GKN1在胃GIST的表達及其與生物行為的相關性研究*

羅 云， 王崇樹， 謝夢憶， 張雨順， 符致明， 陳佳慧， 謝賢鏞

(1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院胃腸外科； 2.川北醫(yī)學院肝膽胰腸研究所； 3.南充市中心醫(yī)院普外二科； 4.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科, 四川 南充 637000)

GKN1在胃GIST的表達及其與生物行為的相關性研究*

羅 云1,2， 王崇樹1△， 謝夢憶2， 張雨順2， 符致明2， 陳佳慧3， 謝賢鏞4

(1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院胃腸外科； 2.川北醫(yī)學院肝膽胰腸研究所； 3.南充市中心醫(yī)院普外二科； 4.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科, 四川 南充 637000)

目的： 檢測胃動蛋白基因1(gastrokine 1,GKN1)在胃間質(zhì)瘤和瘤旁組織中的表達，分析其與GIST生物學行為的關系，方法： 選取30例川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科胃GIST及瘤旁組織石蠟標本，應用免疫組化檢測GKN1在胃GIST和瘤旁組織中的表達；收集20例川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院普外科手術(shù)并經(jīng)病理及免疫組化確診的胃GIST腫瘤組織及瘤旁新鮮組織標本，應用實時熒光定量聚合酶鏈反應(real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR) 和Western blot 的方法檢測GKN1在GIST腫瘤組織和瘤旁組織中的表達情況，同時分析實驗數(shù)據(jù)與臨床資料的關系。 結(jié)果： GKN1主要表達在胃粘膜組織，GKN1的表達在胃GIST中顯著低于瘤旁組織(P<0.05)，GKN1蛋白高度表達于極低危險組的胃GIST，GKN1 mRNA的表達與性別、年齡及核分裂像無差異(P>0.05)，但胃GIST的GKN1 mRNA表達量：直徑(≤5cm)組明顯高于直徑(>5cm)組(P<0.05)，極/低危組顯著高于中/高危組(P<0.05)。結(jié)論： GKN1可能在胃GIST中從極低危到高危的發(fā)展過程中起著一定的作用，對鑒別其生物學行為有一定的指示和參考作用。

胃GIST；胃動蛋白基因1；生物學行為

胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumor,GIST)是一種具有惡性潛能的非定向分化的消化道間葉性腫瘤，其發(fā)病率約為1～2/10萬[1]。GIST的發(fā)病部位主要為胃部，占60%～70%[2], 5年生存率為35%～65%[3]。GIST的臨床表現(xiàn)往往不典型，據(jù)統(tǒng)計15%的GIST患者在就診時已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[4]。手術(shù)切除和分子靶向治療是目前治療GIST的主要模式。而GIST的危險度評估十分重要，這關系到手術(shù)時機、術(shù)式選擇及分子靶向治療等[5]。目前國內(nèi)多推薦采用中國GIST診斷治療共識(2013年版)的評估標準,評估方面主要為核分裂像、腫瘤大小、破損及部位[6]。這些方面在GIST危險度評估仍較復雜，如核分裂像必須獲取GIST標本進行病理學檢查才能得出結(jié)果。目前尚未報到哪一種腫瘤標志物或基因能更準確、更簡便地鑒別GIST的危險度、良惡性及預后。

