肽的檢測方法及化妝品中肽檢測的計量需求＊

夏黎黎，李明

（1.煙臺市計量所，山東煙臺 264001； 2.中國計量科學(xué)研究院，北京 200029）

肽的檢測方法及化妝品中肽檢測的計量需求＊

夏黎黎1，李明2

（1.煙臺市計量所，山東煙臺 264001； 2.中國計量科學(xué)研究院，北京 200029）

肽因具有良好的生物活性而在化妝品中得到越來越廣泛的應(yīng)用。介紹了化妝品中肽的類型及其作用，肽對改善皺紋、抗衰老和美白祛斑等方面有明顯功效。當(dāng)前社會對化妝品中肽的檢測方法及計量學(xué)研究存在迫切需求，綜述了目前檢測肽常見的方法：凱氏定氮法、熒光檢測技術(shù)、化學(xué)發(fā)光檢測法、電泳法、比色法、酶聯(lián)免疫吸附劑測定法、色譜法等。

化妝品；肽；檢測；計量；綜述

肽由氨基酸脫水聚合而成，一個氨基酸分子中的氨基與另一個氨基酸分子中的羧基脫水縮合成肽，形成的酰胺基在蛋白質(zhì)化學(xué)中稱為肽鍵。肽兩端含有羧基和氨基，是一種兩性有機(jī)化合物。由兩個氨基酸分子脫水而成的肽稱為二肽，三個氨基酸分子脫水而成的稱為三肽，依此類推。相對分子質(zhì)量在50～5 000之間的稱為肽，相對分子質(zhì)量在5 000～10 000之間的稱為大肽。氨基酸分子最小，蛋白質(zhì)分子最大。兩個或以上的氨基酸分子脫水縮合形成若干個肽鍵從而組成一個肽，多個肽進(jìn)行多級折疊就組成一個蛋白質(zhì)分子。蛋白質(zhì)有時也被稱為“多肽”。具有活性的多肽稱為活性肽，又稱生物活性肽或生物活性多肽。肽是人體內(nèi)必不可少的成分，是涉及生物體內(nèi)多種細(xì)胞功能的生物活性物質(zhì)，參與人體內(nèi)的多數(shù)生化反應(yīng)。

1 人體皮膚與肽

與生物體內(nèi)其它物質(zhì)相比，肽的最大特點(diǎn)是具有多樣性和極強(qiáng)的生物活性。肽在生物體的發(fā)育、生長、新陳代謝和免疫調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵性的作用，在皮膚護(hù)理和自然老化過程中起著重要的調(diào)控作用。皮膚的褶皺、衰老、暗淡是由內(nèi)外多種因素引起的。表皮更新、真皮厚度、真皮對外來化學(xué)物清除力、免疫反應(yīng)溫度調(diào)節(jié)等多方面功能的降低，過多的照射陽光(紫外線)，都能引起皮膚衰老［1］。但皮膚衰老的最根本原因是體內(nèi)自由基破壞了正常的細(xì)胞行為，加速了細(xì)胞老化，緩解或阻止皮膚的衰老就需要抑制或清除體內(nèi)自由基［2］。20世紀(jì)90年代，添加天然蛋白質(zhì)、脫氧核糖核酸(DNA)等成分的化妝品流行一時，結(jié)果表明，這些大分子活性成分很難透過表皮被吸收。后來研究發(fā)現(xiàn)小分子肽的特殊生物活性作用，能在本質(zhì)上改善皮膚的一系列問題［3］。由于皮膚的天然屏障，大分子肽很難被真皮細(xì)胞吸收，而小分子肽因其安全無毒、易吸收和高活性，在解決皮膚褶皺、暗沉和衰老等方面效果顯著［4］。近年來，在人體皮膚護(hù)理方面，對肽活性的體內(nèi)外研究卓有成效，國內(nèi)外化妝品企業(yè)推出近50種肽類化妝品原料，這些肽的研究表明肽具有抗皺抗衰老、美白祛斑、促進(jìn)毛發(fā)生長、豐胸、纖體減肥、祛眼袋、促進(jìn)真皮修復(fù)等功效［5］?；瘖y品中的肽多為二肽至十肽之間的小分子肽，由于肽的有效生物活性和顯著的美容效果，國內(nèi)外化妝品知名品牌相繼推出了相關(guān)的美容肽產(chǎn)品［6–7］。

