羅 文，王曉力，朱新強，麻文姣，王永剛，孫啟忠

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州 730050； 2.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050； 3.食品藥品監(jiān)督管理局，甘肅 民樂 734500； 4.中國農(nóng)業(yè)科學院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 7301091)

固態(tài)發(fā)酵豆渣和蘋果渣復合蛋白飼料的研究

羅 文1,2，王曉力1，朱新強1，麻文姣3，王永剛2，孫啟忠4

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州 730050； 2.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050； 3.食品藥品監(jiān)督管理局，甘肅 民樂 734500； 4.中國農(nóng)業(yè)科學院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 7301091)

以豆渣、蘋果渣為發(fā)酵基質(zhì)，以釀酒酵母、黑曲霉和里氏木霉為發(fā)酵菌株，篩選出最佳菌種配比，探討了不同接種量、時間、基質(zhì)水分、溫度對混合渣發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的影響。結果表明：釀酒酵母、黑曲霉和里氏木霉的配比為3∶2∶4，在接種量1%，培養(yǎng)48 h，基質(zhì)含水量70%，發(fā)酵溫度為30℃時，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)從15.87%提高到19.83%。

豆渣；蘋果渣；微生物發(fā)酵；蛋白飼料

豆渣是生產(chǎn)豆奶、豆腐或腐竹等豆制品過程中的副產(chǎn)品。豆渣中含有極為豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[1]。我國是大豆生產(chǎn)大國，國內(nèi)大豆食品行業(yè)每年約產(chǎn)生2 000萬t左右的濕豆渣，但其利用率僅為4.96%～16.60%[2]。濕豆渣的含水量大，運輸困難，又極易腐敗變質(zhì)，傳統(tǒng)的豆渣處理方式對其的利用率較低。我國是世界上最大的蘋果生產(chǎn)國，年產(chǎn)蘋果達2 600萬t以上，約占世界總產(chǎn)量的40%，蘋果加工中每年排出蘋果渣接近600萬t[3]。目前，果渣除少量被用于飼料及深加工外，絕大部分被遺棄，不僅造成資源的浪費，而且嚴重污染環(huán)境，如何合理利用蘋果渣類飼料資源一直是一個迫切需要解決的難題[4]。

豆渣作為一種具有開發(fā)價值的膳食纖維和蛋白質(zhì)源[5-6]，將其作為發(fā)酵底物，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)動物飼料是一種良好的利用途徑。近幾年有很多關于豆渣發(fā)酵產(chǎn)動物飼料的報道，肖少香等[7]的研究表明：采用毛霉發(fā)酵豆渣后，豆渣中蛋白質(zhì)得到有效分解，氨基酸態(tài)氮的含量由發(fā)酵期前的0.031%增至0.130%。李應瓊[8]的研究顯示采用放射毛霉和運動發(fā)酵單胞菌作為發(fā)酵劑對豆渣進行發(fā)酵后，可溶性粗蛋白質(zhì)從1.99%上升至12.66%；不溶性纖維從47.42%下降至37.50%。發(fā)酵過程使豆渣的硬度、彈性、咀嚼性及回復性均有提高。蘋果渣含有可溶性糖、維生素、礦物質(zhì)及纖維素等豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，是良好的發(fā)酵底物。Joshi等[9]的研究結果表明，蘋果廢棄渣經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后可得到營養(yǎng)豐富的單細胞蛋白飼料。其中粗蛋白質(zhì)含量提高了3倍，脂肪含量增加約2.0倍。武運等[10]以熱帶假絲酵母菌和啤酒酵母菌為菌劑，以蘋果渣為底物進行固態(tài)發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)、粗脂肪等主要成分含量顯著提高，營養(yǎng)價值增加，具有良好的飼用價值。

以豆渣和蘋果渣同時作為底料進行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)飼料未見報道。蘋果渣中豐富的糖分和豆渣中豐富的氮源有利于菌體的快速生長，提高了發(fā)酵效率，同時采用酵母菌和霉菌的生長和代謝產(chǎn)酶，不僅使得豆渣和蘋果渣中的纖維素降低，改善口感，同時能產(chǎn)生菌體蛋白和各種易于吸收的小分子物質(zhì)，豐富混合料的營養(yǎng)成分。因此，本研究以豆渣和蘋果渣為發(fā)酵底物，以釀酒酵母、黑曲霉和里氏木霉為發(fā)酵菌種，以提高發(fā)酵飼料中蛋白質(zhì)為目標，探索發(fā)酵條件對豆渣混合蘋果渣發(fā)酵飼料實驗的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗原料

