辛伐他汀減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的機制研究

李 楊，石伏軍，張 健

蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)是嚴重危及生命的常見腦血管意外，10%～15%的卒中患者在入院前死于SAH[1]。腦血管痙攣(CVS)作為SAH常見而危險的并發(fā)癥，是SAH后致死致殘的主要原因，一旦發(fā)生，難以逆轉(zhuǎn)[2]。研究表明，在CVS的病理生理過程中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-6、IL-8、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)參與血管內(nèi)皮細胞的損傷[3]。辛伐他汀是臨床常用的調(diào)脂藥物，研究發(fā)現(xiàn)其可預防 SAH后遲發(fā)性 CVS發(fā)生，但其機制還未明確[4]。本研究以免SAH模型為基礎，探討辛伐他汀對兔SAH后遲發(fā)性腦血管痙攣期血管內(nèi)皮細胞TNF-α、IL-6、IL-8和eNOS水平的影響，明確辛伐他汀預防SAH后遲發(fā)性CVS的機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料：DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，超敏二步法免疫組化檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，辛伐他汀(杭州默沙東制藥有限公司)，β-actin(Invitrogen公司)，全蛋白提取試劑盒(南京凱基生物科技公司)，過硫酸銨(GIBICO公司)，IL-6試劑盒(南京建成生物工程研究所)，IL-8試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 實驗分組及模型建立：健康成年雄性新西蘭大白兔36只，體重2 200～3 200 g，購于寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心。隨機分為3組：①SAH組(SAH)，常規(guī)飼養(yǎng)，從枕骨大孔處穿刺進入蛛網(wǎng)膜下腔，注入自體動脈血 1 mL/kg建立蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，48 h后以相同方式再次注血；②SAH+辛伐他汀組(SAH+ SVT組)，常規(guī)飼養(yǎng)，連續(xù)7 d每天給予辛伐他汀 5 mg/kg胃灌，后與SAH組以相同方式處理；③假手術(shù)組(Sham組)，常規(guī)飼養(yǎng)，于相同時間點給予等量生理鹽水。

1.3 標本采集：常規(guī)麻醉開胸，經(jīng)主動脈灌注生理鹽水 (37 ℃) 300 mL和4%多聚甲醛200 mL。取新鮮基底動脈及周圍腦干組織置于冰生理鹽水，立體顯微鏡下分離基底動脈，生理鹽水沖洗血管內(nèi)殘留血液，將標本置于液氮中2 min，再放入-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 免疫組織化學法：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，采用SP法，高壓修復抗原8 min，后續(xù)按二抗試劑盒和DAB顯色試劑盒說明書步驟操作。蘇木素復染，梯度脫水，中性樹膠封片。

1.5 Western blot法：按蛋白提取試劑盒說明提取兔基底動脈組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯影后將X線片掃描入凝膠成像系統(tǒng)進行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 辛伐他汀對基底動脈壁TNF-α表達的影響:采用免疫組化法檢測基底動脈壁TNF-α表達變化，結(jié)果顯示，SAH+SVT組基底動脈痙攣減輕，與SAH組相比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1-圖4(目錄后)，TNF-α表達明顯降低；SAH+SVT組與Sham組TNF-α表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 辛伐他汀對基底動脈壁IL-6和IL-8水平的影響：采用ELISA法檢測基底動脈壁IL-6和IL-8水平，結(jié)果顯示，與SAH組相比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；SAH+SVT組基底動脈壁IL-6和IL-8水平均明顯降低。SAH+SVT組與Sham組IL-6和IL-8水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 辛伐他汀對基底動脈壁eNOS表達的影響：采用Western blot法檢測基底動脈壁eNOS蛋白表達變化，結(jié)果顯示，與SAH組相比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；SAH+SVT組基底動脈壁eNOS蛋白表達明顯降低。SAH+SVT組與Sham組eNOS蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

CVS是SAH最常見且嚴重的并發(fā)癥，常見于蛛網(wǎng)膜下腔中較大的動脈強烈收縮，是動脈瘤破裂死亡的主要原因之一[5]。據(jù)統(tǒng)計，在所有SAH病例中高達50%是致命性的，而存活的患者常伴隨神經(jīng)系統(tǒng)或認知障礙。CVS發(fā)病機制復雜，有研究證實，炎癥反應可能在其發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[6]。

目前研究表明，CVS是由于血管舒張與收縮平衡失調(diào)所致，其中eNOS是調(diào)控血管功能的關(guān)鍵酶，其介導內(nèi)皮依賴性血管舒張反應下降并在炎癥反應中發(fā)揮重要作用，有實驗證實，一氧化氮(NO)替代治療可逆轉(zhuǎn)CVS[7- 8]。實驗表明，SAH后eNOS mRNA和eNOS蛋白水平均下降，SAH大鼠的體外實驗表明內(nèi)皮功能障礙與eNOS蛋白的表達下降有關(guān)[9]。此外，大量實驗和臨床證據(jù)提示，炎癥反應參與了SAH后CVS的發(fā)生和發(fā)展。在SAH尸檢和犬SAH模型中，可見基底動脈內(nèi)膜、中膜及蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)嗜中性粒細胞、巨噬細胞浸潤，且SAH后炎性細胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β等表達水平明顯增加。同時Wu Wei等的研究表明，腦動脈周圍的嚴重炎癥可導致中至重度的持續(xù)CVS[10]。Clatterbuck等研究發(fā)現(xiàn)，給猴SAH模型靜脈應用抗CDll/CD18單克隆抗體可明顯降低CVS的發(fā)生[11]。TNF-α是機體參與炎癥和免疫應答反應的重要因子，其誘導內(nèi)皮細胞和白細胞產(chǎn)生黏附分子，增強后者對毛細血管內(nèi)皮的黏附力，引起白細胞脫顆粒釋放自由基、蛋白酶和毒性代謝產(chǎn)物，誘發(fā)級聯(lián)反應，從而損傷炎癥區(qū)域細胞[12-13]。有研究證實，TNF-α在急性SAH的病理生理過程中參與了這種損傷作用，且TNF-α水平變化與患者基底動脈血流量變化在時間和程度上相一致[14]。辛伐他汀能抑制內(nèi)源性膽固醇合成，目前臨床上已被廣泛用于治療高脂血癥。隨著他汀類新藥的不斷開發(fā)，其抗炎、抗氧化、抑制血管平滑肌細胞增殖及調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞功能等作用也越來越被國內(nèi)外學者關(guān)注和認可[15]。因此，辛伐他汀可能是通過抑制炎性因子表達，減輕SAH后血管局部炎癥反應，從而緩解CVS。

本研究顯示，辛伐他汀能夠減輕基底動脈痙攣，下調(diào)TNF-α和eNOS蛋白表達，同時降低IL-6和IL-8水平，這進一步證實辛伐他汀可通過抑制炎性細胞因子表達，降低 SAH 后血管壁局部的炎癥反應，減少組織損傷，維持血管正常功能，緩解CVS，其更為詳細的作用機制有待我們進一步研究。

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