人工栽培蛹蟲草菌種培養(yǎng)液發(fā)酵生產(chǎn)工藝流程

焦子偉　陳方園　伍夢(mèng)迪　馬麥燕　努爾買買提　孫清花

摘要 蛹蟲草是一種珍貴的藥（食）用真菌，其功效與野生的冬蟲夏草相似。目前已對(duì)蛹蟲草子實(shí)體進(jìn)行了人工栽培研究與示范。為了大規(guī)?；瘜?duì)蛹蟲草子實(shí)體進(jìn)行人工栽培，需要進(jìn)行大量?jī)?yōu)質(zhì)蛹蟲草菌種培養(yǎng)液配備。因此，在已有研究的基礎(chǔ)上，從優(yōu)化發(fā)酵工藝方面入手，篩選出了最佳的發(fā)酵優(yōu)化條件，提出了蛹蟲草菌種培養(yǎng)液發(fā)酵生產(chǎn)工藝的關(guān)鍵控制要點(diǎn)，并對(duì)蛹蟲草菌株種子液發(fā)酵生產(chǎn)中菌株活化、接種、液體搖培、發(fā)酵罐調(diào)試、發(fā)酵罐封裝滅菌、發(fā)酵培養(yǎng)、保存等方面提出了具體的、明確的技術(shù)要求，為批量制備蛹蟲草菌種培養(yǎng)液提供技術(shù)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 蛹蟲草；人工栽培；種子液；擴(kuò)大生產(chǎn)；工藝流程

中圖分類號(hào) S567.35 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1007-5739（2016）21-0075-01

蛹蟲草（Cordyceps militaris）是一種珍貴的藥（食）用真菌，寄生于鱗翅目昆蟲蛹體后能形成真菌與昆蟲復(fù)合體，屬子囊菌綱，肉座菌目，麥角菌科，蟲草屬，與冬蟲夏草（C.sinensis）同屬異種，故又名北冬蟲夏草、北蟲草、蛹草、蛹草菌等[1-4]。已有研究表明，蛹蟲草子實(shí)體中具有多種藥用成分如蟲草素、多糖和蟲草酸，具有滋肺益氣、增精益腎、止血化痰、抑制腫瘤、延緩衰老、增強(qiáng)免疫力等作用，并在市場(chǎng)上得到廣泛應(yīng)用[5-6]。由于野生蛹蟲草大面積采挖已面臨枯竭，目前人工蛹蟲草已廣泛栽培，在蛹蟲草的人工栽培條件、化學(xué)成分組成、藥理作用、臨床醫(yī)療保健功效等方面取得了較大進(jìn)展[6-7]。筆者也從新疆地區(qū)采集野生蛹蟲草子實(shí)體進(jìn)行了分離得到優(yōu)良菌株，進(jìn)行了人工栽培研究與示范，也取得了較好的效果[8]。為了大規(guī)模化對(duì)蛹蟲草人工栽培，需要對(duì)批量?jī)?yōu)質(zhì)蛹蟲草菌懸液進(jìn)行制備，才能滿足擴(kuò)大再生產(chǎn)需要。為此，筆者在已有實(shí)驗(yàn)室裝備和研究的基礎(chǔ)上，從優(yōu)化發(fā)酵工藝方面入手，對(duì)發(fā)酵罐中培養(yǎng)調(diào)節(jié)溫度、pH值、通氣量等因素進(jìn)行了控制，篩選出了最佳的發(fā)酵優(yōu)化條件，制備的種子液滿足擴(kuò)大再生產(chǎn)的需要。現(xiàn)對(duì)蛹蟲草菌種培養(yǎng)液發(fā)酵生產(chǎn)工藝流程進(jìn)行了總結(jié)，以期為批量制備蛹蟲草種子培養(yǎng)液提供技術(shù)依據(jù)。

1 供試菌株

供試菌株已經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)單子囊孢子分離，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定與人工篩選，獲得了不同交配型MAT1-1和MAT1-2代表菌株[8-9]。

2 培養(yǎng)基制備

改良馬鈴薯（PDA）固體培養(yǎng)基[10]：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，瓊脂16 g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）2 g，七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）1 g，復(fù)合VB 25 mg，用水補(bǔ)至1 000 mL，pH值 6.5～7.0。改良PD培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，復(fù)合VB 25 mg，pH值6.5～7.0。種子發(fā)酵培養(yǎng)基采用改良PD培養(yǎng)基。

