鄒險峰，陳麗娜，吳瓊，懷影，張莉弘

（長春大學食品科學與工程學院，吉林長春130022）

木瓜蛋白酶水解大豆球蛋白的抗氧化性研究

鄒險峰，陳麗娜，吳瓊，懷影，張莉弘

（長春大學食品科學與工程學院，吉林長春130022）

采用木瓜蛋白酶水解大豆球蛋白制備抗氧化肽。以自由基的清除率為評價指標，通過單因素試驗和正交試驗確定酶解最佳條件。結(jié)果顯示：最佳條件為pH7.5，酶和底物比8 000U/g，水解時間3 h，溫度60℃。優(yōu)組合條件下的羥自由基清除率為77.6%，超氧陰離子的清除率為47.3%。

大豆球蛋白；抗氧化性；木瓜蛋白酶

自由基是化合物分子在光熱等外界條件下，共價鍵發(fā)生均裂而形成的具有不成對電子的原子或分子。活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）是最主要的一類自由基，存在未配對電子的含氧分子，主要包括超氧陰離子和羥自由基等，具有很強的化學活性。ROS既可由機體正常代謝產(chǎn)生并參與機體的正常生理功能，也能夠因受到外界刺激（如吸煙、輻射和精神壓力等）而在機體內(nèi)大量產(chǎn)生而損傷生物有機體。研究顯示，多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，如白內(nèi)障、老年癡呆癥、心血管疾病等都同ROS損傷相關(guān)[1-3]。機體內(nèi)部存在自由基的清除系統(tǒng)，包括抗氧化酶系統(tǒng)如：超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶等，還有各種具有抗氧化功能的小分子如：谷胱甘肽、維生素等?，F(xiàn)代人的生活環(huán)境和工作壓力會導(dǎo)致機體產(chǎn)生大量的活性氧自由基，機體需要從外界攝入更多的高效抗氧化物質(zhì)來消除活性氧自由基對機體的損傷。

各種蛋白水解肽已經(jīng)表現(xiàn)出明顯的抗氧化性。Yu J等通過酶解螺旋藻并純化獲得一條Pro-Asn-Asn水解肽，清除DPPH自由基能力與GSH近乎等同，且同時具有清除超氧陰離子和羥自由基的能力[4]；Jin DX等酶解玉米蛋白粉獲得水解肽表現(xiàn)出優(yōu)秀的DPPH自由基和超氧陰離子清除能力[5]；YousrM等的研究表明蛋黃蛋白質(zhì)水解肽具有清除超氧陰離子和羥自由基的能力[6]。大豆是一種重要的農(nóng)產(chǎn)品，其蛋白質(zhì)含量高達干重的40%，目前大豆蛋白質(zhì)主要作為食品添加劑被廣泛應(yīng)用于食品加工，對大豆蛋白水解肽的功能性研究更有價值。

利用木瓜蛋白酶水解大豆球蛋白，通過單因素和正交試驗確定抗氧化能力更高的大豆肽水解條件，為大豆抗氧化肽的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

大豆球蛋白：長春大學農(nóng)產(chǎn)品深加工實驗室自制[7]；木瓜蛋白酶（1 000 U/mg）：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FDU-2100型冷凍干燥儀：日本EYELA公司；J-26XP型高速冷凍離心機：美國BECKMAN COULTER公司；UV-2550型分光光度儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 指標測定

蛋白酶活力測定采用福林法[8]；超氧陰離子的清除率測定采用鄰苯三酚法[9]；羥自由基的清除率測定采用鄰二氮菲法[10]。

1.3.2 酶解工藝路線和酶解條件優(yōu)化

1.3.2.1 木瓜蛋白酶酶解的工藝路線

大豆球蛋白→調(diào)漿→酶解→滅酶→酸沉→離心→上清液冷凍干燥

1.3.2.2 單因素試驗

以超氧陰離子和羥自由基的清除率為指標研究不同的酶與底物比、水解時間、pH值和溫度對木瓜蛋白酶水解大豆球蛋白的影響。

1.3.2.3 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇酶與底物比、酶解時間、酶解溫度和pH值作為考察因素，采用正交表L9（34）進行正交試驗，篩選大豆球蛋白的最佳酶解條件，并對最佳條件進行驗證試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 木瓜蛋白酶水解大豆球蛋白的單因素試驗

