張 炫， 程鏡蓉， 唐道邦， 張友勝， 張業(yè)輝， 劉學(xué)銘，*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部功能食品重點實驗室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室， 廣東 廣州 510610;2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 江西 南昌 330045)

米曲霉發(fā)酵雞血血紅蛋白制備小分子肽條件的優(yōu)化

張 炫1，2， 程鏡蓉1， 唐道邦1， 張友勝1， 張業(yè)輝1， 劉學(xué)銘1，*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部功能食品重點實驗室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室， 廣東 廣州 510610;2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 江西 南昌 330045)

研究了米曲霉發(fā)酵雞血血紅蛋白(Hb)制備小分子肽的優(yōu)化工藝條件，并測定了多肽分子質(zhì)量的分布。在單因素實驗基礎(chǔ)上選出影響Hb多肽得率最主要的因素，并以多肽得率作為響應(yīng)值，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝；通過凝膠色譜方法檢測Hb多肽分子的分布范圍。結(jié)果表明，接種量、培養(yǎng)溫度、起始pH值和裝液量為影響Hb得率最主要的因素，其優(yōu)化工藝為接種量7.9%，培養(yǎng)溫度30.2 ℃，起始pH值7.01，裝液量61 mL，Hb多肽得率由最初的1.85 mg/mL提高到2.18 mg/mL；采用HPLC凝膠色譜法測定Hb多肽分子質(zhì)量，其范圍主要集中在1 000～6 500 u，且在1 600～2 500 u段多肽含量最多，占總量的38.39%。

凝膠色譜法； Hb多肽； 響應(yīng)面法； HPLC

據(jù)美國農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計，2014年全球雞肉產(chǎn)量在8 529.2萬t左右，而中國雞肉的年產(chǎn)量為1 270萬t，位居世界第二[1]。大批活雞宰殺的同時會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物——雞血。由于雞血血腥味重、適口性差、不易儲藏，這些雞血并沒有真正利用起來。雞血是一種營養(yǎng)價值很高的功能性食品，含大量的蛋白質(zhì)、豐富的氨基酸以及微量元素、維生素、酶類和其他一些生物活性物質(zhì)[2]。雞血中的血紅蛋白質(zhì)(Hb)占全血蛋白質(zhì)的65%以上。近年來，許多研究者利用生物酶水解Hb從中分離出ACE抑制肽[3-4]、抗氧化肽[5]、抗菌肽[6]等生物活性肽，無疑為Hb的高值化利用提供了一個很好的方向。

目前，將Hb轉(zhuǎn)化為小分子多肽的方法主要有化學(xué)法、酶解法以及微生物降解法。化學(xué)法因水解程度不易控制、副反應(yīng)多、營養(yǎng)破壞嚴(yán)重等原因，已很少應(yīng)用于生產(chǎn)Hb多肽。日前，大部分研究利用生物酶水解Hb獲取Hb多肽[7-8]，但是生物酶法降解率低、成本高，而微生物降解投入低、操作簡單、降解效果好[9]，為制備Hb多肽提供了一個好的研究方向。當(dāng)前國內(nèi)對微生物發(fā)酵降解Hb制備多肽的研究報道較少。

米曲霉是公認(rèn)的食品安全菌株，能產(chǎn)生多種蛋白酶，尤其是堿性蛋白酶和中性蛋白酶[10]。本研究選用1株主要產(chǎn)堿性蛋白酶的米曲霉作為出發(fā)菌株，通過單因素實驗，確定影響米曲霉發(fā)酵雞血制備多肽的主要條件，采用中心組合試驗設(shè)計和響應(yīng)面法(RSM)分析其優(yōu)化的發(fā)酵工藝；利用凝膠過濾色譜法測定發(fā)酵液中多肽分子質(zhì)量的分布， 旨在為制備Hb多肽提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