豆渣(蘭州理工大學學校豆腐坊)、蘋果渣(天水長城果汁集團有限公司)。

1.1.2 供試菌株

黑曲霉孢子粉(孢子含量≥150億/g，沂源康源生物科技有限公司)、里氏木霉(纖維素酶酶活≥30 000 U/g)、釀酒酵母(水分≤6%，酵母活性細胞≥200億/g)，購自武漢東康源科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g ，去皮后切成小塊，加水煮沸至軟而不爛，用紗布過濾；加瓊脂20 g，融化過濾后加葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀2 g，蛋白胨1 g，硫酸鎂1 g，硫酸胺1 g，補水至1 000 ml，pH值調(diào)至7.2～7.4，分裝在4 個500 ml 的錐形瓶中，121℃滅菌20 min，冷卻待用。

PDA 種子液培養(yǎng)基：與配制上述PDA 斜面培養(yǎng)基的方法相同，但不加瓊脂。

1.2 試劑與儀器

試劑：濃硫酸、濃鹽酸、氫氧化鈉、石油醚、丙酮、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠等均為分析純，購自天津市富宇精細化工有限公司。

儀器：GZX-9240MBZ數(shù)顯鼓風干燥箱、HPX-9162MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱、SHB-IIIA真空泵、DSX-280B滅菌鍋、AB104-N電子分析天平、博蘭特無菌操作臺、Cary50紫外可見分光光度計等。

1.3 實驗方法

1.3.1 固態(tài)發(fā)酵工藝流程

以豆渣和蘋果渣為發(fā)酵基質(zhì)，將釀酒酵母、黑曲霉和里氏木霉三種菌懸液接種活化后擴大培養(yǎng)至活菌/孢子數(shù)≥109，于超凈臺內(nèi)用無菌玻璃棒將基質(zhì)攪拌均勻，用pH6.0磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)發(fā)酵基質(zhì)水分含量，按豆渣和蘋果渣質(zhì)量比為2∶1(前期實驗中獲得的結果)分裝100 g于一次性餐盒中，在不同的發(fā)酵條件下發(fā)酵。發(fā)酵結束后，將發(fā)酵產(chǎn)物在60℃下干燥，測定粗蛋白質(zhì)、中性纖維素和酸性纖維素含量。

1.3.2 單因素發(fā)酵實驗

1.3.2.1 固態(tài)發(fā)酵復合菌種組合的確定

以豆渣和蘋果渣(2∶1)為發(fā)酵基質(zhì)，分別將活化后擴大培養(yǎng)的釀酒酵母、黑曲霉和里氏木霉三種菌懸液(活菌/孢子數(shù)≥109)以單獨或不同組合方式，按1%的接種量接到發(fā)酵基質(zhì)上，于超凈臺內(nèi)用無菌玻璃棒將基質(zhì)攪拌均勻，用pH6.0磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)發(fā)酵基質(zhì)水分為60%，分裝100 g于一次性餐盒中，在30℃條件下發(fā)酵3 d，發(fā)酵結束后，將發(fā)酵產(chǎn)物在60℃下干燥，測定粗蛋白質(zhì)、中性纖維素和酸性纖維素含量，確定最佳的發(fā)酵菌種組合。

1.3.2.2 固態(tài)發(fā)酵復合菌種比例的確定

分別改變釀酒酵母、黑曲霉和里氏木霉的配比，接種發(fā)酵菌株參照1.3.2.1節(jié)方法進行發(fā)酵，測定粗蛋白質(zhì)、中性纖維素和酸性纖維素含量，確定最佳的菌種的比例。

1.3.2.3 接種量的確定

將釀酒酵母，黑曲霉和里氏木霉的種子液按3∶2∶4比例混合，分別改變接種量，參照1.3.2.1節(jié)方法進行發(fā)酵，測定粗蛋白質(zhì)、中性纖維素和酸性纖維素含量，確定最佳的接種量。

1.3.2.4 發(fā)酵時間的確定

分別改變發(fā)酵時間，接種發(fā)酵菌株參照1.3.2.1節(jié)方法進行發(fā)酵，測定粗蛋白質(zhì)、中性纖維素和酸性纖維素含量，確定最佳的發(fā)酵時間。

1.3.2.5 初始水分含量的確定

分別改變初始發(fā)酵基質(zhì)含水量，接種發(fā)酵菌株參照1.3.2.1節(jié)方法進行發(fā)酵，測定粗蛋白質(zhì)、中性纖維素和酸性纖維素含量，確定最佳的初始含水量。

