周金慧 張文文 王欣然 張金振 金玥 楊樹鵬 趙文 陳蘭珍 問亞琴王鵬 黃京平 劉婷婷 李熠

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，北京100093）

2016年國內(nèi)外蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全研究進(jìn)展

周金慧 張文文 王欣然 張金振 金玥 楊樹鵬 趙文 陳蘭珍 問亞琴王鵬 黃京平 劉婷婷 李熠

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，北京100093）

本文通過查閱2016年國內(nèi)外涉及蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全的研究論文和專利，分析了其在多個(gè)數(shù)據(jù)庫的產(chǎn)品分類和研究熱點(diǎn)分布情況，進(jìn)而總結(jié)了該領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展。本文主要針對在蜂產(chǎn)品中農(nóng)獸藥殘留分析、重金屬分析、溯源分析、摻假鑒別等方面的能夠提高分析效率、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度和靈敏度的新方法、新技術(shù)以及在原有技術(shù)上有較大改進(jìn)的研究，展開簡單的詮釋和分析。通過探討國內(nèi)外最新的研究進(jìn)展，能夠深入、全面地了解同領(lǐng)域內(nèi)的其他專家關(guān)注的焦點(diǎn)，為以后的研究提供更多的研究思路。

蜂產(chǎn)品，質(zhì)量安全，農(nóng)獸藥殘留，重金屬分析，溯源分析，摻假鑒別

1 文獻(xiàn)分布情況

截止至2016年12月初，從美國湯姆森科技信息集團(tuán)（web of science）、谷歌學(xué)術(shù)（Google Scholar），愛思唯爾（Sciencedirect）、斯普林格（Springerlink）、EBSCO、美國分析化學(xué)協(xié)會(huì)（ACS）、英國分析化學(xué)協(xié)會(huì)（RSC）和Wiley等數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果顯示，2016年大約有169篇與蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全相關(guān)的英文文獻(xiàn)被SCI期刊收錄，涉及蜂蜜的有135篇，蜂膠20篇，蜂王漿6篇，蜂花粉4篇，蜂蠟3篇和蜂毒1篇（圖1）。涉及的雜志主要包括Food chemistry、Food Analytical Method、Talanta、Journal of separation Science、Journal Food Additives&Contaminants、Journal of Chromatography A、Journal of Agricultural and Food Chemistry、Journal of the Science of Food and Agriculture、Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis和MethodX等。從中國知網(wǎng)（CNKI）、維普網(wǎng)（VIP）、萬方數(shù)據(jù)知識(shí)服務(wù)平臺(tái)（wanfangdata）和國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局檢索數(shù)據(jù)庫（SIPO）的搜索數(shù)據(jù)顯示，2016年與蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全相關(guān)的中文學(xué)術(shù)文獻(xiàn)約為74篇，其中涉及蜂蜜的有33篇，蜂王漿10篇，蜂膠18篇，蜂花粉13篇，蜂蠟、蜂毒沒有報(bào)道，此外還有6項(xiàng)專利（圖1）。主要涉及分析測試學(xué)報(bào)、分析化學(xué)、食品研究與開發(fā)、中國蜂業(yè)、食品工業(yè)、食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)、蜜蜂雜志、光譜學(xué)與光譜分析、高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)、質(zhì)量探索、燕山大學(xué)學(xué)報(bào)、山東化工、廣東化工、安徽農(nóng)業(yè)化學(xué)、中國食品學(xué)報(bào)、食品研究與開發(fā)、食品科學(xué)、江蘇調(diào)味副食品和食品工業(yè)科技等雜志。

2 研究進(jìn)展

圖1 2016年國內(nèi)外蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全研究文獻(xiàn)分布概況