2.1.1 酶與底物比的影響

水解條件：溫度55℃，pH7.5，水解時間3 h。以超氧陰離子和羥自由基的清除率為指標研究4 000、6 000、8 000、10 000、12 000U/g的酶與底物比對水解的影響。酶與底物比對自由基清除率的影響見圖1。

圖1 酶與底物比對自由基清除率的影響Fig.1 Effects of enzyme concentration on scavenging rate of radical

由圖1可以看出，羥自由基的清除率隨酶與底物比呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在8 000 U/g時羥自由基清除率最高；在較低的酶與底物比時，超氧陰離子的清除率隨之逐漸升高，≥8 000U/g時超氧陰離子的清除率變化不規(guī)則。

2.1.2 pH值的影響

水解條件：酶和底物比8 000U/g，溫度55℃，水解時間3 h。以超氧陰離子和羥自由基清除率為指標研究6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的pH值對水解的影響。pH值對自由基清除率的影響見圖2。

圖2 pH值對自由基清除率的影響Fig.2 Effects of pH on scavenging rate of radical

由圖2可以看出，pH 6.0和6.5的羥自由基清除率較低，pH 7.0～8.0羥自由基清除率顯著升高，pH 7.5時的羥自由基清除率最大；超氧陰離子的清除率整體呈現(xiàn)不規(guī)則變化。

2.1.3 水解時間的影響

水解條件：酶和底物比8 000 U/g，溫度55℃，pH 7.5。以超氧陰離子和羥自由基清除率為指標研究1、2、3、4、5 h的水解時間對水解的影響。水解時間對自由基清除率的影響見圖3。

圖3 水解時間對自由基清除率的影響Fig.3 Effects of time on scavenging rate of radical

由圖3可以看出，羥自由基的清除率隨水解時間呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，水解3 h羥自由基清除率最大；超氧陰離子的清除率同樣呈現(xiàn)不規(guī)則變化。

2.1.4 水解溫度對水解的影響

水解條件：酶和底物比8 000 U/g，pH 7.5，水解時間3 h。以超氧陰離子和羥自由基清除率為指標研究40、45、50、55、60℃的水解溫度對水解的影響。水解溫度對水解度的影響見圖4。

圖4 水解溫度對水解度的影響Fig.4 Effects of temperature on scavenging rate of radical

由圖4可以看出，羥自由基的清除率與溫度變化正相關(guān)，55℃基本達到最大的羥自由基清除率；超氧陰離子的清除率變化既不明顯也不規(guī)則。

2.2 正交試驗

由以上單因素試驗可知，在不同的酶與底物比、pH值、水解時間和溫度下，羥自由基清除率變化有明顯的規(guī)律性，而超氧陰離子清除率變化沒有規(guī)律性。此外，超氧陰離子在機體內(nèi)主要通過超氧化物歧化酶催化清除，得到產(chǎn)物過氧化氫，而過氧化氫對機體的損傷性更強，需要谷胱甘肽還原酶或者過氧化氫酶協(xié)同作用才能消除超氧陰離子對機體的損傷[11]；羥自由基是最活躍的活性氧自由基，羥自由基的清除對機體更為重要。因此選擇羥自由基清除率作為正交試驗研究的指標。根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，對pH值、酶和底物比、水解時間和溫度四種因素各取三個水平，進行L9（34）正交試驗，正交試驗的因素、水平設(shè)計見表1，正交試驗結(jié)果見表2。

表1 正交試驗因素水平Table1 The factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交試驗結(jié)果Table2 Results of orthogonal experiment