2 化妝品中肽的類型及作用

肽被應(yīng)用于化妝品中最主要的作用是抗皺和抗衰老?；瘖y品中常見的肽按其功能作用機(jī)理通常劃分為3類：影響神經(jīng)遞質(zhì)的肽、載體肽和信號肽。影響神經(jīng)遞質(zhì)的肽是通過抑制乙酰膽堿和兒茶酚胺的釋放［8］、模擬肉毒神經(jīng)毒素的作用、減少面部肌肉的收縮、減少肌肉運(yùn)動的潛意識而實(shí)現(xiàn)除皺效果，多見于眼部護(hù)膚品。市場上銷售的阿基瑞林的原理就是通過抑制小囊泡對接達(dá)到抑制乙酰膽堿的釋放［4］。A型肉毒神經(jīng)毒素作為一種肽已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)應(yīng)用于皮下、皮內(nèi)和肌內(nèi)注射［9］。傷口的愈合需要膠原和彈性蛋白的合成，許多參與合成膠原和彈性蛋白的酶需要銅的作用而發(fā)揮功效［10］，化妝品中應(yīng)用最多的載體肽就是將銅運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)部［10］。該原理被應(yīng)用于大鼠傷口治療中有明顯效果，但臨床試驗(yàn)中并未見有明顯療效［10］。信號肽多見于細(xì)紋和粗皺紋，體內(nèi)試驗(yàn)表明其具有減少膠原酶分解和刺激人真皮成纖維細(xì)胞增長，使皮膚看起來更有彈性，皺紋的寬度和長度能得到有效的改善［11–12］。市場上銷售的棕櫚酰肽藥物化妝品就是基于這個原理，刺激人真皮成纖維細(xì)胞生成，并下調(diào)彈性蛋白表達(dá)［10］。還有棕櫚酰五肽-3同樣利用該原理，提高膠原和纖維連接蛋白的生成，達(dá)到臨床上改善細(xì)紋和皺紋的效果［4］。

除此之外，還有些新型肽也被廣泛應(yīng)用，比如棕櫚酰四肽-7通過抗皮膚下垂達(dá)到抗皺抗衰老目的［13］；三肽-1和肌肽等通過抗羰基化清除自由基達(dá)到護(hù)膚的目的［13］；二肽-2和乙酰四勝肽-5可以抑制血管緊張素的轉(zhuǎn)換而促進(jìn)血液循環(huán)，從而改善水腫［13］；還有棕櫚酰六肽能促進(jìn)真皮修復(fù)［13］等。除具有抗皺抗衰老作用的肽被廣泛應(yīng)用于化妝品中，具有美白祛斑、豐胸、減肥和促進(jìn)毛發(fā)生長的肽也逐漸成為熱點(diǎn)［13］。皮絲素肽因具有保濕、抑制黑色素形成而被應(yīng)用于化妝品中［14］。蠶絲蛋白及其衍生物也因具有保濕、防曬美白等功效早在20世紀(jì)就被應(yīng)用于化妝品中［15］。

3 化妝品中肽的檢測意義及肽的檢測方法

肽在化妝品的應(yīng)用已發(fā)展為較成熟階段，不同濃度的多肽對修復(fù)皮膚損傷、改善皺紋或其它功效方面都有明顯區(qū)別［16］，而過量使用多肽則會導(dǎo)致真皮過敏反應(yīng)等副作用［17］。因此在化妝品研發(fā)制造過程中，為使護(hù)膚效果最佳、生產(chǎn)成本最低、性價比在市場上有競爭力，必須嚴(yán)格考量多肽的使用和添加量。另一方面，從保障消費(fèi)者權(quán)益和安全健康方面考慮，為使消費(fèi)者免受不良反應(yīng)的侵害，對化妝品中肽的定量檢測必不可少。