GKN1位于人染色體2p13.3，翻譯的肽鏈由183～185個氨基酸組成[7]。GKN1 mRNA及其蛋白主要高度表達于正常胃上皮細胞中，也可表達在口腔黏膜、上皮化生組織(如Barrett食管)、胎盤、卵巢腫瘤及平滑肌組織中[8-11]，研究表明[12-20]GKN1具有保護胃黏膜、促進受傷黏膜修復、抑制腫瘤進展等功能。本研究旨在通過檢測GKN1在胃GIST及瘤旁正常組織中的表達，分析GKN1與胃GIST的相互關系，推論GKN1在胃GIST良惡性發(fā)展過程中可能扮演的角色，為胃GIST的生物學行為評估尋找新的參考手段和方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取30例川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科胃GIST及瘤旁組織的石蠟標本。收集20例川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院普外科胃GIST腫瘤組織及瘤旁新鮮組織標本(距腫瘤邊緣大于2cm)，病例入選標準: (1) 胃GIST初治手術(shù)的患者，(2)術(shù)前均未行放化療或伊馬替尼等分子靶向治療；(3)術(shù)后病理免疫組化證實為胃GIST。在收集的20例胃GIST手術(shù)新鮮標本中，患者年齡46～79歲，平均61.85±9.24歲；其中男11例，女9例；腫瘤直徑范圍：1～12cm，直徑(cm)≤5：10例，直徑(cm)>5：10例；核分裂像(/50HP)≤5：17例，>5：3例；按照中國GIST診斷治療共識(2013年版)對病例進行危險度評估：極低危4例，低危5例，中危7例，高危4例。

1.2 主要試劑

免疫組化Gastrokine 1抗體，購自Abcam公司；二抗試劑盒及DAB試劑盒，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Trizol 試劑，購自Invitrogen公司；熒光定量PCR試劑盒，購自DBI Bioscience公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自TaKaRa公司；單克隆鼠抗GAPDH抗體，購自上海良森生物科技有限公司；RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、超敏ECL化學發(fā)光即用型底物，購自碧云天生物有限公司；PCR儀，ROCHE公司，半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，購自BIO-RAD公司；Fusion Solo成像系統(tǒng)，購自VILBER公司。

1.3 免疫組化方法檢測GKNl的表達

切片(厚度3μm)，裱于防脫載玻片上，置37℃恒溫箱過夜，于二甲苯中脫蠟及梯度酒精中水化，置入3%過氧化氫溶液，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，微波爐中以中火加熱20分鐘抗原修復，滴加1：150的一抗在37℃恒溫箱孵育2小時，滴加二抗后，DAB顯色，再蘇木素復染，自來水藍化，置入梯度酒精脫水；透明、封片。用正常胃黏膜做陽性對照組，用PBS代替一抗做陰性對照組，免疫組化結(jié)果判讀：大于30%的上皮細胞胞漿黃染被認為陽性，反之為陰性[21]

1.4 實時熒光定量PCR法檢測 GKN1 mRNA含量

Trizol試劑盒提取細胞總RNA，紫外分光光度計及電泳分別檢測RNA的純度和完整性較好后，采用PrimeScriptTMRT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara；Code：RR037A) 進行RNA逆轉(zhuǎn)錄，條件：37℃ 15min，85℃ 15sec，4℃ forever。GKN1和 β-actin的引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。gastrokine 1上游引物5’-AATAACAACGGATGGGACT-3’下游引物5’-AGGGATTGAATGGAGGG-3’，β-actin上游引物5’-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3’，下游引物5’-GTAGTTTCGTGGATGCCACAG-3’，熒光定量PCR反應條件：預變性 95℃ 10min，變性95℃ 10s，退火60℃ 30s，延伸72℃ 30s，循環(huán)40次，△Ct為GKN1所得的Ct值與內(nèi)參β-actin所得的Ct值之差?！鰿t值越高，基因表達越低。

1.5 Western Blot法檢測 GKN1 蛋白的表達

用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取蛋白質(zhì)，BCA法檢測蛋白濃度，將樣本蛋白與上樣緩沖液混合，于沸水中煮5min使蛋白變性后分裝保存。GKN1及GAMDH均選擇12%的分離膠，上層膠采用5%的濃縮膠。電泳凝膠配制好后上樣。電泳電壓，濃縮膠為80V 20～30 min，分離膠為120V，采用半干式轉(zhuǎn)膜，12v轉(zhuǎn)膜70min。5%脫脂奶粉中封閉1h，PVDF膜放入稀釋的一抗液中(1 ∶1000)，4℃冰箱內(nèi)孵育過夜。TBST洗膜3次后，將PVDF膜置于二抗液中(1 ∶1 000)，在室溫輕搖1小時后，TBST 再次洗膜3次，ECL顯色液顯色。