GIM3.236米曲霉，購于廣東省微生物菌種保藏中心。

1.1.2 主要試劑與儀器

1)主要試劑。細(xì)胞色素C，純度95%以上；抑肽酶，純度99%以上；桿菌肽，USP級；Gly- Gly- Tyr-Arg，純度97%以上；Gly- Gly- Gly，純度NT級，以上標(biāo)準(zhǔn)品均購自美國Sigma公司。三氯乙酸(TCA)、Folin-酚試劑，其他試劑均為分析純。

2)主要儀器。Kjeltec 8400型全自動凱氏定氮儀，F(xiàn)OSS分析儀器公司；1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；UV- 1800型紫外可見分光光度計，日本島津公司。

1.1.3 培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng)基：PDA瓊脂培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏5 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，NaCl 2 g/L，蒸餾水，pH值調(diào)至7.5。搖瓶種子培養(yǎng)條件：將10 mL無菌水倒入斜面，輕輕刮起斜面孢子，倒入裝液100 mL三角瓶中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h。

Hb發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖15 g/L，Hb粉10 g/L，KH2PO4·3H2O 2 g/L，NaCl 4 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CuSO4·5H2O 0.001 g/L，MnSO4·7H2O 0.001 g/L，CaCl20.005 g/L，ZnSO4·7H2O 0.005 g/L，VB10.001 g/L，APG-2000 0.1 g/L，pH值調(diào)至7.5，無菌水。

1.2 Hb粗粉的制備方法

新鮮雞血中添加檸檬酸鈉5 g/L，置4 ℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清液，下層沉淀加等體積生理鹽水洗滌2次，再加等體積超純水超聲波儀中溶脹破壁10 min，靜置10 min；在4 ℃、6 000 r/min離心15 min，棄沉淀獲上清液，真空冷凍干燥得到Hb粉[11]。

1.3 分子質(zhì)量檢測方法

1)色譜法。TSKgel G2000SWXL型色譜柱(300 mm×7.8 mm)，流動相為乙腈、水、三氟乙酸，體積比為10∶90∶0. 1；流速為0.5 mL/min；檢測波長為UV 220 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣體積為20 μL。

2)樣品的處理。采用流動相配制標(biāo)準(zhǔn)品；樣品先用15 g/L三氯乙酸(TCA)與發(fā)酵液上清液等體積混合，靜置30 min，再離心去除雜蛋白；用兩倍濃度的流動相與上述溶液等體積混合，0.22 mm濾頭過濾制備1 mL的樣品。

1.4 測定方法

1.4.1 酶活的測定

Folin酚法[12]。將發(fā)酵液抽濾，濾去菌體，常溫下6 000 r/min離心15 min，得到的上清液即粗酶液；以添加pH值為8.5的磷酸鹽緩沖液的酪蛋白溶液為底物，在40 ℃、pH值為8.5的條件下，將堿性蛋白酶每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量定義為一個酶活力單位(見式(1))，酶活力單位以U/mL表示。

酶活力=(A×K)/(t×V) ，

(1)

式(1)中，A為樣品測得的OD值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酪氨酸質(zhì)量濃度，μg/mL；K為稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時間，min；V粗酶液的體積，mL。

1.4.2 氨基氮的測定

氨基氮(游離氨基酸以及一些寡肽)用中性甲醛滴定法[13]測定。

1.4.3 TCA法測非蛋白氮

TCA法測非蛋白氮(主要指肽類物質(zhì)以及游離氨基酸)。在酶水解液中加入等體積的12.5 g/L的TCA溶液，混勻后靜置20 min，10 000 r/min、4 ℃離心20 min，用凱氏定氮儀測量上清液中非蛋白氮的含量[14]。

1.4.4 可溶性氮的測定

將發(fā)酵液抽濾、離心得到的發(fā)酵液上清液即為可溶性氮樣品，用凱氏定氮法測量?？扇苄缘ò被?、非蛋白氮以及易溶于水的蛋白質(zhì)。

1.5 單因素實驗

1.5.1 發(fā)酵時間的確定

考察不同的培養(yǎng)時間對米曲霉發(fā)酵雞血Hb制備小分子肽的影響，在接種量6%、裝液量60 mL、起始pH值為7.5、轉(zhuǎn)速150 r/min、28 ℃條件下分別培養(yǎng)2，3，4，5，6，7，8 d取樣。