3 工藝流程

3.1 倒平板

將改良型PDA固體培養(yǎng)基加熱熔化，待溫度冷卻至55～60 ℃時(shí)在無菌操作下倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基冷卻凝固后倒放備用。

3.2 活化

從冰箱中取出不同交配型MAT1-1和MAT1-2的蛹蟲草優(yōu)良菌種，在無菌操作下分別接種于改良型PDA培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱21 ℃±1 ℃光照培養(yǎng)15～20 d，待菌株長(zhǎng)至近培養(yǎng)皿邊緣時(shí)放置4 ℃冰箱備用。

3.3 接種

將長(zhǎng)滿菌株的培養(yǎng)基從冰箱中取出，無菌條件下用滅菌牙簽挑取少量粉色的分生孢子，接種至裝有滅好菌的改良PD液體培養(yǎng)基的錐形瓶中。

3.4 液體搖培

將含有不同交配型的接種好的錐形瓶放在搖柜中進(jìn)行搖培，170 r/min，（21±1） ℃下恒溫震蕩培養(yǎng)3～4 d，獲得許多含有小米粒的菌絲球的少量種子菌懸液。

3.5 種子液擴(kuò)大生產(chǎn)

以LiFlus GX發(fā)酵罐為例，進(jìn)行了蛹蟲草菌株種子液擴(kuò)大生產(chǎn)，具體如下。

3.5.1 發(fā)酵罐調(diào)試。

（1）pH電極405-BPAS pH值校準(zhǔn)。配制校準(zhǔn)液（pH值分別為4.01和6.86），開機(jī)點(diǎn)主頁(yè)面的calibration.繼續(xù)pH calibration，先用蒸餾水潤(rùn)洗點(diǎn)擊，再用餐巾紙擦拭，將配制好的標(biāo)準(zhǔn)液分別放入50 mL試管中，倒入15～20 mL即可。并將電極先后插入pH值6.86、pH值4.01的校準(zhǔn)液中，靜置與校準(zhǔn)。

（2）溶氧電極INPRO 6800溶氧電極準(zhǔn)備。將溶氧電極的下端5 cm處電極頭旋開，用拇指蓋抵住電極頭下端金屬圈將其內(nèi)部結(jié)構(gòu)取出來。在取出來的內(nèi)部結(jié)構(gòu)中倒?jié)M極化液，注意不能有氣泡，否則底部的膜會(huì)破。

3.5.2 發(fā)酵罐封裝滅菌。清洗發(fā)酵罐LiFlus GX各個(gè)部位，然后將各個(gè)電極安裝到發(fā)酵罐上，將適量酸、堿倒入瓶中，并注意用皮筋底部扎口，目的是防止腐蝕皮管和發(fā)酵罐。并將各個(gè)出口用封口膜緊緊封住，用報(bào)紙包住冷凝管滅菌，一般121 ℃滅菌15～20 min，完成后快速移到無菌操作臺(tái)下紫外滅菌30 min。

3.5.3 發(fā)酵培養(yǎng)。在無菌條件下按滅菌好的發(fā)酵培養(yǎng)基：種子菌懸液為10～15∶1（體積比）的比例倒入發(fā)酵罐，封好后移出。連接各個(gè)電極，開通各個(gè)電源，通過蠕動(dòng)泵調(diào)節(jié)酸、堿通過皮管到達(dá)發(fā)酵罐并調(diào)成自動(dòng)模式。設(shè)置發(fā)酵條件（溫度20～25 ℃，pH值6.0～6.5，通氣量1 mL/min），培養(yǎng)2～3 d，菌絲球布滿培養(yǎng)液，發(fā)酵完成。

3.5.4 種子液保存。對(duì)超凈工作臺(tái)滅菌30 min，將發(fā)酵完成的發(fā)酵罐移到超凈工作臺(tái)中，用酒精棉球擦拭整個(gè)發(fā)酵罐體，將菌種培養(yǎng)液倒入已預(yù)先滅菌好的玻璃容器內(nèi)，并用標(biāo)鑒標(biāo)注時(shí)間、條件、工作人員等信息，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

4 參考文獻(xiàn)

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