1.6 統(tǒng)計學數(shù)據(jù)分析

采用SPSS21.0軟件分析，連續(xù)性變量用均數(shù)±標準差，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料用卡方檢驗，P值<0.05 認為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

GKN1主要表達在胃粘膜組織，而在胃GIST組織中低表達或無表達(圖1、2)，30例患者中，胃GIST與瘤旁組織的GKN1免疫組化表達強度比較，見表1。GKN1在胃GIST和瘤旁組織中的表達差異有計學意義(χ2=20.376，P<0.05)。

表1 胃GIST組織及瘤旁組織的GKNl免疫組化表達強度比較

圖1 GKN1的免疫組化表達：

圖2 GKN1的免疫組化表達：A:GIST(-)，

2.2 熒光定量PCR檢測結(jié)果

胃GIST和瘤旁組織中 GKN1 mRNA △Ct 均值之差為4.21±3.84，差異有統(tǒng)計學意義(配對樣本t檢驗，t=4.900，P<0.001)，見圖3。

分析GKN1 mRNA 在胃GIST的表達與患者性別、年齡及核分裂像的關系，差異無統(tǒng)計學意義(獨立樣本t檢驗，P>0.05)，但GKN1 mRNA 在胃GIST的表達與腫瘤直徑、危險度分級的關系，差異有計學意義(獨立樣本t檢驗，P<0.05)，胃GIST直徑(≤5cm)組的GKN1 mRNA 表達量明顯高于直徑大于5cm的胃GIST組；同時，極/低危組GKN1 mRNA 表達量明顯高于中/高危組。GKN1 mRNA 的表達與臨床病理特征的關系見表2。

圖3 GKN1 mRNA 的△Ct 均值在胃GIST和瘤旁組織中的比較

(注：由于瘤旁組織△Ct值為負數(shù)，故上圖為兩組數(shù)據(jù)縱坐標以-2為起始點)

表2 GKN1 mRNA 的表達在臨床病理特征中的比較

2.3 Western Blot實驗結(jié)果

用Western Blot檢測GKN1蛋白在胃GIST組織與瘤旁組織，極低危、低危、中危和高危胃GIST中的表達見圖4、5。 GKN1蛋白在胃GIST與瘤旁組織的相對灰度值表達差異有統(tǒng)計學意義(配對t檢驗，t=-11.729,P<0.05)；GKN1蛋白在極低危險度的胃GIST中高度表達，而在其他危險度的胃GIST蛋白表達較低，見圖6、7。

圖4 GKN1在胃GIST與瘤旁組織的灰度值表達,GAPDH為內(nèi)參

圖5 GKN1在極低危、低危、中危和高危胃GIST的灰度值表達，GAPDH為內(nèi)參

圖6 GKN1在胃GIST與瘤旁組織的相對灰度值直方圖比較

圖7 GKN1在GKN1在極低危、低危、中危和高危胃GIST的相對灰度值直方圖比較

3 討 論

GIST是一種最常見的消化系統(tǒng)間葉組織的腫瘤，臨床表現(xiàn)缺乏特異性，組織學上由梭形細胞和(或)上皮細胞組成，主要是由KIT或者PDGFRA基因突變導致，野生型GIST較少見，主要與琥珀酸脫氫酶缺陷等相關聯(lián)[21]。由于GIST臨床表現(xiàn)缺乏特異性，最終確診需要靠組織學和免疫組化，必要時還需進行基因突變檢測才能確定。GIST免疫組化CD117 和DOG1的陽性表達率分別高達96%及95%[2]。隨著現(xiàn)代先進的輔查技術(shù)發(fā)展，加之對GIST的臨床診斷治療認識不斷深入，對于胃GIST的診斷已不再是一件難題，然而進一步對GIST的生物學行為評估十分重要，這關系到手術(shù)時機和方法的選擇、靶向治療方案的制定及預后評估等諸多問題，而這些問題又直接關系病人預后。目前臨床上主要根據(jù)GIST的核分裂像、腫瘤大小、是否破損及腫瘤原發(fā)部位來評估GIST的生物學行為。