1.5.2 接種量的確定

向斜面倒入無菌水，將米曲霉孢子懸液置于種子液培養(yǎng)24 h。取10 mL種子液洗滌、105 ℃干燥2 h稱重，反復(fù)3次，測得的米曲霉質(zhì)量濃度為8.4 g/L。以此為基準(zhǔn)，考察不同的接種量2%，4%，6%，8%，10%五個水平對米曲霉制備小分子肽的影響。在裝液量60 mL、起始pH值為7.5、轉(zhuǎn)速150 r/min、28 ℃條件下培養(yǎng)3 d。

1.5.3 發(fā)酵溫度的確定

考察不同的發(fā)酵溫度對米曲霉制備小分子肽的影響。分別設(shè)定了26，28，30，32，34 ℃五個水平，在接種量6%、裝液量60 mL、起始pH值為7.5、轉(zhuǎn)速150 r/min條件下培養(yǎng)3 d。

1.5.4 搖床轉(zhuǎn)速的確定

考察不同的搖床轉(zhuǎn)速對米曲霉發(fā)酵雞血Hb制備小分子肽的影響。選取轉(zhuǎn)速90，120，150，180，200 r/min 五個水平，在接種量6%、裝液量60 mL、起始pH值7.5、28 ℃條件下培養(yǎng)3 d。

1.5.5 裝液量的確定

考察不同的裝液量對米曲霉發(fā)酵雞血Hb制備小分子肽的影響。選定40，60，80，100，120 mL五個水平，在接種量6%、起始pH值7.5、轉(zhuǎn)速150 r/min、28 ℃條件下培養(yǎng)3 d。

1.5.6 起始pH值的確定

考察不同的起始pH值對米曲霉發(fā)酵雞血Hb制備小分子肽的影響。選取起始pH值分別為6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0七個水平，在接種量6%、裝液量60 mL、轉(zhuǎn)速150 r/min、28 ℃條件下培養(yǎng)3 d。

1.6 響應(yīng)面設(shè)計

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取影響米曲霉發(fā)酵雞血Hb制備小分子的最主要因素，采用BOX-Behnken試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析實驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 培養(yǎng)時間對米曲霉發(fā)酵雞血Hb制備小分子肽的影響

培養(yǎng)時間對米曲霉發(fā)酵雞血Hb制備小分子肽影響的實驗結(jié)果見圖1。由圖1可見，隨發(fā)酵時間的推移，pH值迅速升高，到3 d時達(dá)到最大值8.7，隨后開始緩慢下降；而堿性蛋白酶活力也在第3天達(dá)到最大值，其后酶活力明顯降低，多肽的得率3 d時最大，隨后開始減少。此結(jié)果的原因是，米曲霉在生長過程中釋放出堿性蛋白酶水解Hb，到第3天多肽的得率最高，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵環(huán)境的變化使得酶活力開始下降，且米曲霉菌體的增加利用大部分的多肽，其得率反而呈下降趨勢；直至發(fā)酵8 d時，生長環(huán)境惡劣，菌體開始自溶，釋放出自身的含氮物質(zhì)，使得氨基氮、非蛋白氮以及可溶性氮的含量明顯增加；發(fā)酵后期會產(chǎn)生一些含氮類的次級代謝產(chǎn)物，對多肽的品質(zhì)會有一定的影響[15]。因此，選擇3 d為較佳發(fā)酵時間，考慮到培養(yǎng)3 d和4 d后發(fā)酵液中多肽得率的變化不大，所以后面響應(yīng)面優(yōu)化沒有考察培養(yǎng)時間。

圖1 培養(yǎng)時間與米曲霉發(fā)酵雞血Hb制備小分子肽的關(guān)系Fig.1 Effect of culture time on fermentation of hemoglobin from chicken blood preparation of small peptides by Aspergillus oryzae

