金姝含 杜麗萍 鄒肖肖 于澤 梁洋

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

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通過CRISPR/Cas系統(tǒng)構(gòu)建miR-17-92基因簇雙切載體1)

金姝含 杜麗萍 鄒肖肖 于澤 梁洋

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

通過CRISPR/Cas系統(tǒng)來構(gòu)建miR-17-92基因簇的雙切載體，研究結(jié)果表明：在miR-17-92基因簇的序列上找到了2個PAM(TGG和GGG)位點,從而得到了2個原間隔序列，設(shè)計合成基因簇雙鏈crRNA；合成該片段并將其插入到pX260載體，使得在同一個載體上雖然只有一個g-RNA，但能夠同時切割兩個不同的靶位點；將該載體轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞驗證切割效率，PCR結(jié)果和測序結(jié)果顯示，所構(gòu)建的CRISPR系統(tǒng)可以對基因片段進行有效切割。

CRISPR/Cas系統(tǒng)；miR-17-92基因簇；雙切載體；crRNA

We constructed double-cut carrier ofmiR-17-92 gene cluster using CRISPR/Cas9 system. We identified two PAM and two protospacesare, and designed pre-crRNAs. The synthesized pre-crRNAs (that was the designed annealing oligonucleotides based on the sequence specific) were inserted between the pX260 carrier. Therefore，there is only one g-RNA in the same carrier, cutting two different target sites at the same time. NIH3T3 cells were transfected by plasmid of pX260 carrier including pre-crRNAs for the cutting effect. ThemiR-17-92 gene was cut by CRISPR/Cas system.

2013年初，一種全新的CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas9))基因組定點改造技術(shù)出現(xiàn)，即利用靶點特異性的RNA將Cas9核酸酶帶到基因組上的具體靶點，從而對特定基因位點進行切割，該技術(shù)一經(jīng)問世，便迅速被應(yīng)用到各種基因組編輯中，并明顯提高了編輯效率和準(zhǔn)確度。最近研究表明，利用CRISPR/Cas9技術(shù)，也能單酶切miRNA，使得小鼠細胞中miRNA的水平被敲低[1]。

MicroRNA(miRNAs)是內(nèi)源性非編碼小RNA，大小約為20～22個核苷酸,存在于真核基因組中，不編碼蛋白，而是通過抑制靶基因mRNA的翻譯或?qū)⑵浣到?，在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達[2]。有研究預(yù)測其能夠負(fù)向調(diào)控哺乳動物中一半以上的蛋白質(zhì)編碼基因[3]，在生物體的早期發(fā)育、細胞增殖、細胞凋亡、脂肪代謝和細胞分化等方面發(fā)揮重要的生理作用[4]。近年研究還發(fā)現(xiàn)，miRNA能夠影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]。

在脊椎動物中，miR-17-92基因簇序列十分保守,編碼miR-17-5p、miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1等7個miRNAs[6]，這些miRNAs在基因組上成簇存在,并以多順反子形式轉(zhuǎn)錄。目前miR-17-92基因簇與哺乳動物器官發(fā)育，以及多種腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。在淋巴瘤、肺癌、白血病、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胃癌等很多腫瘤細胞中均存在高表達[7]。但同時，也有研究發(fā)現(xiàn)，在人類GBM異種移植的小鼠中，miR-17-92的表達提高了CAR-T-細胞抗腫瘤的活性[8]。因此目前認(rèn)為，miR-17-92基因簇可能具有癌基因和抑癌基因雙重功能，但對其具體作用機制的研究尚不清楚。

綜上所述，為了探討miR-17-92基因簇在疾病尤其是癌癥發(fā)生中的作用機制，本文通過CRISPR/Cas系統(tǒng)構(gòu)建miR-17-92基因簇的雙切載體，使得在同一個載體上能夠同時切割兩個不同的靶位點，得到了miR-17-92基因簇缺失突變，并降低了脫靶率和移碼突變的可能性，為進一步利用miR-17-92基因簇進行疾病和腫瘤發(fā)生機制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

pX260載體和NIH3T3細胞，由本實驗室保存。

限制性內(nèi)切酶Bbs1，T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒、快速質(zhì)粒小量提取試劑盒購自O(shè)mega公司；瓊脂糖購自Biowest公司；脂質(zhì)體2000購自Invitrogen公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑；PCR引物合成以及測序分析由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.1 crRNA序列的設(shè)計