目前關(guān)于化妝品中肽的檢測國內(nèi)外報道較少，國內(nèi)沒有統(tǒng)一的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。肽的檢測方法多應(yīng)用于食品、藥物和臨床等領(lǐng)域，主要方法包括凱氏定氮法、熒光檢測技術(shù)、化學(xué)發(fā)光檢測法、電泳法、比色法、酶聯(lián)免疫吸附劑測定法、色譜法等。下列方法的原理及應(yīng)用可為化妝品中肽的檢測方法的建立提供理論依據(jù)。

3.1 凱氏定氮法

凱氏定氮法是一種測定化合物或混合物中總氮量的方法。在催化劑存在的條件下，用濃硫酸消化肽，將有機(jī)氮轉(zhuǎn)變成銨鹽，然后在一定酸度條件下將銨鹽轉(zhuǎn)化為氨，再用過量的硼酸液吸收餾分，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，就可計算出樣品中氮的含量。由于肽的含氮量是不變的，通過計算可以得出肽的含量。該法包含消化、蒸餾、吸收和滴定四個步驟。陳智慧等［18］利用凱氏定氮法測定食品中蛋白質(zhì)的含量，取200 g樣品與催化劑和濃硫酸一起加熱消化，分解蛋白質(zhì)，待內(nèi)容物全部碳化、液體變成透明藍(lán)綠色后繼續(xù)加熱微沸30 min，冷卻后轉(zhuǎn)移定容，往水蒸氣發(fā)生瓶中加入硫酸和甲基橙指示劑，使溶液呈酸性，在接受瓶中加入混合指示劑和硼酸，從反應(yīng)管內(nèi)準(zhǔn)確吸取消化液10 mL，加入10 mL氫氧化鈉溶液，加熱蒸餾水發(fā)生瓶中的水，指示劑變綠后再蒸餾10 min，冷凝管提離液面后再蒸餾1 min，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定接受瓶內(nèi)的硼酸至終點(diǎn)。該方法操作簡單，成本較低，定量準(zhǔn)確，精密度高，但存在費(fèi)時較長、試劑消耗大、檢測結(jié)果影響因素較多的缺陷，測量結(jié)果的誤差主要來源于操作條件，因此操作時需十分注意［18–19］。

3.2 熒光檢測技術(shù)

Vlaskin［20］和Gulikova等［21］利用熒光技術(shù)測定鵝膏素肽的含量。該法是一種光譜分析法，利用肽與化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)后產(chǎn)生新的熒光波段，然后進(jìn)行測定。溴化乙啶的最大吸收波長為610 nm，鵝膏素肽與溴化乙啶反應(yīng)，于560，525 nm處出現(xiàn)新的波峰，可維持15～30 min，進(jìn)而利用熒光光譜進(jìn)行分析定量。Vlaskin［20］將5～6 g蘑菇樣品切成小塊，加入pH 8.0的磷酸鹽緩沖液，充分混勻，于玻璃管內(nèi)靜置10～15 min，提取上層溶液3.5 mL，加入0.5 mL溴化乙啶，激發(fā)波長為470 nm，在20℃時置于熒光分光計中檢測。該方法操作簡單，檢測快速，靈敏度較高。

3.3 化學(xué)發(fā)光檢測法

某些肽分子可以與化學(xué)試劑發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生微弱的化學(xué)發(fā)光，可利用測量照度進(jìn)行定量分析。有關(guān)肽的發(fā)光原理尚沒有報道。Komandoor［22］利用該方法對肌肽進(jìn)行定量分析，在肌肽溶液中加入添加劑氫氧化鈉和氧化劑H5IO6，NaIO4，(NH4)2S2O8，K3Fe(CN)6+H2O2，使樣品呈堿性，pH 值在10.5～11.5之間，該方法檢測沒有時間延遲，樣品注入和讀取數(shù)值只需10 s，并且操作簡單，但該方法要求被測肽有較高的純度，過多的雜質(zhì)如硫化物、二硫蘇糖醇和L-半胱氨酸、抗壞血酸、氯化鈣、氯化鎂、D-甘露糖醇、肼等會影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性［22–23］。

3.4 電泳技術(shù)