2.1.2 接種量對米曲霉發(fā)酵雞血Hb制備小分子肽的影響

圖2 接種量與米曲霉發(fā)酵雞血Hb制備小分子肽的關(guān)系Fig.2 Effect of inoculation on fermentation of hemoglobin from chicken blood preparation of small peptides by Aspergillus oryzae

接種量對米曲霉發(fā)酵雞血Hb制備小分子肽影響的實驗結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著接種量的增加，發(fā)酵液中可溶性氮的含量增加明顯，酶活力上升趨勢顯著。多肽的得率為8%時，多肽的得率最高，呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，說明接種量的多少直接影響米曲霉菌體濃度，進(jìn)而影響米曲霉的產(chǎn)酶量和多肽得率。接種量過少，堿性蛋白酶分泌較少，致使Hb水解率低，多肽得率相應(yīng)減少；接種量過多時，米曲霉生長旺盛，會吸收大量的肽類水解物，反而使多肽的得率不高。因此8%接種量為最適接種量。

2.1.3 培養(yǎng)溫度對米曲霉發(fā)酵雞血Hb制備小分子肽的影響

培養(yǎng)溫度對米曲霉發(fā)酵雞血Hb制備小分子肽影響的實驗結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨溫度的升高，發(fā)酵液中含氮量和酶活力都呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在30 ℃時，米曲霉發(fā)酵雞血產(chǎn)小肽的得率最高。低溫抑制米曲霉的生長，產(chǎn)酶減少以及對酶的活性也有抑制作用，導(dǎo)致多肽的得率不高；溫度過高同樣會抑制米曲霉的生長繁殖，影響多肽的得率，因此30 ℃為最適發(fā)酵溫度。

圖3 培養(yǎng)溫度與米曲霉發(fā)酵雞血Hb制備小分子肽的關(guān)系Fig.3 Effect of culture temperature on fermentation of hemoglobin from chicken blood preparation of small peptides by Aspergillus oryzae

2.1.4 搖床轉(zhuǎn)速對米曲霉發(fā)酵雞血Hb制備小分子肽的影響

搖床轉(zhuǎn)速對米曲霉發(fā)酵雞血Hb制備小分子肽影響的實驗結(jié)果見圖4，由圖4可知，搖床轉(zhuǎn)速對米曲霉發(fā)酵制備多肽的影響不顯著(p>0.05)。轉(zhuǎn)速增加并沒有提高發(fā)酵液中多肽的得率，酶活力也沒有明顯的變化趨勢。霉菌通風(fēng)發(fā)酵的需氧量比較小，在實驗轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)，對于菌絲體生長及產(chǎn)酶影響很小。因此搖床轉(zhuǎn)速快慢對米曲霉制備小分子肽影響不明顯，該因素不宜作為響應(yīng)面考察因素。

圖4 搖床轉(zhuǎn)速與米曲霉發(fā)酵雞血Hb制備小分子肽的關(guān)系Fig.4 Effect of rotation speed on fermentation of hemoglobin from chicken blood preparation of small peptides by Aspergillus oryzae

2.1.5 起始pH值對米曲霉發(fā)酵雞血Hb制備小分子肽的影響

起始pH值對米曲霉發(fā)酵雞血Hb制備小分子肽影響的實驗結(jié)果見圖5。由圖5可知，發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH值對米曲霉制備小分子肽有顯著(p<0.05)影響。隨起始pH值的升高，米曲霉堿性蛋白酶的活力出現(xiàn)先增后降的趨勢，多肽的得率亦如此，并在起始pH值為7.0時多肽的得率最高。低的起始pH值對米曲霉的生長不利，延長米曲霉的延滯期，米曲霉分泌堿性蛋白酶較少，酶活力低，導(dǎo)致多肽得率低；當(dāng)起始pH值為7.0時多肽得率最高；繼續(xù)提高起始pH值，其發(fā)酵條件越來越接近米曲霉的最適生長環(huán)境，米曲霉生長繁殖旺盛，酶活力提高的同時也吸收利用大部分肽類物質(zhì)，反而使得多肽得率降低，說明優(yōu)良的環(huán)境利于菌體生長但不利于產(chǎn)物積累。因此起始pH 值為7.0是制備多肽較佳的條件。

