張 瑩

（山東濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)寧 272000）

?實(shí)驗(yàn)研究?

大蒜素對(duì)酒精損傷神經(jīng)干細(xì)胞的保護(hù)作用研究

張 瑩

（山東濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)寧 272000）

胎兒酒精綜合征是指胎兒或新生兒由于母親在孕期或哺乳期過(guò)量飲酒而產(chǎn)生的大腦發(fā)育不良及其他畸形。已有研究證實(shí)胎兒酒精綜合征是由于酒精對(duì)于多種神經(jīng)細(xì)胞，尤其是神經(jīng)干細(xì)胞的損傷作用導(dǎo)致的。本研究首先成功建立了體外貼壁培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的方法，然后又MTT比色法檢測(cè)證實(shí)了大蒜素可以減輕酒精對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制作用。本研究揭示了阻止酒精損傷神經(jīng)干細(xì)胞的一個(gè)新方法，為胎兒酒精綜合征的預(yù)防與臨床治療提供了一個(gè)新的途徑。

大蒜素；酒精損傷神經(jīng)干細(xì)胞；研究

胎兒酒精綜合征（Fetal Alcohol Syndrome，F(xiàn)AS）是指胎兒或新生兒由于母親在孕期或哺乳期過(guò)量飲酒而產(chǎn)生的大腦發(fā)育不良及其他畸形。已有研究證實(shí)FAS是由于酒精對(duì)于多種神經(jīng)細(xì)胞，尤其是神經(jīng)干細(xì)胞（Neuronal Stem Cell，NSC）的損傷作用導(dǎo)致的。酒精可以通過(guò)抑制NSC的生長(zhǎng)增殖，乃至導(dǎo)致NSC凋亡，最終抑制神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，導(dǎo)致大腦發(fā)育畸形。

本研究通過(guò)對(duì)體外貼壁培養(yǎng)的NSC的深入研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素對(duì)于酒精導(dǎo)致的NSC的生長(zhǎng)抑制具有明顯的緩解作用。本研究揭示了阻止酒精損傷NSC的一個(gè)新方法，為FAS的預(yù)防與臨床治療提供了一個(gè)新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠（由北京維通利華公司提供）；Neurobasal培養(yǎng)基，B27，GlutMAX（購(gòu)自Gibco公司）；bFGF，EGF（購(gòu)自PeproTech公司）；大蒜素（購(gòu)自上海禾豐制藥有限公司）；Nestin抗體（購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司）；MTT（購(gòu)自Sigma公司）；Multiskana A scent酶標(biāo)儀（Thermo公司產(chǎn)品）。

1.2 方法

1.2.1 NSC的貼壁培養(yǎng)與鑒定

無(wú)菌條件下從孕13.5天的大鼠腹中取出胎鼠，解剖顯微鏡下取出胎鼠的端腦組織。經(jīng)胰酶消化后，機(jī)械吹打并經(jīng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后獲得單細(xì)胞懸液。將之接種于含2% B27，10 ng/μl EGF，10 ng/μl bFGF的Neurobasal培養(yǎng)液中。培養(yǎng)瓶/皿需經(jīng)0.1%多聚賴氨酸處理1 h并經(jīng)無(wú)菌蒸餾水洗滌后，方可使用。細(xì)胞于37度，5% CO2和飽和濕度的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。3天換半液，6天即可用于免疫熒光鑒定或MTT實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

本實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、損傷組（100 mmol酒精）、保護(hù)組（100 mmol酒精+10 μg/ml大蒜素）共三組。

1.2.3 MTT比色法檢測(cè)NSC的生長(zhǎng)增殖情況

接種于96孔板的NSC培養(yǎng)6天后，正常對(duì)照組不作處理，而2個(gè)實(shí)驗(yàn)組則加入相應(yīng)的溶液進(jìn)行處理，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。37度孵育20 h后，每孔加入新鮮配制的MTT（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄培養(yǎng)液并加入150 μl/孔的DMSO，持續(xù)震蕩5 min。將晶體已充分溶解的96孔板置于酶標(biāo)儀中，測(cè)量570 nm時(shí)各孔的OD值。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 NSC的體外貼壁培養(yǎng)與鑒定

NSC在正常貼壁培養(yǎng)6天以后，展現(xiàn)出顯著的集落樣的結(jié)構(gòu)，說(shuō)明在此培養(yǎng)條件下NSC具有良好的增殖能力。我們免疫細(xì)胞化學(xué)染色的結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nestin陽(yáng)性細(xì)胞率可達(dá)90%以上，證實(shí)我們成功培養(yǎng)了貼壁生長(zhǎng)的NSC。

2.2 MTT比色法證實(shí)大蒜素對(duì)酒精損傷NSC的保護(hù)作用

進(jìn)一步的，MTT比色測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常NSCs的存活率（OD值）為0.41±0.02，而酒精處理后，該存活率（OD值）降低至0.15±0.02。更重要的是，大蒜素+酒精組的細(xì)胞存活率（OD值）升至0.27±0.04。上述結(jié)果證實(shí)大蒜素可顯著減少酒精損傷導(dǎo)致的NSC存活率下降。該結(jié)果證明了大蒜素對(duì)于酒精損傷NSC具有顯著的保護(hù)作用。

3 討 論

NSC是神經(jīng)系統(tǒng)各種細(xì)胞的前體細(xì)胞，其可以通過(guò)自我復(fù)制的形式進(jìn)行自我更新以及數(shù)量的維持。另外，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候，NSC還可以定向分化為適當(dāng)類型的神經(jīng)細(xì)胞，對(duì)于大腦正常的程序化發(fā)育具有關(guān)鍵的作用。NSC生長(zhǎng)增殖的紊亂，將直接導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育缺陷。體內(nèi)外的研究已證實(shí)酒精可以抑制NSC的增殖并導(dǎo)致其死亡，這被認(rèn)為是FAS的發(fā)病原因之一。尋找一個(gè)可以保護(hù)NSC免受酒精損傷的藥物，將對(duì)FAS的預(yù)防和治療發(fā)揮積極作用。本研究發(fā)現(xiàn)大蒜素對(duì)于酒精造成的NSC損傷具有顯著的保護(hù)作用。這一發(fā)現(xiàn)，提示孕期或哺乳期的婦女適當(dāng)服食大蒜不僅可以起到殺菌消毒，防癌治癌的作用，而且還可以預(yù)防和治療FAS。這一發(fā)現(xiàn)為FAS的預(yù)防與治療提供了一個(gè)新的角度，將對(duì)提高我國(guó)的人口質(zhì)量提供一定的幫助。

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ISSN.2095-8242.2017.057.11099.02

本文編輯：吳 衛(wèi)