由極差分析可知，各因素對水解度的影響大小順序為C＞B＞D＞A，即水解時間＞酶和底物比＞溫度＞pH值。根據(jù)K值大小得到酶解反應(yīng)條件的優(yōu)組合為A2B2C2D3，即pH7.5，酶和底物比8 000 U/g，水解時間3 h，溫度60℃，該條件不在正交試驗9組條件中，需進一步進行驗證試驗。驗證試驗結(jié)果顯示：優(yōu)組合條件下的羥自由基清除率為77.6%，超氧陰離子的清除率為47.3%。該條件下的羥自由基清除率要高于正交試驗結(jié)果的最大值75.2%，表現(xiàn)出更好的羥自由基清除能力。

3 結(jié)論

采用木瓜蛋白酶水解大豆球蛋白，結(jié)果表明，最佳的酶解條件為pH7.5，酶和底物比8 000 U/g，水解時間3 h，溫度60℃。優(yōu)組合條件下的羥自由基清除率為77.6%，超氧陰離子的清除率為47.3%。本研究為大豆水解肽的抗氧化性功能的開發(fā)提供了理論參考。

[1]Spector A.Oxidative stress-induced cataract:mechanism of action [J].The FASEB Journal,1995,9(12):1173-1182

[2]Aslan M,Ozben T.Reactive oxygen and nitrogen species in Alzheimer's disease[J].Current Alzheimer Research,2004,1(2):111-119

[3]Touyz RM.Reactive oxygen species and angiotensin II signaling in vascular cells--implications in cardiovascular disease[J].Brazilian Journal of Medical and Biological Research,2004,37(8):1263-1273

[4]Yu J,Hu Y,Xue M,et al.Purification and identification of antioxidant peptides from enzymatic hydrolysate of Spirulina platensis[EB/ OL].(2016-04-19)[2016-05-27].http://www.jmb.or.kr/journal/ view Journal.html doi=10.4014/jmb.1601.01033

[5]Jin D X,Liu X L,Zheng X Q,et al.Preparation of antioxidative corn protein hydrolysates,purification and evaluation of three novel corn antioxidantpeptides[J].Food Chemistry,2016,204:427-436

[6]Yousr M,Howell N.Antioxidant and ACE Inhibitory Bioactive Peptides Purified from Egg Yolk Proteins[J].International Journal of Molecular Sciences,2015,16(12):29161-29178

[7]鄒險峰,吳修利,陳星,等.大豆球蛋白的水解研究[J].食品研究與開發(fā),2012,33(3):159-162

[8]全國食品工業(yè)標準化技術(shù)委員會.蛋白酶制劑[S].北京:中國標準出版社,2009:6-8

[9]韓少華,朱靖博,王妍妍.鄰苯三酚自氧化法測定抗氧化活性的方法研究[J].中國釀造,2009(6):155-157

[10]謝海玉,紀銀莉,高維東,等.鄰二氮菲-Fe2+法測牦牛乳酪蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化性[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2012,38(11):175-178

[11]Zou X F,Ji Y T,Gao G,et al.A Novel Selenium-and Copper-Containing Peptide with Both Superoxide Dismutase and Glutathione Peroxidase Activities[J].Journal of Microbiology and Biotechnology, 2010,20(1):88-93

Study on Antioxidation of Papain Enzymolysis on Glycinin

ZOU Xian-feng，CHEN Li-na，WU Qiong，HUAI Ying，ZHANG Li-hong
（College of Food Science and Engineering，Changchun University，Changchun 130022，Jilin，China）

Glycinin was hydrolyzed by papain to produce antioxidant peptide.Base on the scavenging rate of radical，optimum enzymatic hydrolysis conditions were determined by single-factor and orthogonal test.Results showed that these optimum conditions were followed：pH 7.5，8 000 U/g of enzyme concentration，3 h of reaction time and 60℃.In these conditions，the scavenging rate of hydroxyl radical and superoxide anion were 77.6%and 47.3%respectively.

glycinin；antioxidation；papain

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.004

2016-05-27

吉林省教育廳“十三五”科學技術(shù)研究項目（2016296）

鄒險峰（1971—），男（漢），講師，博士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。