：模型組、甘全方組、清殘方組、病毒唑組較正常組明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），利殘方組與正常組比較無明顯差異；甘全方組、清殘方組、利殘方組較模型組明顯降低（P＜0.01），病毒唑組與模型組比較差異不明顯；清殘方組、利殘方組較甘全方組明顯降低（P＜0.01）；清殘方組與利殘方組比較差異不明顯；病毒唑組較甘全方組、清殘方組、利殘方組明顯升高（P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組miR-146a、TLR4 mRNA表達比較（±s，RQ值）

表2 各組miR-146a、TLR4 mRNA表達比較（±s，RQ值）

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與甘全方組比較，○P＜0.05，○○P＜0.01；與清殘方組比較，※※P＜0.01；與利殘方組比較，＆＆P＜0.01

組別 n miR-146a TLR4正常組 3 1.15±0.06 0.27±0.01模型組 3 1.00±0.03#1.00±0.06##甘全方組 3 1.33±0.11##**0.62±0.07##**清殘方組 3 1.24±0.14#**○0.41±0.12#**○○利殘方組 3 1.59±0.09##**○○※※0.34±0.10**○○病毒唑組 3 1.04±0.06#○○※※＆＆0.93±0.30##○○※※＆＆

5 討論

手足口病患者存在明顯的免疫功能調(diào)節(jié)障礙，T淋巴細胞、細胞因子、免疫球蛋白及補體水平均可能出現(xiàn)異常，同時患兒細胞免疫發(fā)育尚不成熟，感染EV71后則更容易進展為重癥手足口病，也可能因為炎癥因子分泌增多而激發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征和膿毒癥，進而影響手足口病的轉(zhuǎn)歸，免疫調(diào)控成為治療手足口病的新靶點。miRNA是一類長約為22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，可以調(diào)節(jié)代謝、免疫、增殖、分化和癌變等多種生物學過程，是近年免疫研究的熱點。miR-146是首個發(fā)現(xiàn)在免疫系統(tǒng)中有調(diào)節(jié)作用的miRNA，包括miR-146a、miR-146b兩個成員，其中miR-146a在調(diào)節(jié)固有免疫、炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，如髓系細胞中miR-146a能調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6和白細胞介素-1受體相關(guān)激酶介導(dǎo)的炎癥信號通路[7-8]，也可作用于相關(guān)靶基因進而調(diào)節(jié)可以抗病毒的干擾素通路[9]。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)的途徑之一是下調(diào)Toll樣受體[10-11]，后者能介導(dǎo)炎癥因子的釋放從而啟動炎癥應(yīng)答。

我們前期的研究表明，甘露消毒丹及其拆方能直接對抗病毒[4-5]，那么它們是否可通過microRNA調(diào)節(jié)機體免疫？有研究表明，甘露消毒丹具有免疫調(diào)節(jié)作用，能降低濕熱證模型大鼠粒細胞集落刺激因子水平、增加體內(nèi)一氧化氮的含量，影響血清酶活性等[12-15]，但尚無其是否能調(diào)控microRNA的報道。我們的研究結(jié)果顯示，RD細胞在感染EV71后miR-146a mRNA表達下降，TLR4 mRNA表達上升，提示EV71感染導(dǎo)致機體炎癥與免疫反應(yīng)的機制之一是抑制miR-146a、上調(diào)TLR4，從而促進炎癥因子釋放、啟動炎癥反應(yīng)。同時研究還發(fā)現(xiàn)，甘露消毒丹及其拆方均能以不同程度上調(diào)miR-146a且下調(diào)TLR4 mRNA表達，推測它們可能通過調(diào)控microRNA而調(diào)控炎癥信號，提示甘露消毒丹及其拆方既能直接抗EV71病毒，也能調(diào)節(jié)EV71感染后的機體免疫功能，所以甘露消毒丹治療EV71感染的作用是多方面的，這也體現(xiàn)了中醫(yī)復(fù)方多環(huán)節(jié)、多靶點的整體調(diào)節(jié)特點。而病毒唑?qū)iR-146a、TLR4 mRNA未表現(xiàn)出明顯的調(diào)節(jié)作用，表明病毒唑主要作用是抗病毒而不能調(diào)節(jié)免疫。