2.1 農(nóng)藥和獸藥殘留分析

蜂蜜的研究主要包括外源污染物（農(nóng)藥、獸藥、微生物和重金屬）殘留分析、內(nèi)源組分分析、溯源分析以及摻假鑒別四個(gè)方面。農(nóng)藥和獸藥殘留分析類的文章主要集中于建立新的樣品前處理方法和儀器分析方法，進(jìn)而減少雜質(zhì)干擾，提高痕量分析準(zhǔn)確度和靈敏度的方面。重金屬分析主要是利用原子吸收光譜法、原子熒光光譜法、穩(wěn)定同位素質(zhì)譜法和電感耦合等離子體質(zhì)譜法建立不同種類蜂蜜中各種元素的分析方法。此外還利用質(zhì)譜技術(shù)對蜂蜜中芽孢桿菌進(jìn)行鑒定與分型。內(nèi)源組分分析主要是利用不同的儀器分析技術(shù)分析蜂蜜中的氨基酸、淀粉酶、糖類物質(zhì)和脂肪酸。溯源分析主要基于蜂蜜的理化性質(zhì)、揮發(fā)性組分、礦物元素、指紋圖譜技術(shù)建立蜜源產(chǎn)地和蜜源植物的鑒別方法。而摻假研究主要是集中在蜂蜜中非法添加大米糖漿、淀粉糖漿或其他非法添加劑鑒別方法的開發(fā)。

中性解吸-電噴霧萃取電離質(zhì)譜技術(shù)是利用斜對放置的進(jìn)氣管和樣品管提取和凈化待測樣品，再將樣品流引入電噴霧萃取電離源，帶電液滴與樣品液滴進(jìn)行碰撞融合，發(fā)生液液萃取和電荷轉(zhuǎn)移進(jìn)而達(dá)到去溶劑的效果，最終對待測物進(jìn)行質(zhì)譜分析。該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)用于蜂蜜中農(nóng)藥和獸藥的殘留分析?；谥行越馕?電噴霧萃取電離質(zhì)譜，無需樣品預(yù)處理即可直接檢測蜂蜜中四環(huán)素，檢出限為1.08 ng/ml。同時(shí)對市售蜂蜜進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)2種蜂蜜中含有痕量的四環(huán)素[1]。同樣在無需樣品預(yù)處理的條件下，利用該技術(shù)建立了蜂蜜中敵敵畏直接快速檢測的方法，檢出限為1.0 ng/ml(S/N= 3)[2]。該技術(shù)無需復(fù)雜的樣品前處理，靈敏度高、精密度好、分析速度快且特異性強(qiáng)，能夠耐受復(fù)雜基質(zhì)的影響，是一種快速檢測蜂蜜中四環(huán)素和敵敵畏的方法，同時(shí)也可為其他蜂產(chǎn)品中多種污染物的直接、快速分析提供借鑒和參考。