GKN1成為近來胃相關疾病研究的熱點，它具有抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能，有研究發(fā)現(xiàn)GKN1的表達從胃炎、慢性胃炎、萎縮性胃炎及化生、胃潰瘍到胃癌依次逐漸下調(diào)[12]，本研究采用免疫組化、PCR和Westem Blot法分別從基因和蛋白質(zhì)兩個水平檢測 GKN1在胃GIST組織和瘤旁組織的表達，并分析其與GIST臨床病理特征的相互關系。結(jié)果顯示GKNl主要表達在胃粘膜層，無論在基因還是蛋白質(zhì)水平，胃GIST組織中GKN1的表達均顯著低于瘤旁組織， GKN1 mRNA的表達與患者性別、年齡及核分裂像無相關性，但與胃GIST的直徑(≤5cm與>5cm)及危險度分組(極/低危組與中/高危組)存在相關性。這表明GKN1可能在胃GIST的從極低危至高位的發(fā)展過程中起著一定的作用，對鑒別惡性生物學行為也有一定的指示作用。

本研究認為，GKN1可能與胃GIST危險程度有關，并通過試驗部分證實了GKN1與胃GIST的生物學行為的相關性，對GKN1的表達水平劃定一參考范圍，為其生物學行為評估提供另一種可供參考的手段和方法。但必須指出，在本研究中，樣本量小，方法并非完全隨機對照，胃GIST患者隨訪時間較短，GKN1的表達與患者復發(fā)及生存時間的關系，還有待于進一步的深入研究。

作者聲明：本文第一作者對于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔相應責任。

利益沖突：本文全部作者均認同文章無相關利益沖突；

學術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學術(shù)不端文獻檢測系統(tǒng)學術(shù)不端檢測；

同行評議：經(jīng)同行專家雙盲外審，達到刊發(fā)要求。

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The Relationship between Expression of GKN1 and Biological Behavior in Gastric Stromal Tumor*

Luo Yun1,2，Wang Chongshu1，Xie Mengyi2，et al

(1.TheFirstDepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege；Nanchong637000,Sichuan,China； 2.InstituteofHepato-Biliary-PancreasandIntestinalDisease,NorthSichuanMedicalCollege；Nanchong637000,Sichuan,China)

Objective: To detect the expression of GKN1 in gastric GIST and peritumoral tissue, analyzing the correlation between the expression level of GKN1 and biological behavior of gastric GIST. Methods： Gastric GIST and adjacent normal tissues of 30 gastric GIST patients were selected from the paraffin specimens in the department of pathology. The expression values of GKN1 in these tissues were detected by immunohistochemistry. The expression of GKN1 in 20 Fresh specimens of gastric GIST and adjacent normal tissues was quantified by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western Blot．Meanwhile, the experimental data combined with clinical data were analyzed. Results: GKN1 mainly expressed in the gastric mucosa, the expression of GKN1 in the gastric GIST was significantly lower than in peritumoral tissue (P<0.05). GKN1 highly expressed in a very low risk of gastric GIST. There was no significant relationship for the expression of GKN1 mRNA in the sex, age, mitotic index of gastric GIST(P>0.05). The expression of GKN1 mRNA in the diameter (≤5cm) of gastric GIST group was significantly higher than the diameter (>5cm) (P<0.05), and in very low risk/low risk group was significantly higher than moderate/high risk group (P>0.05). Conclusion: GKN1 play a role in the development of gastric GIST from very low risk level to high risk level, and has the certain instruction and reference effect to identify biological behavior.

Gastric stromal tumor; Gastrokine 1; Biological behavior

2016- 08- 14

2017- 01- 15

*四川省衛(wèi)生廳科研項目(編號：120430)

羅 云(1985-)，男，重慶人，在讀碩士研究生，主要從事消化道腫瘤的基礎與臨床工作。

△王崇樹，E-mail：chongs-wang@163.com

R735.2

A

10.3969/j.issn.1674- 0904.2017.01.006