利用NCBI上的BLAST得到小鼠miR-17-92基因簇序列，通過生物信息學(xué)方法，在該序列上找到2個PAM(TGG和GGG)位點，從而得到了2個原間隔序列，分別為：

5’-ATTTAGCAGGAATAAAGTGAACCTCACCTTGGG-3’，

5’-CCAGAAGATGTGAAAATGACAATATTGCTGAAG-3’。

通過primer5設(shè)計含有BbS1酶切位點的引物，由生物公司合成crRNA，序列為：5’…CAAACATTTAGCAGGAATAAAGTGAACCTCACCTTGTT…AACGAAGATGTGAAAATGACAATATTGCTGAAGGTTTTAG…-3’。

1.2 質(zhì)粒載體的構(gòu)建

用Bbs1酶對pX260載體進行酶切(圖1)，酶切體系50 μL，37 ℃，60 min?；厥站€性載體，用小牛堿性磷酸酶CIP去除線性質(zhì)粒載體5’端磷酸，將退火后的crRNA插入到2個Bbs I酶切位點之間，用T4 DNA連接酶，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化并提取質(zhì)粒，最終得到了小鼠miR-17-92基因簇的雙切載體，并進行進一步的檢測。

圖1 pX260載體圖譜

1.3miR-17-92基因簇雙切載體切割效率檢測

NIH3T3細胞系的培養(yǎng)：NIH3T3細胞復(fù)蘇后傳代培養(yǎng)(DMEM合成培養(yǎng)基：含10%胎牛血清，1%谷氨酰胺，1%雙抗)，待細胞傳2代以后準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。

轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前1天，胰酶消化細胞并計數(shù)，細胞鋪板，使其在轉(zhuǎn)染日密度為50%～60%，細胞鋪24孔板，添加0.5 mL DMEM合成培養(yǎng)基(不含抗生素)；對于每孔細胞，加入miR-17-92基因簇的雙切載體質(zhì)粒0.3 μg，脂質(zhì)體2 000 1 μL，37 ℃，5%的CO2中培養(yǎng)24 h。

基因組檢測：利用試劑盒提取NIH3T3細胞全基因組，以該基因組為模板，在小鼠miR-17-92基因簇序列上利用prime5設(shè)計檢測引物P1和P2，進行PCR檢測和測序分析，擴增長度約為1 548 bp。

檢測引物序列為：

P1：5-ACGGATGTGAATCTTGGTGGGTT-3，

P2：5-GAAACCAACTGTGCTGCCCAAATG-3。

PCR條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；53 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min；72 ℃ 10 min 30個循環(huán)，反應(yīng)體系為20 μL。

并參考左其生[9]，俞珺瑤等的方法[10]，利用Image J軟件分析條帶的灰度值，公式為：

相對切割效率=突變產(chǎn)物剪切條帶灰度值/(突變產(chǎn)物剪切條帶灰度值+未突變條帶灰度值)。

2 結(jié)果與分析

2.1 crRNA序列的設(shè)計

通過NCBI數(shù)據(jù)庫得到小鼠miR-17-92基因簇序列，利用生物信息學(xué)方法，在該序列上找到兩個PAM(TGG和GGG)位點(下劃線標(biāo)注)，從而得到了兩段原間隔序列(protospace(1)和(2)，圖2中兩段著重顯示部分)，三角形標(biāo)記表示核酸酶spCas9的切點位置，進而設(shè)計了小鼠miR-17-92基因簇crRNA序列(5’…CAAACATTTAGCAGGAATAAAGTGAACCTCACCTTGTT…AACGAAGATGTGAAAATGACAATATTGCTGAAGGTTTTAG…-3)，由生物公司合成該段序列。

2.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)miR-17-92基因簇雙切載體的構(gòu)建

圖2顯示了通過CRISPR/Cas系統(tǒng)構(gòu)建的miR-17-92基因簇雙切載體結(jié)果。通過Bbs1酶對pX260載體進行雙酶切，將合成的雙鏈crRNA片段插入到兩個Bbs I酶切位點之間(箭頭標(biāo)注)，作為引導(dǎo)序列，最終得到了小鼠miR-17-92基因簇的雙切載體，用于以下的檢測實驗。