液液微萃取技術(shù)是微量萃取劑在分散劑作用下形成分散的有機(jī)微液滴，均勻的分散在樣品水溶液中，從而形成水/萃取劑/分散劑乳濁液體系，目標(biāo)分析物在水相和微量萃取劑之間達(dá)到萃取平衡，并最終分配到有機(jī)相中，離心分層，得到目標(biāo)化合物。其優(yōu)點(diǎn)是擴(kuò)大了有機(jī)萃取劑和水相之間的接觸面積，加快了萃取平衡的速度，使目標(biāo)化合物迅速萃入萃取劑中，提高了萃取效率和富集倍數(shù)，集采樣、萃取和濃縮于一體，萃取時(shí)間短，且方法準(zhǔn)確、靈敏，是一種微量殘留的快速檢測方法。親水的離子液體[N4444]Cl和離子交換試劑KPF6可形成疏水的[N4444][PF6]，從蜂蜜中提取苯甲酰脲類殺蟲劑，提取后的溶液在室溫下固化并利用濾膜過濾收集。該方法不需要分散溶劑、渦動(dòng)混合、超聲提取和離心等步驟[3]。分散液液微萃取技術(shù)也用于蜂蜜中有機(jī)氯農(nóng)藥的殘留檢測，1,2-二溴甲烷作為提取劑，乙腈作為分散劑，基于該方法可使有機(jī)氯的檢測限和定量限分別達(dá)到0.004~0.07ng/g和0.02~0.3 ng/g，提取效率可達(dá)91~100%，富集因子范圍為171~199[4]。氯苯作為提取溶劑，加入氯化鈉作為分散劑并提高離子強(qiáng)度，然后通過優(yōu)化萃取時(shí)間和溶劑量來提取蜂蜜中19種農(nóng)藥，最終利用氣相色譜-質(zhì)譜定量分析[5]。利用1,2-二溴乙烷作為提取劑，超聲波輔助提取并恢復(fù)至室溫，離心后從液滴中吸取樣液定量分析蜂蜜中的毒死蜱和有機(jī)氯農(nóng)藥，該方法的檢出限和定量限分別為0.003~0.06ng/g和0.01~0.2 ng/g，提取效率為91~100%富集因子范圍為168~192[6]。此外，中空纖維液液微萃取法提取和凈化蜂蜜中的磺胺類藥物[7]，鹽去乳化分散液液微萃取法提取和凈化蜂蜜中的三嗪類除草劑[8]，渦動(dòng)輔助的中空纖維液液微萃取法提取和凈化蜂蜜中的阿苯達(dá)唑和三氯苯咪唑[9]，固相萃取結(jié)合液液微萃取法提取和凈化蜂蜜中的溴氰菊酯和氯菊酯[10]等，均為在傳統(tǒng)的液液微萃取技術(shù)基礎(chǔ)上采取微小的技術(shù)改動(dòng)，從而達(dá)到更好的提取和凈化效果，并廣泛應(yīng)用于蜂蜜中農(nóng)藥和獸藥的殘留檢測。

QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,ruggedand safe)技術(shù)已經(jīng)在農(nóng)藥和獸藥殘留研究中得到了廣泛應(yīng)用。Hsiang等[11]利用酸化乙腈溶解蜂蜜樣品，無水硫酸鈉和氯化鈉用于提取樣品中的酰胺醇類藥物，上清液采用無水硫酸鈉、C18粉、C18封端吸附劑和QuE ZSep填料凈化雜質(zhì)，串聯(lián)質(zhì)譜定量。蜂蜜中硝基呋喃和硝基咪唑類藥物多殘留分析采用優(yōu)化過的QuEChERS技術(shù)進(jìn)行提取和凈化，乙腈提取后，加入硫酸鎂和氯化鈉渦動(dòng)混合凈化雜質(zhì)，上清液進(jìn)行衍生化，氮吹復(fù)溶后串聯(lián)質(zhì)譜分析[12]。此外，該技術(shù)還廣泛應(yīng)用于多種農(nóng)藥的殘留分析，其關(guān)鍵點(diǎn)在于針對不同的污染物選擇不同的提取劑和凈化填料，并對使用量進(jìn)行優(yōu)化[13,14]。

酶聯(lián)免疫技術(shù)尤其是試劑盒方法在蜂蜜中獸藥的篩查取得了顯著的效果。利用四環(huán)素類藥物作為半抗原偶聯(lián)蛋白后制備單克隆抗體，同時(shí)然后利用檸檬酸鈉還原法制備膠體金，進(jìn)而制備膠體金標(biāo)記單克隆抗體生產(chǎn)試紙條。利用基于試紙條的免疫色譜法快速定性和定量分析蜂蜜中殘留的四環(huán)素類藥物[15]。

分子印跡技術(shù)是指當(dāng)模板分子（印跡分子或代測物）與聚合物單體接觸時(shí)會(huì)形成多重作用點(diǎn)，通過聚合過程這種作用就會(huì)被記憶下來，當(dāng)模板分子除去后，聚合物中就形成了與模板分子空間構(gòu)型相匹配的具有多重作用點(diǎn)的空穴，這樣的空穴將對模板分子及其類似物具有選擇識(shí)別特性?；谟H水分子印跡樹脂建立了蜂蜜中三嗪類除草劑的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，其中利用間苯二酚和三聚氰胺作為雙功能單體，甲醛作為交聯(lián)基團(tuán)，莠滅凈作為模板縮聚合成分子印跡樹脂。該方法檢測限范圍可達(dá)0.02~0.15 ng/g，回收率范圍為83± 4~97±4%[16]。Madiha等建立了基于免疫印跡技術(shù)的生物傳感器檢測蜂蜜中殘留的四環(huán)素，苯胺功能化的金納米顆粒通過電聚合制備分子印跡聚合物，檢測限可達(dá)2.24×10-16M，回收率范圍為101.8~106.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于8.3%[17]。