圖5 起始pH值與米曲霉發(fā)酵雞血Hb制備小分子肽的關(guān)系Fig.5 Effect of initial pH on fermentation of hemoglobin from chicken blood preparation of small peptides by Aspergillus oryzae

2.1.6 搖瓶裝液量對米曲霉發(fā)酵雞血Hb制備小分子肽的影響

搖瓶裝液量對米曲霉發(fā)酵雞血Hb制備小分子肽影響的實驗結(jié)果見圖6。由圖6可知 ，隨裝液量的增加，堿性蛋白酶的活力一直呈現(xiàn)增加的趨勢，但多肽的得率呈先增后降趨勢。裝液量主要影響的是通風(fēng)量，所以與搖床轉(zhuǎn)速的影響是相關(guān)的，60 mL以下時，通風(fēng)量足以供給霉菌生長和產(chǎn)酶，但是裝液量提高，就會影響微生物生長，從而影響產(chǎn)酶。因此60 mL是獲取多肽的較佳裝液量。

圖6 裝液量對米曲霉發(fā)酵雞血Hb制備小分子肽的影響Fig.6 Effect of medium volume on fermentation of hemoglobin from chicken blood preparation of small peptides by Aspergillus oryzae

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

2.2.1 BOX-Behnken試驗結(jié)果

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取對多肽得率影響比較顯著的幾個因素：接種量、培養(yǎng)溫度、起始pH值和裝液量，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗，以Hb多肽得率為響應(yīng)值。利用Design-Expert V8.0.6對實驗結(jié)果進(jìn)行分析，見表1。

2.2.2 模型的建立與顯著性檢驗

采用Design Expert軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，其二次多項回歸模型為：多肽得率=0.340-2.33×10-3A+5.92×10-3B+4.17×10-3C+4.75×10-3D-8.50×10-3AB-0.013AC+7.50×10-3AD-0.014BC-5.25×10-3BD-0.014CD-0.025A2-0.035B2-0.031C2-0.018D2。

此模型的方差分析如表2，模型是極顯著，失擬項不顯著，相關(guān)系數(shù)R2>0.9，模型的擬合度較好。因此該模型可以用于米曲霉發(fā)酵雞血Hb制備小分子肽條件優(yōu)化的理論預(yù)測。由表2可以得出，各發(fā)酵條件對Hb多肽得率影響由大到小的順序：培養(yǎng)溫度、裝液量、起始pH值、接種量，且接種量和起始pH值、培養(yǎng)溫度和起始pH值以及起始pH值和裝液量之間的交互作用顯著(p<0.05)，其他交互項不顯著(p>0.05)。

表1 BOX-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

2.2.3 響應(yīng)面結(jié)果分析

發(fā)酵條件中各因素對Hb多肽得率的交互作用如圖7至圖12。結(jié)合表2可以得出，圖8、圖10和圖12中等高線較緊密、呈橢圓，說明兩因素間交互作用顯著(p<0.05)；圖7、圖9以及圖11中等高線接近圓形，兩因素間的交互作用不顯著。從圖7可看出，其等高線接近圓形，交互作用不明顯，說明Hb多肽得率對兩因素之間的變化影響較小。圖8顯示，當(dāng)pH值為某一固定值時，接種量的改變對Hb多肽得率的影響較大；反之，當(dāng)接種量為某一固定值時，pH值的變化對Hb多肽得率的影響較小，這說明多肽得率對接種量的變化比對起始pH值的變化更加敏感[16]。