1.3.2.6 發(fā)酵溫度的確定

分別改變發(fā)酵溫度，接種發(fā)酵菌株參照1.3.2.1節(jié)方法進行發(fā)酵，測定粗蛋白質(zhì)、中性纖維素和酸性纖維素含量，確定最佳的發(fā)酵時間。

1.3.3 正交實驗

在單因素試驗基礎上，以發(fā)酵時間、水分和接種量為因素，采用L9(34)表做正交試驗，以發(fā)酵飼料中粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)作為評價指標，正交試驗因素與水平見表1。

表1 因素水平表

1.3.4 分析方法及發(fā)酵飼料質(zhì)量評價

(1)微生物計數(shù)：采用血球計數(shù)板法對釀酒酵母、黑曲霉和里氏木霉細胞進行計數(shù)。

(2)飼料感官評定：根據(jù)發(fā)酵飼料的氣味、色澤及質(zhì)地評定飼料發(fā)酵狀況的優(yōu)劣。

(3)飼料基本成分測定：粗蛋白質(zhì)(CP)含量采用GB/T6432-1994方法測定；粗纖維(CF)含量采用GB/T 6434-1994酸堿洗滌法測定；粗脂肪含量采用索氏提取法測定；灰分(Ash)測定采用GB/T 6438-1992中的灰化法；酸性洗滌纖維(ADF)含量參照NY/T 1459-2007方法測定；中性洗滌纖維素(NDF)含量參照GB/T 20806-2006方法測定。

1.3.5 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)平行測定3次，結果用“平均值±標準差”表示，采用SPSS 17.0進行方差分析和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵原料營養(yǎng)成分分析

參照國家標準測定方法分別對豆渣和蘋果渣基本成分進行測定，結果如表2。

表2 發(fā)酵原料基本營養(yǎng)成分測定結果(以干基計)

由表2可見，2種原料中主要成分是蛋白質(zhì)和纖維素，其中豆渣中的蛋白質(zhì)和粗纖維含量均為最高?；|(zhì)中含有的大量非水溶性纖維素類物質(zhì)影響了各飼料原料的適口性。采用微生物發(fā)酵法通過降解基質(zhì)中的纖維素類物質(zhì)，不僅可以改善飼料原料的口感，還可以產(chǎn)生很多對動物消化吸收有利的代謝產(chǎn)物。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 發(fā)酵菌株的選擇

實驗選擇釀酒酵母、黑曲霉和里氏木霉為發(fā)酵菌株，參照1.3.2.1節(jié)方法以豆渣和蘋果渣(2∶1)為發(fā)酵基質(zhì)，按照總接種量為1.0%將三種菌種以單獨或不同比例組合方式，發(fā)酵結束后測定飼料中粗蛋白質(zhì)、粗纖維含量，并以不接種任何菌種為空白對照，結果見圖1。

CK：空白；N：釀酒酵母；H：黑曲霉；L：里氏木霉

從圖1可以看出，不同的菌種組合利用糟渣類物質(zhì)的效率不同，與空白對照組相比，采用單菌發(fā)酵后的粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)提高了6%～15%，三種菌兩兩組合之后，粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)提高了10%～20%，而釀酒酵母+黑曲霉和釀酒酵母+里氏木霉組合較黑曲霉單獨發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)略低，主要原因是總接種量為1%，單位體積中微生物菌體數(shù)量有差異，其中黑曲霉主要起到分泌纖維素降解酶作用，因此黑曲霉組中的纖維素酶活力較高，水解纖維素能力強，黑曲霉利用水解產(chǎn)物繁殖，菌體蛋白含量較其他兩組略高，但差異不顯著。三種菌同時混合后進行發(fā)酵，各種微生物分別分泌不同酶類，互補缺陷，能夠利用更多的單糖進行繁殖，進而菌體蛋白相對較高，粗蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)提高了25.32%左右，所以本次試驗中最佳的菌種組合是三種發(fā)酵菌同時使用，這樣保證了粗蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)能達到最大。

2.2.2 發(fā)酵菌種組合比例的確定

菌種選定后，發(fā)酵的關鍵在于找到發(fā)酵菌種合適的比例。依據(jù)2.2.1發(fā)酵試驗結果，確定釀酒酵母、黑曲霉和里氏木霉的三菌組合方式為優(yōu)選菌種，固定釀酒酵母的接種量為1%，以豆渣和蘋果渣(2∶1)為發(fā)酵基質(zhì)，參照1.3.2.1節(jié)方法將黑曲霉與里氏木霉按不同比例混合，按總接種量3%接種，發(fā)酵結束后測定飼料中粗蛋白質(zhì)、粗纖維含量，并以只接種釀酒酵母為空白對照，結果如圖2。