電化學(xué)技術(shù)在污染物的定量分析中也得到了廣泛的應(yīng)用。電極傳感器技術(shù)包括差分脈沖，方波和吸附溶出伏安法已經(jīng)在污水、河水、人尿、制藥和牛奶樣品中四環(huán)素測定方面取得一定的研究進(jìn)展。銻膜微電極傳感器技術(shù)也可應(yīng)用于蜂蜜中四環(huán)素類藥物的殘留檢測，首先利用方波陰極溶出伏安法和玻璃碳電極制備銻膜電極傳感器，基于高效的Draper Lin組分設(shè)計(jì)方法優(yōu)化pH值和銻濃度等參數(shù)，最終在0.40～3.00 μM濃度范圍內(nèi)檢測限可達(dá)0.15 μM[18]。此外利用垂直二氧化硅的二元組裝改性的氧化銦錫電極介電膜和圓柱形表面活性劑膠束結(jié)合的電化學(xué)檢測技術(shù)可檢測蜂蜜中殘留的氯霉素。在直徑為2～3nm的硬電極介電膜支持和限定的十六烷基三甲基溴化銨的軟表面活性劑膠束，其具有能夠從樣品溶液中提取和濃縮親脂性有機(jī)物質(zhì)中碳?xì)浠衔锏哪芰?。因此，表面活性劑膠束和電極介電膜修飾的電極表現(xiàn)出的針對氯霉素的分析能力優(yōu)于裸露和垂直硅孔道修飾的電極。在優(yōu)化條件下使用差示脈沖伏安法獲得用于氯霉素分析的兩個(gè)線性動(dòng)態(tài)濃度測定范圍，即0.1～3.6 mg/kg和3.6～15.0mg/kg，并獲得了檢測低限40μg/kg[19]。

蜂王漿和蜂膠中的污染物殘留也是不容忽視的問題。利用快速溶劑萃取-凝膠滲透色譜凈化-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法能夠提取、凈化并定量測定蜂花粉中硝基咪唑類化合物，樣品以乙酸乙酯為萃取溶劑經(jīng)快速溶劑萃取儀萃取，凝膠滲透色譜(GPC)凈化，采用Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱分離，以0.15%甲酸溶液(A)-甲醇(B)為流動(dòng)相。質(zhì)譜采用多反應(yīng)監(jiān)測正離子掃描模式，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線同位素內(nèi)標(biāo)法定量。硝基咪唑類化合物檢出限為1.5μg/kg，定量限為5.0μg/kg[20]。蜂蜜和蜂王漿中四環(huán)素殘留檢測方法較多也相對成熟，但是蜂膠中的報(bào)道較少，這是由于蜂膠基質(zhì)非常復(fù)雜，含有大量的黃酮和酚酸類物質(zhì)等，分析過程中受基質(zhì)的影響很大，導(dǎo)致分析結(jié)果準(zhǔn)確度下降，所以蜂膠中抗生素的檢測方法有待進(jìn)一步的研究和發(fā)展。研究中發(fā)現(xiàn)，采用Mcllvaine緩沖溶液提取蜂膠中的四環(huán)素殘留，以結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似的地美環(huán)素和甲烯土霉素作為四環(huán)素類目標(biāo)物的內(nèi)標(biāo)，采用Oasis HLB柱凈化雜質(zhì)，通過分析比較提取液、內(nèi)標(biāo)的選擇對試驗(yàn)結(jié)果的影響，確定試驗(yàn)方法的線性范圍和定量限，建立的高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法，回收率在74.1～118.8%之間，RSD＜15%，能夠滿足蜂膠產(chǎn)品中四環(huán)素藥物殘留的常規(guī)檢測要求[21]。