另一方面，拆方研究結(jié)果顯示利殘方的調(diào)節(jié)作用最明顯。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，清殘方抗EV71作用最強而利殘方抗EV71作用最弱[4]，但本研究中利殘方表現(xiàn)出比清殘方更強的免疫調(diào)節(jié)作用，可見二者側(cè)重點不同，組合成方能使治療更全面，生動地展示了中醫(yī)復(fù)方“配伍”的奧妙所在，即在中醫(yī)理論及方劑配伍原則指導(dǎo)下組方，方中每味藥或者藥物組（“功能團”）各有所長、各司其職，共同形成功能全面的整合體，從機體內(nèi)在紊亂與失衡的多個“作用點”共同治療疾病。

結(jié)合前期研究結(jié)果，我們還發(fā)現(xiàn)甘全方、清殘方、利殘方均有抗EV71及調(diào)節(jié)miR-146a、TLR4的作用，但甘全方抗EV71的作用較清殘方弱，調(diào)節(jié)miR-146a及TLR4的效應(yīng)又弱于利殘方，這或許表明清殘方及利殘方之間可能存在相互拮抗，只是本實驗尚未對具體的拮抗機制作出分析，在后續(xù)實驗中將對這種關(guān)系進一步研究，可能有益于揭示中醫(yī)復(fù)方配伍的奧秘。

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Effects of Ganlu Xiaodu Dan and Its Incomplete Prescription on Expressions of MiR-146a and TLR4 mRNA in Cells Infected by EV71

AI Bi-chen1, HE Yi-rong1, CAO Rong1, HE Dong2,ZHAO Guo-rong1, HE You-shun1
(1. TCM School of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China; 2. Graduate School of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China)

ObjectiveTo observe the effects of Ganlu Xiaodu Dan and its incomplete prescription on expressions of MiR-146a and TLR4 mRNA in RD cells infected by EV71.MethodsWith technique of cell culturing, Ganlu Xiaodu Dan therapy group, incomplete Qing prescription therapy group, incomplete Li prescription therapy group, normal cells control group, model control group and ribavirin control group were set, and tests for virus toxicity and medicine toxicity in cells were taken, then expressions of miRNA-146a and TLR4 mRNA in these RD cells 24 hours after intervention with medicine were detected.ResultsCompared with normal cells control group, miR-146a in mRNA model control group decreased and TLR4 mRNA increased. Compared with model control group, miR-146a mRNA in Ganlu Xiaodu Dan therapy group, incomplete Qing prescription therapy group and incomplete Li prescription therapy group all increased while TLR4 mRNA decreased, and differences between ribavirin control group and model control group were not significant. Compared with Ganlu Xiaodu Dan therapy group, both expressions of miR-146a and TLR4 mRNA in incomplete Qing prescription therapy group were lower; miR-146a increased and TLR4 mRNA decreased in incomplete Li prescription therapy group. Compared with incomplete Qing prescription therapy group, miR-146a mRNA in incomplete Li prescription therapy group increased, but expression of TLR4mRNA between them was not significant.ConclusionGanlu Xiaodu Dan can regulate the immune reactions caused by infection of EV71 by increasing expression of miR-146a mRNA and reducing expression of TLR4 mRNA. There may be antagonism effect between incomplete Qing prescription and incomplete Li prescription.

Ganlu Xiaodu Dan; incomplete prescription; EV71; miRNA-146a; TLR4

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.015

R285.5

A

1005-5304(2017)03-0061-05

2016-07-26）

（

2016-09-18；編輯：華強）

國家自然科學基金（81173188）；湖南中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新團隊項目（2016年）

賀又舜，E-mail：youshunh@sina.com