由圖2可見，不同的菌種組合較空白組發(fā)酵后。粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)提高了14.13%～27.12%，當黑曲霉與里氏木霉比例為1∶2時，粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)達到最大值(27.12%)。所以當釀酒酵母的接種量為1%時，黑曲霉與里氏木霉混合接種量為2%，其中黑曲霉與里氏木霉比例為1∶2，在此條件下粗蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)達到最大。故得到釀酒酵母∶黑曲霉∶里氏木霉的比例為3∶2∶4。

圖2 菌株(黑曲霉和里氏木霉)不同比例發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)和纖維素質(zhì)量分數(shù)

2.2.3 接種量的確定

接種量對于發(fā)酵過程中微生物的生長和代謝調(diào)控有著重要影響。我們分別采用接種量(體積分數(shù))1%、3%、5%、7%和9% ，接種發(fā)酵48 h，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)、中性纖維素和酸性纖維素質(zhì)量分數(shù)見圖3。

圖3 接種量對發(fā)酵飼料蛋白質(zhì)、酸性和中性洗滌纖維質(zhì)量分數(shù)的影響

由圖3可見，產(chǎn)物中蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)沒有顯著差異，接種量為1%的時候，ADF、NDF含量最低。當接種量過高時，菌體大量繁殖，基質(zhì)產(chǎn)熱過快，不利于發(fā)酵進行下去；同時基質(zhì)的養(yǎng)料不能滿足大量菌體的生長所需，隨著發(fā)酵的進行，大部分可溶性養(yǎng)分被菌體利用后，酶分解底料所產(chǎn)生的養(yǎng)分，不足以滿足菌體自身的需要，也會造成菌的早期衰亡。故最佳接種量選為1%。

2.2.4 初始水分的確定

微生物在發(fā)酵過程中需要有適宜的水分。發(fā)酵底物環(huán)境中的水分直接影響微生物的生長情況，隨著含水量的增加，提高了反應體系的水活度，這不僅有利于菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的輸送，也增加了菌株代謝產(chǎn)酶量的增加；但是當基質(zhì)水分過高，通氣性不好，不利于菌體的呼吸和散熱，會刺激芽胞桿菌的發(fā)育，發(fā)生怪味，并分泌抑制物質(zhì)，影響發(fā)酵菌種的生長，嚴重時會導致失敗。參照1.3.2.1節(jié)方法分別進行初始基質(zhì)水分為60%、65%、70%和75%的發(fā)酵實驗，粗蛋白質(zhì)、纖維素測定結果如圖4。

圖4 初始含水量對發(fā)酵飼料蛋白質(zhì)、酸性和中性洗滌纖維質(zhì)量分數(shù)的影響

由圖4可見，初始水分為65% 時，所得到的飼料中粗蛋白質(zhì)的含量最高，酸性洗滌纖維素和中性洗滌纖維素含量最低。因此確定發(fā)酵初始基質(zhì)水分為65%。

2.2.5 發(fā)酵時間的確定

以釀酒酵母、黑曲霉和里氏木霉為發(fā)酵菌株(3∶2∶4)，豆渣和蘋果渣(2∶1)為發(fā)酵基質(zhì)，參照1.3.2.1節(jié)方法分別進行12、24、36、48、60 h發(fā)酵實驗，發(fā)酵結束后飼料中粗蛋白質(zhì)、酸性纖維素和中性纖維素含量測定結果見圖5。

圖5 發(fā)酵時間對發(fā)酵飼料蛋白質(zhì)、酸性和中性洗滌纖維質(zhì)量分數(shù)的影響

由圖5可見，隨著發(fā)酵時間的增加，飼料中蛋白質(zhì)含量逐漸增加，酸性纖維素和中性纖維素逐漸降低。當發(fā)酵時間為48 h時，趨于穩(wěn)定，所得到的飼料中粗蛋白質(zhì)的含量很高，纖維素含量很低，說明隨著發(fā)酵時間的增加，微生物能夠利用基質(zhì)中不溶性纖維素進行繁殖和代謝，蛋白質(zhì)含量逐漸增加。故選用48 h為最佳發(fā)酵時間。