圖9顯示，響應(yīng)面圖中的等高線接近圓形，交互作用不顯著(p>0.05)，說明Hb多肽得率對接種量和裝液量之間的變化影響不明顯。圖10顯示，當(dāng)pH值為某一固定值時，培養(yǎng)溫度的變化對Hb多肽得率的影響較大；當(dāng)培養(yǎng)溫度為某一固定值時，起始pH值的變化對Hb多肽得率的影響較小，說明Hb多肽得率對培養(yǎng)溫度的變化比對起始pH值的變化更加敏感。

表2 試驗結(jié)果的方差分析

圖7 接種量和培養(yǎng)溫度對Hb多肽影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface for effect of inoculum and culture temperature on yield of Hb peptides

圖8 接種量和起始pH值對Hb多肽影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface for effect of inoculum and initial pH on yield of Hb peptides

圖9 接種量和裝液量對Hb多肽影響的響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface for effect of inoculum and medium volume on yield of Hb peptides

圖10 培養(yǎng)溫度和起始pH值對Hb多肽影響的響應(yīng)面圖Fig.10 Response surface for effect of culture temperature and initial pH on yield of Hb peptides

圖11 培養(yǎng)溫度和裝液量對Hb多肽影響的響應(yīng)面圖Fig.11 Response surface for effect of culture temperature and medium volume on yield of Hb peptides

圖11顯示其等高線接近圓形，交互作用不明顯，說明Hb多肽得率對培養(yǎng)溫度和裝液量之間的變化影響不顯著(p>0.05)。圖12顯示，當(dāng)pH值為某一固定值時，裝液量的變化對Hb多肽得率的影響較?。划?dāng)裝液量為某一固定值時，pH值的變化對Hb多肽得率的影響較大，說明Hb多肽得率對起始pH值的改變比對裝液量的變化敏感。

圖12 起始pH和裝液量對Hb多肽影響的響應(yīng)面圖Fig.12 Response surface for effect of initial pH and medium volume on yield of Hb peptides

從響應(yīng)面結(jié)果分析得出，起始pH值是影響Hb多肽得率的主要因素。為得到優(yōu)化的工藝參數(shù)，對此模型方程求一階偏導(dǎo)，獲得較佳發(fā)酵工藝條件為：接種量7.94%，培養(yǎng)溫度30.15 ℃，起始pH值7.01，裝液量60.92 mL，Hb多肽得率的模型預(yù)測值是0.336 mg/mL。

2.2.4 驗證實驗

在響應(yīng)面試驗得到的優(yōu)化發(fā)酵工藝條件下進(jìn)行實驗，重復(fù)3次，Hb多肽得率為0.348 mg/mL，與模型預(yù)測值相近，說明建立的模型是合理的。米曲霉發(fā)酵條件優(yōu)化后，其Hb多肽得率提高了約0.05 mg/mL。

2.3 Hb多肽分子質(zhì)量的測定

圖13 多肽樣品的凝膠色譜圖Fig.13 Gel chromatograms of peptides sample

多肽標(biāo)品的凝膠色譜圖見圖13，其標(biāo)品中細(xì)胞色素C、抑肽酶、桿菌肽、Gly- Gly- Tyr-Arg以及Gly- Gly- Gly的質(zhì)量濃度分別為0.2，0.2，0.2，0.02，0.2 mg/mL，橫坐標(biāo)表示出峰時間(min)。發(fā)酵液中Hb多肽的凝膠色譜見圖14。將樣品的出峰時間與標(biāo)品進(jìn)行對比得出，樣品中Hb多肽分子質(zhì)量的大小主要集中在1 600～5 000 u，其中多肽分子質(zhì)量在1 600～2 500 u含量最多，占總峰面積的38.39%,具體結(jié)果見表3。根據(jù)標(biāo)品中一個波峰表示一種物質(zhì)，比較得出多肽樣品中波峰數(shù)量較少，其原因可能是樣品經(jīng)過4倍稀釋后，單個種類的多肽分子含量稀釋得更少，導(dǎo)致多肽樣品相差一兩個氨基酸的色譜圖分離效果不太明顯，從多肽標(biāo)品凝膠色譜圖中的桿菌肽和Gly- Gly- Tyr-Arg可以得出。