電泳技術(shù)包括三甲基甘氨酸(Trincine)–聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳和毛細(xì)管電泳。與傳統(tǒng)的凝膠電泳相比，三甲基甘氨酸–聚丙烯酰胺凝膠電泳延長了電泳時間。曹佐武［24］利用該方法取10 μL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，煮沸5 min，使十二烷基硫酸鈉(SDS)與蛋白質(zhì)結(jié)合變性，點(diǎn)入凝膠的點(diǎn)樣孔中，外槽加入正極電泳緩沖液，內(nèi)槽加入負(fù)極電泳緩沖液，制成Tricine–SDS–PAGE三層凝膠電泳系統(tǒng)，用恒流20 mA電泳3 h，使用染色劑考馬斯亮藍(lán)，用凝膠成像儀成像。該方法可顯著提高小分子肽的分辨率。毛細(xì)管電泳因具有高分辨率和高靈敏度等特點(diǎn)而較多應(yīng)用于蛋白質(zhì)水解物肽分布的研究［25］。

3.5 比色法

一些小分子肽可以利用與化學(xué)試劑發(fā)生顯色反應(yīng)來定量。例如比色法檢測肌肽，在弱堿性條件下，2，4-二硝基氟苯可與肌肽發(fā)生顯色反應(yīng)，于波長430 nm處有強(qiáng)吸收［25］。肌肽也可與氫氧化鈉、鹽酸和鄰苯二甲醛發(fā)生顯色反應(yīng)，并于波長 640 nm 處有強(qiáng)吸收［25］。早在 1983 年，Aleksander［26］報道過該原理檢測肽的應(yīng)用，樣品為鵝的胸部和腿部肌肉，用三氯乙酸稀釋勻漿，在肌肽和鵝肌肽提取液中按順序加入氫氧化鈉、鄰苯二甲醛和鹽酸溶液，依次呈現(xiàn)玫瑰紅色、紫色和藍(lán)色的顏色變化，于最大吸收波長640 nm處檢測。該方法回收率良好，游離態(tài)氨基酸對其測量結(jié)果影響較小。

雙縮脲法也是比色法的一種，雙縮脲試劑是一個堿性的含銅試液，呈藍(lán)色，由氫氧化鉀溶液、酒石酸鉀鈉和幾滴1%硫酸銅溶液配制而成。當(dāng)?shù)孜镏泻须逆I時，試液中的銅與多肽配位，配合物呈紫色，于波長540 nm處有強(qiáng)吸收，利用比色法進(jìn)行定量。任國譜等［27］利用該方法對低聚肽定量，樣品為奶粉，取樣品5 g，用蒸餾水定容至50 mL，取2.5 mL樣品溶液，用等體積的200 g/L的三氯乙酸溶液沉淀蛋白質(zhì)，混勻，離心，取上清液，用10%的三氯乙酸定容至50 mL，取6 mL定容后的溶液，加入4 mL雙縮脲試劑，混勻，用紫外分光光度計測量其于540 nm處的吸光度，對照標(biāo)準(zhǔn)工作曲線查得肽的質(zhì)量濃度。該方法回收率良好，測量結(jié)果受環(huán)境影響較小，但鐵、鋅和鈣離子的存在會使肽的測量結(jié)果偏低。

3.6 酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）法

ELISA法利用抗體與抗原之間存在的特異反應(yīng)，將抗體或抗原與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，用于肽的定量分析。ELISA法多用于臨床分析，樣本多為血液、體液和尿液等。該方法較多應(yīng)用于臨床毒肽的中毒檢測，Staack等［28–31］較早應(yīng)用ELISA試劑盒進(jìn)行鵝膏毒肽中毒的臨床檢測，該方法選擇性好、靈敏度高且速度快。