2.2.6 發(fā)酵溫度的確定

溫度是影響微生物生長和代謝活動的主要因素之一，菌體一般有最適的生長溫度。溫度過低會使菌體生長過慢，延長發(fā)酵周期；溫度過高會造成菌體死亡，發(fā)酵無法進行。由于本次發(fā)酵菌株都屬于真菌，因此分別在22、26、30、34、38℃五個溫度下進行發(fā)酵，其他發(fā)酵參數(shù)同1.3.2.1。發(fā)酵結束后，飼料中蛋白質(zhì)、中性纖維素和酸性纖維素含量見圖6。

圖6 發(fā)酵溫度對發(fā)酵飼料蛋白質(zhì)、酸性和中性洗滌纖維質(zhì)量分數(shù)的影響

由圖6可知，在30℃下飼料中蛋白質(zhì)含量最高，酸性纖維素和中性纖維素含量最低，初步確定發(fā)酵溫度為30℃，這樣不僅能滿足微生物生長代謝，也能滿足發(fā)酵代謝中產(chǎn)生的各種酶類所需要的最適宜酶解溫度。

2.3 正交試驗

根據(jù)上述單因素實驗結果，以釀酒酵母、黑曲霉、里氏木霉為發(fā)酵菌株(3∶2∶4)，豆渣和蘋果渣(2∶1)為發(fā)酵基質(zhì)，以粗蛋白質(zhì)含量為評價指標分別研究發(fā)酵時間(A)、水分含量(B)、發(fā)酵溫度(C)、接種量(D)四個因素對發(fā)酵飼料的影響。按照表1進行正交試驗，結果見表3。

表3 正交試驗粗蛋白質(zhì)直觀分析表

由表3可知，各因素對發(fā)酵產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量的影響程度依次為：發(fā)酵時間、發(fā)酵基質(zhì)初始含水率、發(fā)酵接種量、發(fā)酵溫度。而且發(fā)酵最優(yōu)條件為A3B3C2D2。即：發(fā)酵時間為48 h，發(fā)酵基質(zhì)初始含水率70%，發(fā)酵溫度為30℃，接種量為1%。在此發(fā)酵條件下進一步對該組合進行驗證試驗，經(jīng)測定發(fā)酵后飼料中粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)達19.83%，因此確定本組合為最佳發(fā)酵工藝條件。

3 結論

以復合基質(zhì)為主要原料，利用混合菌株對原料進行協(xié)同處理得到新型生物蛋白飼料，對其最適菌種配伍和發(fā)酵參數(shù)進行優(yōu)化，以確定最佳工藝參數(shù)，并對發(fā)酵產(chǎn)物的營養(yǎng)價值進行評定。

(1)菌種最佳的發(fā)酵組合為釀酒酵母+黑曲霉+里氏木霉；當三種菌以3∶2∶4 混合接入，發(fā)酵效果最好。最佳發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵時間為48 h，發(fā)酵基質(zhì)初始含水率70%，發(fā)酵溫度為30℃，接種量為1%。

(2)發(fā)酵后基質(zhì)中蛋白質(zhì)含量明顯升高，由原來的 15.87%上升到 19.83%，增加率達到24.95%；較好的改善了單純用豆腐渣或蘋果渣發(fā)酵的不足。

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(責任編輯：梅 竹)

Production of compound protein feedstuff from bean dregs and apple pomace by solid-state fermentation

LUO Wen1,2,WANG Xiao-li1,ZHU Xin-Qiang1,MA Wen-jiao3,WANG Yong-gang2,SUN Qi-zhong4

(1.Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Science of CAAS,Lanzhou 730050,China;2.School of Life Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China;3.Minle Food and Drug Administration,Minle 734500,China;4.Institute of Grassland Research of CAAS,Huhehaote 7301091,China)

SelectingSaccharomycescerevisiae,AspergillusnigerandTrichodermavirideas the fermentation strains,the fermentation conditions of producing compound protein feedstuff from bean dregs and apple pomace were studied.Results showed that the optimal conditions were as follows：the proportion ofSaccharomycescerevisiae,AspergillusnigerandTrichodermareeseiof 3∶2∶4,inoculum amount 1%,fermentation time 48 h， initial moisture content of culture media 70%,fermentation temperature 30℃.Under the conditions,the crude protein content increased from 15.87% to 19.83%.

bean dregs;apple pomace;solid state fermentation;protein feed

2016-11-05；

2017-01-09

公益性行業(yè) (農(nóng)業(yè))科研專項(201403048-8和201203042)；甘肅省重大科研專項(2014GS00998)和甘肅省自然基金(1310RJYA022)項目資助。

羅 文(1990-)，男，碩士生，主要從事微生物生理生化及基因工程研究。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.02.010

S816.4

A

1003-6202(2017)02-0044-04