蛋白分離技術(shù)的應用和進展研究

蔣丹 曹宇虹 張海杰（正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司，江蘇 南京 210000）

蛋白分離技術(shù)的應用和進展研究

蔣丹 曹宇虹 張海杰（正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司，江蘇 南京 210000）

蛋白質(zhì)存在一切生物體中，是作為生物體生命周期中一個重要的成分。所以對蛋白質(zhì)的研究也是對生命科學研究探索的一個重要環(huán)節(jié)。

蛋白分離技術(shù)；提純；層析法

隨著生物醫(yī)學的技術(shù)發(fā)展，分離制備天然高分子化合物的技術(shù)領(lǐng)域已趨向成熟，通過對天然高分子化合物這些具有較強生理活性物質(zhì)進行生物制藥。本文從沉淀分離法和親和層析法等分離技術(shù)研究，推測后續(xù)的發(fā)展的狀況。

1 沉淀分離法

(1)常用的分離蛋白方式是通過無機鹽將蛋白溶液中的酶沉淀分離或是蛋白分離，這種方法是一種較為簡單的粗分離法。大體思路是將35%-60%的硫酸銨加入到蛋白溶液中，在低溫4℃存放24小時，然后通過離心力將蛋白分離出來。硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)的方式分離要注意在具有高濃度蛋白中進行。具體步驟可以由以下三種方法完成：（1）加入一定濃度的硫酸銨將蛋白溶液中的蛋白沉淀，使之與非蛋白雜質(zhì)分離；（2）通過“餾分”將沉淀的蛋白質(zhì)分出，讓參有雜質(zhì)的蛋白質(zhì)存留在溶液中，使之無法沉淀；（3）采用能將蛋白溶解的溶液，再通過鹽析的方法將雜質(zhì)沉淀并將其分離，將蛋白質(zhì)保留在純凈溶液中。

鹽析法在實際中的應用有磷酸絡(luò)氨酸蛋白專一抗體的轉(zhuǎn)化，紅茶抗菌蛋白純化等，實際應用廣泛，但分離過程中需消耗大量無機鹽，易造成環(huán)境污染，所以在國際上很多國家已禁止該工藝的使用。

(2)有機溶劑沉淀法

作為沉淀分離蛋白的另一種方式，就是用有機溶劑代替了無機鹽。通過C2H6O、CH3COCH3等有機溶液作為沉淀劑，沉淀劑先在4℃下預冷，再定量的加入到蛋白溶液中，通過離心法使之充分反應沉淀，再收集沉淀物。實際應用有全蝎蝎毒蛋白提取和SOD的分離制備等，這種方法雖然是降低了環(huán)境的污染，但是在制備的過程中易造成蛋白失活，且成本較高。制備過程要防范火災和爆炸的發(fā)生。

(3)等電沉淀法

蛋白質(zhì)帶有凈電荷，每個蛋白會存在一個pH值使蛋白表面的凈電荷為零，稱為等電點（PI）。在PI時蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度最低，利用蛋白質(zhì)的這個特性，可以將摻有蛋白的溶劑中蛋白總凈電荷調(diào)到零，就能從溶液中析出蛋白沉淀。即使是蛋白等電沉淀所需要pH值和提取緩沖液pH值相差較大時也是可以完成的，酸性蛋白質(zhì)也能在堿性的溶液中析出。但是具有中性等電點的蛋白質(zhì)就需要在蒸餾水中完成透析的過程。在等電沉淀法中pH值和攪拌反應時間對回收純度影響比較大。

(4)親和沉淀法

親和沉淀法具有親和層析法的一些優(yōu)點，并且經(jīng)濟有效。原理的是通過改變物理特性（pH值、溫度和離子強度）使其發(fā)生可逆性沉淀的水溶性復合物，在利用分子和親和高分子加熱作用沉淀分離出目標分子，最終得到目標蛋白。過程如下：將親和性熱沉淀高分子材料和有溶菌酶、卵清蛋白的溶液融合，在一定的溫度下均勻攪拌，直至蛋白質(zhì)變成復合物，在升溫沉淀，離心分離，再將得到的沉淀物溶解在醋酸中，再提高溫度提出熱沉淀高分子，通過離心分離即可得到溶菌酶和卵清蛋白。

2 親和層析法

親和層析是一種吸附層析，在層析的載體上有特殊親和性的配基，這種配基可以在眾多成分中有選擇的選中吸附到某一層的層析載體，對其他沒有選定的吸附力很小，可以很方便的在混合溶液中分離出單一成分。根據(jù)配體和目標分離產(chǎn)物作用力的差異可以分為免疫親和層析法、生物性親和層析和金屬離子親和層析等。

免疫親和層析法是通過載體上的抗體或抗原的相互作用，這個作用力是一種強大的親和力，在提取高純度的抗原和抗體上貢獻很大。多糖瓊脂糖凝膠載體通過CNRr活化后與具有免疫親和性的蛋白結(jié)合，產(chǎn)生的物質(zhì)和N一羥基丁二酞亞胺作用，在具有抗體的溶液中反應，最后就能得到親和載體，可用來分離抗體和抗原。比如純化重組人促紅細胞生成素和純化新的骨肉瘤相關(guān)抗原等等。

生物性親和層析主要是利用溶霉菌無法對底物類似物進行酶解的原理來分離溶菌酶。一般情況下通過酶解產(chǎn)物作為配基可以改變底物容易轉(zhuǎn)為產(chǎn)物的缺點，在分離的效果上較為方便。在實驗中使用溶菌酶分解細胞壁，所得的產(chǎn)物作為配體，再連接到瓊脂糖中進行親和層析，可以大大增加酶的提純能力。不過酶和連接在載體上的酶之間的作用力要小于酶—底物的作用力，但也可以分離出目標酶，一般用來分離提純粗酶產(chǎn)品，回收率較高。

配體親和層析的分離程度較生物性親和層析而言，其分離性能要差，但是有一定的獨特性。若使用組氨酸固化到載體上作親和層析，可以很好的去除溶液中各種分子量的熱原，通過不同的載體親和層析純化出不同的酶，并且有極高的回收率。而在氨基酸或是多肽物質(zhì)作為配基時擁有一定的獨特性，表現(xiàn)在穩(wěn)定性能的良好和成本的低廉。在制備的過程中即使配基與產(chǎn)物接觸也不會出現(xiàn)免疫反應，不影響最終的產(chǎn)量，唯一不足的地方就是聯(lián)合的匹配性要求較高，不容易找到相應匹配性產(chǎn)品。

3 今后發(fā)展

目前，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分離方法在粗制分離生產(chǎn)中仍有大量應用，不過新技術(shù)親和層析法較于傳統(tǒng)技術(shù)而言，有較高簡便性和提純度，在今后的發(fā)展中有明確的發(fā)展方向。由于親和層析技術(shù)的回收率高、提純度高，在今后的研究中具有重大的意義，是開發(fā)利用的重要方向。

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