3.7 色譜法

最早應(yīng)用于肽檢測的色譜法多為紙層析、柱層析和薄層層析［32］。近年來，高效液相色譜法和液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法的應(yīng)用日趨廣泛。高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)處理等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動相，被流動相載入色譜柱(固定相)內(nèi)，由于樣品溶液中各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中做相對運(yùn)動，經(jīng)過反復(fù)多次的吸附、解吸的分配過程，各組分在移動速度上會產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，數(shù)據(jù)以圖譜形式呈現(xiàn)出來。肽分子溶解在液態(tài)的固定相中，其分子中的肽鍵、羧基等基團(tuán)有相應(yīng)的紫外吸收或肽與某些化合物反應(yīng)生成帶有熒光特性的物質(zhì)，經(jīng)色譜柱分離后進(jìn)入紫外或熒光檢測器進(jìn)行定量。也有些肽是采用離子交換色譜法原理進(jìn)行分離［25］。劉芳等［33］將尿液樣本離心取上清液200 μL，加入400 μL pH 7的磷酸鹽緩沖液，于進(jìn)樣瓶中混勻，采用反相色譜柱分離，乙腈和甲酸水為流動相，檢測波長為205 nm，以高效液相色譜法對尿液中微量白蛋白進(jìn)行定量檢測，方法快速、實(shí)用，靈敏度高，非常適合臨床常規(guī)檢測。隨著新技術(shù)的不斷出現(xiàn)和發(fā)展，液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)因其靈敏度高、樣本需要量少等優(yōu)勢，而逐漸在分析化學(xué)中占有一席之地。液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用儀的工作原理是樣品通過液相色譜分離后，各個組分依次進(jìn)入質(zhì)譜檢測器，各組分在離子源被電離，產(chǎn)生帶有一定電荷、質(zhì)量數(shù)不同的離子。不同離子在電磁場中運(yùn)動行為不同，采用質(zhì)量分析器按不同質(zhì)荷比把離子分開，得到依質(zhì)荷比順序排列的質(zhì)譜圖。通過對質(zhì)譜圖的分析處理，可以得到樣品的定量和定性結(jié)果。孫維宣等［34］建立了液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜檢測動物組織中桿菌肽、粘桿菌肽和維吉尼霉素等多肽抗生素的方法，稱取已切碎的樣品5 g，加入25 mL提取液(400 mL甲醇和1 000 mL 0.1%甲酸水溶液)，混勻離心，取上清液，加入20 mL提取液于殘渣中，重復(fù)提取，合并兩次上清液，加入20 mL正已烷，重復(fù)兩次，棄去上層溶液，下層樣本過固相萃取柱凈化，氮?dú)獯蹈?，?fù)溶，上機(jī)檢測。該方法準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，簡單快速。血清C肽檢測標(biāo)準(zhǔn)化的參考方法采用的就是同位素稀釋液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法［35］。液相色譜–四級桿質(zhì)譜聯(lián)用、液相色譜–離子阱質(zhì)譜聯(lián)用、液相色譜與電噴霧離子化飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用均被普遍應(yīng)用于肽分子的檢測分析中［32］。

4 化妝品中肽測定的計量需求

國際計量委員會物質(zhì)的量咨詢委員會（CCQM）于2014年組織了首個肽純度計量的國際比對，即K115/P55.2，從而保證了肽檢測結(jié)果的溯源性、準(zhǔn)確性。我國在臨床診斷、藥物等領(lǐng)域的肽計量學(xué)表征及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制方面進(jìn)行了戰(zhàn)略部署，目前對化妝品中肽的檢測方法及計量學(xué)研究已迫在眉睫。從上述檢測方法來看，肽的檢測涉及到光譜分析儀器、色譜分析儀器及質(zhì)譜分析儀器等，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性需要依賴合格的分析儀器，肽定量結(jié)果的溯源也需要依賴有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的使用，這些都離不開化學(xué)計量。

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Detection Methods and Metrology Requirements of Peptides in Cosmetics

Xia Lili1, Li Ming2
(1. Yantai City Metrology Institute, Yantai 264001， China; 2. National Institute of Metrology, Beijing 200029, China）

Peptide was applied to cosmetics more and more widely due to its good bioactivity. Types and functions of peptide in cosmetics were introduced. Most peptides have obvious effect of wrinkle removal, anti-aging, skin whitening and spot removing. Considering urgent requirement for detection method of peptide in cosmetics and metrology research,common peptide detection methods at present were summarized, including Kjeldahl determination, fluorescence detection,chemiluminescence detection, electrophoresis, colorimetry, enzyme-linked immunosorbent assay, chromatograph, etc.

cosmetics; peptide; detection; metrology; review

O657

A

1008–6145(2017)05–0119–04

10.3969/j.issn.1008–6145.2017.05.030

*國家國際科技合作專項(2014DFA31810)

聯(lián)系人：夏黎黎；E-mail: 15563895853@163.com

2017–05–31