2.3miR-17-92基因簇雙切載體的檢測

為了檢測所構(gòu)建載體的切割效率，將該載體轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，并提取細胞全基因組，再通過PCR法、灰度分析法和測序方法分別檢測基因組中miR-17-92基因簇的切割情況。

2.3.1 PCR檢測

利用引物P1P2進行PCR檢測，圖3結(jié)果顯示：1泳道為對照組，即空載體轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，擴增的miR-17-92基因片段，約1 548 bp左右，沒有切割現(xiàn)象；2泳道為試驗組，即miR-17-92基因簇雙切載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞組，由于很難達到100%切割，因此顯示兩條帶，上端為未被切割的片段，約1 548 bp左右，下端為被切割后修復(fù)的片段(條帶標(biāo)記為3)，由于中間切割堿基長度約為948 bp左右，因此切割后重組長度約600 bp左右。4號標(biāo)記為無條帶空白位置，用于灰度分析。

圖2 CRISPR/Cas系統(tǒng)miR-17-92基因簇雙切載體的構(gòu)建

1.對照組；2.試驗組；3.切割后修復(fù)條帶；4.空白；M.star markerⅡ。

2.3.2 灰度分析切割效率

表1顯示上述PCR條帶灰度分析結(jié)果。通過Image J軟件進行灰度分析，根據(jù)公式，突變產(chǎn)物剪切條帶灰度值/(突變產(chǎn)物剪切條帶灰度值+未突變條帶灰度值)，可以初步判斷切割效率[9-10]。結(jié)果顯示：所構(gòu)建的CRISPR/Cas9系統(tǒng)對miR-17-92基因簇切割效率為7.04%左右(切割效率分析(3-4)/(2+3-4)=(57.358-48.966)/(110.787+57.358-48.966)=7.04%)。

表1 PCR條帶灰度分析切割效率

注：1為對照；2為未被切割的片段；3為切割后修復(fù)片段；4為空白對照。

2.3.3 測序分析

將上述PCR結(jié)果送到生物公司進行測序，分別利用DNAMAN軟件和NCBI blast進行分析，結(jié)果顯示：利用構(gòu)建的CRISPR/Cas系統(tǒng)miR-17-92基因簇雙切載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠NIH3T3細胞后，miR-17-92基因的確被有效切割，切割長度約為948 bp左右，與理論值相符(圖4和圖5)。

圖4 DNAMAN分析結(jié)果

3 結(jié)論與討論

microRNAs(miRNAs)是高度保守的一種非編碼小RNA，通過抑制靶基因mRNA的翻譯或?qū)⑵浣到?在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達。Bartel D P等[4]發(fā)現(xiàn)這些miRNAs在基因組上成簇存在,以多順反子形式轉(zhuǎn)錄。參與調(diào)控哺乳動物器官發(fā)育以及疾病的發(fā)生，因此受到了廣泛關(guān)注。其中miR-17-92基因簇的序列十分保守，位于人類基因組第13號染色體上C13orf25基因初級轉(zhuǎn)錄本的第3個內(nèi)含子區(qū)，在小鼠基因組中位于第14號染色體上[11],編碼miR-17-5p、miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1等7個miRNAs。研究顯示，miR-17-92基因簇與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，可能具有癌基因和抑癌基因雙重功能，因此通過基因編輯等技術(shù)對miR-17-92基因簇作用機制進行深入研究十分必要。

圖5 NCBI blast分析結(jié)果

(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas9)基因組編輯技術(shù)，是一種新型打靶技術(shù)，基本可以在任意基因位點進行有效斷裂，且具有可以同時對多個基因進行打靶的優(yōu)勢。2013年初，有研究首次報道了利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對人293T細胞的EMX1和PVALB基因以及小鼠Nero2A細胞的Th基因?qū)崿F(xiàn)了定點突變[8]。同一期的Science雜志也發(fā)表了另一篇文章，通過利用CRISPR/Cas9在人293T細胞和K652細胞基因的靶位點形成單鏈或雙鏈的切口，從而能夠激活細胞的DNA修復(fù)機制，高效地介導(dǎo)外源基因的定點插入[12]。2014年有研究結(jié)果顯示，在小鼠中，使用特異性的gRNAs，可以單酶切miRNA，使得在小鼠細胞中miRNA的水平被敲低[13]。