表3 樣品出峰時間及其分子質(zhì)量大小

圖14 Hb多肽分子質(zhì)量凝膠色譜圖Fig.14 Molecular weight gel chromatograms of peptides sample

3 結(jié) 論

通過單因素實驗，確定了接種量、培養(yǎng)溫度、起始pH值和裝液量為影響Hb得率最主要的因素。采用Box-Behnken 試驗對發(fā)酵條件進(jìn)一步優(yōu)化，得到優(yōu)化條件為，接種量7.9%、培養(yǎng)溫度30.2 ℃、起始pH值7.01、裝液量61 mL，Hb多肽得率由最初的1.85 mg/mL提高了0.32 mg/mL；通過HPLC凝膠色譜法測定Hb多肽分子質(zhì)量，其范圍主要集中在450～6 500 u，且分子質(zhì)量在1 600～2 500 u組分含量多達(dá)38.39%。分子質(zhì)量在330～450 u占17.07%，利用米曲霉降解雞血Hb可以獲得分子質(zhì)量為330～1 500 u的生物活性肽。

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(責(zé)任編輯：葉紅波)

Optimization of Fermentation Conditions of Chicken Blood Hemoglobin for Preparation of Small Peptides byAspergillusoryzae

ZHANG Xuan1,2, CHEN Jingrong1, TANG Daobang1, ZHANG Yousheng1,ZHANG Yehui1， LIU Xueming1,*

(1.SericulturalandAgri-FoodResearchInstitute，GuangdongAcademyofAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofFunctionalFood，MinistryofAgriculture/GuangdongKeyLaboratoryofAgriculturalProductsProcessing，Guangzhou510610，China；2.CollegeofBioscienceandBioengineering，JiangxiAgriculturalUniversity，Nanchang330045，China)

The fermentation conditions of chicken blood hemoglobin (Hb) for the preparation of small peptides byAspergillusoryzaewere optimized and the molecular weight distribution of the polypeptides were determined. On the basis of single factor experiments, response surface analysis methodology (RSM) were used to optimize the preparation conditions about Hb polypeptide. A regression model for Hb polypeptide yield was established to optimize the fermentation process and the distribution of Hb polypeptide molecular weights were determined by the gel chromatography method. The results showed that factors affected the Hb polypeptide yield were inoculation amount, culture temperature, initial pH, and the fluid volume. The optimal conditions were inoculation amount 7.9%, culture temperature 30.2 ℃, initial pH 7.01, and medium volume 61 mL. Under these conditions, Hb polypeptide yield increased from 1.85 mg/mL to 2.18 mg/mL. According to the gel chromatography method, the Hb peptide molecular weights were mainly concentrated in the range of 1 000-6 500 u, of which 1 600-2 500 u took up the most abundant (38.39%).

gel chromatography methods； Hb polypeptide； response surface method； HPLC

2016-01-05

廣東省科技計劃項目(2014A020208046)；廣東省促進(jìn)科技服務(wù)業(yè)發(fā)展計劃項目(2013B040400009) 。

張 炫，男，碩士研究生，研究方向為微生物發(fā)酵與代謝工程；

10.3969/j.issn.2095-6002.2017.01.008

2095-6002(2017)01-0050-09

張炫，程鏡蓉，唐道邦，等. 米曲霉發(fā)酵雞血血紅蛋白制備小分子肽條件的優(yōu)化[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2017,35(1):50-58. ZHANG Xuan, CHEN Jingrong, TANG Daobang, et al. Optimization of fermentation conditions of chicken blood hemoglobin for preparation of small peptides byAspergillusoryzae[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(1):50-58.

TS251.93； S873

A

*劉學(xué)銘，男，研究員，博士，主要從事畜禽水產(chǎn)加工方面的研究，通信作者。