2.2 金屬元素分析

金屬元素通常根據(jù)密度大小分為重金屬、輕金屬和準(zhǔn)金屬元素等。蜂產(chǎn)品本身就含有鐵、鈣、銅、鉀等多種有益人體健康的微量元素，此外由于我國土壤和環(huán)境中的重金屬污染日益嚴(yán)重，所以蜂產(chǎn)品中也經(jīng)常殘留鉛、砷和汞等對人體有極大危害的重金屬元素。目前測定蜂蜜中元素的方法主要有基于微波消解法的原子吸收光譜法、原子熒光光譜法、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法和電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）法。采用微波消解法同時(shí)提取蜂蜜、蜂王漿、蜂膠和蜂花粉中的鉛、砷、汞，鉛的趕酸溫度為160℃，砷、汞的趕酸溫度為110℃，該溫度條件既能防止汞的揮發(fā)，又能有效提高工作效率[22]。椴樹蜂蜜是我國東北地區(qū)特色蜜種，采用濕法消解處理椴樹蜜樣品，電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）法測定鋁元素含量，稱取椴樹蜜試樣于高硼硅消解管中，加入硝酸置于電熱消解儀上預(yù)處理，然后升溫至120℃消解2h，其后將樣品在150℃消解至澄清透明，趕酸后將樣品轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中，定容搖勻，回收率在95.83～115.50%之間，線性相關(guān)系數(shù)為0.9999，RSD＜2.62%。該方法測定快速準(zhǔn)確，適于蜂蜜中鋁元素的測定[23]。應(yīng)用微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICPMS)分析椴樹蜂蜜樣品，取蜂蜜樣品于離心管中，在水浴中超聲處理，直到蜂蜜樣品呈清澈液態(tài)，然后將蜂蜜樣品置于酸煮洗凈的中壓消解罐中，加入硝酸和雙氧水，旋緊頂蓋放入微波消解儀內(nèi)，按照設(shè)定的消解程序進(jìn)行微波消解。消解完畢后，待樣品冷卻至室溫，打開消解罐，將消解液轉(zhuǎn)移至離心管中，并用去離子水洗滌消解罐及蓋子3次，合并洗液至離心管中，定容至刻度，混勻，待測分析。每次消解過程中均同時(shí)制備空白試樣和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)試樣。使用該方法可同時(shí)測定椴樹蜂蜜中23種元素的含量[24]。為解決電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定蜂王漿中硒含量時(shí)產(chǎn)生的干擾問題，應(yīng)用動(dòng)態(tài)反應(yīng)池（DRC）技術(shù)，通過對反應(yīng)氣種類、流量及測定元素同位素的優(yōu)化，確定了消除干擾的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)以78Se為分析物，甲烷（CH4）為反應(yīng)氣時(shí)，可有效降低干擾[25]。蜂膠中常見重金屬鉛(Pb)、砷(As)、汞(Hg)、鎘(Cd)和鉻(Cr)的分析過程中的非質(zhì)譜干擾主要源于樣品基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)而影響ICP-MS分析中許多過程，如氣溶膠的產(chǎn)生、氣溶膠的引入離子在接口處的提取和正離子束在質(zhì)譜中間的傳輸?shù)葟?fù)雜過程。通過選擇合適的內(nèi)標(biāo)元素以盡可能地消除非質(zhì)譜干擾。分析過程中的質(zhì)譜干擾主要源于不能分辨相同質(zhì)量物質(zhì)的干擾，包括同量異位素干擾、多原子干擾以及雙電荷離子干擾等。通過選擇無干擾的待測元素同位素、引入He碰撞反應(yīng)池技術(shù)以及減少含水量、降低樣品和載氣流速等優(yōu)化工作條件，以減少在等離子中形成干擾[26]。

（未完待續(xù)）

國家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金資助(CARS-45)。

李熠，研究員，從事蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全研究與評價(jià)工作，E-mail:bricaas_liyi@126.com