以往研究結(jié)果顯示，所構(gòu)建的CRISPR/Cas9載體系統(tǒng)只有一個crRNA，Cas9蛋白只對一個位點進行切割，容易造成移碼突變，且不能將感興趣的整個基因座全部切下。如果設(shè)計兩個CRISPR/Cas9系統(tǒng)時，又會明顯降低敲除效率[12]，影響試驗結(jié)果。因此，為了解決上述問題，本試驗設(shè)計了CRISPR/Cas9雙切miR-17-92基因簇載體系統(tǒng)，即在一個載體上雖然只有一個crRNA，但是能識別兩個切割位點，實現(xiàn)同時切割兩個不同靶位點的功能。

本試驗首先通過分析miR-17-92基因簇的序列，找到兩個PAM(TGG和GGG)位點，從而得到了兩個原間隔序列，將其合并設(shè)計合成一段pre-crRNA序列，該序列能識別兩個Cas9切割位點，避免了同時設(shè)計兩段crRNA所造成的切割效率降低問題。隨后利用限制性內(nèi)切酶BbsI，對pX260載體進行酶切，將上述合成的pre-crRNA片段插入到BbsI酶切位點之間，克隆后得到CRISPR/Cas9系統(tǒng)miR-17-92基因簇雙切載體質(zhì)粒。本試驗利用的pX260載體與以往實驗有所不同，擁有3個表達盒，即crRNA與tracrRNA兩個表達盒能分開表達，而常規(guī)pX330載體具有兩者合并為一個gRNA的表達盒[1]?；蚯贸龝rcrRNA與tracrRNA兩個表達盒分開表達效率高于單一的gRNA表達盒，因此，實驗設(shè)計crRNA與tracrRNA分開的兩個表達盒，以提高miR-17-92基因簇的切割效率[8]。

最后將該載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，分別通過PCR法和測序分析方法鑒定載體構(gòu)建情況(圖4,5,6)，測序結(jié)果顯示：所構(gòu)建的CRISPR/Cas9雙切miR-17-92基因簇載體能夠切割基因組長度約900bp左右，與設(shè)計結(jié)果相符，沒有發(fā)生移碼突變。參考其他文獻結(jié)果通過Image J軟件對PCR條帶進行灰度分析，初步檢測切割效率約為7.04%，雖然切割效率不是很高，但實現(xiàn)了通過載體上的一個crRNA，Cas9可以識別兩個切割位點，從而將感興趣的基因座上序列全部切割的結(jié)果，簡化了設(shè)計和操作步驟，并降低了點突變所產(chǎn)生的脫靶率和移碼突變的可能性。

綜上所述，本文利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因打靶技術(shù)，具有同時對多個基因進行打靶的優(yōu)勢，能快速簡單的敲除基因簇。而且我們設(shè)計的CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一個雙切載體，在同一個載體上利用一個cr-RNA，實現(xiàn)同時切割兩個不同靶位點的效果，提高了突變效率，減少了移碼突變。由于miR-17-92基因簇與哺乳動物多個器官發(fā)育和腫瘤發(fā)生有著密切的關(guān)系，如果將該雙切載體應(yīng)用在小鼠，哺乳動物甚至人類上，那么就可以快速了解miR-17-92基因簇功能，為進一步闡明其在器官發(fā)育和腫瘤發(fā)生發(fā)展中的分子機制，以及相關(guān)疾病預(yù)防，診斷和治療奠定基礎(chǔ)。

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Double-cut Carrier in ConstructingmiR-17-92 Gene Cluster by CRISPR/Cas9 System//

Jin Shuhan, Du Liping, Zhou Xiaoxiao, Yu Ze, LiangYang(Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)//

Journal of Northeast Forestry University，2017,45(2)：17-21.

CRISPR/Cas9 system;miR-17-92 gene cluster; Double-cut carrier; crRNA

1)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費項目(2572016EAJ3)；淡水魚育種國家地方聯(lián)合工程實驗室開放課題(KF-2015-003)；東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目。

金姝含，女，1994年2月，東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，本科生。E-mail：jinshuhan123@163.com。

梁洋，東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，高級工程師。E-mail：liang11yang@126.com。

2016年7月13日。

Q291

責(zé)任編輯：潘 華。