張海冰，楊穗娟，彭南秀，沈 丹，薛 紅，何日文，陳 裕，胡永輝，鐘錦輝，林 鴻，鐘卓玲，殷 實(shí)，張 楨，林鐘婷，鄧小敏，彭 聰，段曉冬，鄭麗蘭，張海明

（1. 廣州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東廣州 510440；2. 廣州市農(nóng)業(yè)局，廣東廣州 510405）

廣州市活禽批發(fā)市場禽流感病毒污染狀況調(diào)查

張海冰1，楊穗娟1，彭南秀1，沈 丹1，薛 紅1，何日文1，陳 裕1，胡永輝1，鐘錦輝1，林 鴻1，鐘卓玲1，殷 實(shí)1，張 楨1，林鐘婷1，鄧小敏1，彭 聰2，段曉冬2，鄭麗蘭1，張海明1

（1. 廣州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東廣州 510440；2. 廣州市農(nóng)業(yè)局，廣東廣州 510405）

[目的]了解廣州市活禽批發(fā)市場禽流感病毒的污染情況，為廣州市制定有針對性的防控措施提供技術(shù)支持。[方法] 2015年2月—2016年1月，按照隨機(jī)抽樣原則，對廣州市2個(gè)活禽批發(fā)市場進(jìn)行調(diào)查，每月采集1次棉拭子樣品（共3 090份），并對所采集的樣品進(jìn)行禽流感病毒熒光RT-PCR檢測。[結(jié)果]在該期間內(nèi)，2個(gè)活禽批發(fā)市場的樣品禽流感總陽性率為52.50%（1 625/3 090）；禽流感病毒檢出陽性率較高的月份是4月和9—12月，較低的是6—8月；水禽的禽流感感染風(fēng)險(xiǎn)是雞的1.6倍，環(huán)境中存在禽流感病毒的風(fēng)險(xiǎn)是雞的1.39倍；各月份中，1月、3月、11月和12月環(huán)境樣品的禽流感病毒陽性率顯著高于家禽樣品（P＜0.01），而6月份家禽樣品的禽流感病毒陽性率顯著高于環(huán)境樣品（P＜0.01）；來自廣東省內(nèi)（廣州市除外）的活禽樣品禽流感病毒陽性率最高，為49.31%，來自外省市的禽流感通用型陽性率最低，為31.43%（P＜0.01）。[結(jié)論]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，廣州市活禽批發(fā)市場的禽流感高發(fā)期為春夏及秋冬交替季節(jié)；活禽批發(fā)市場中的水禽和批發(fā)市場環(huán)境是禽流感病毒流行的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素。調(diào)查結(jié)果提示，今后要加強(qiáng)春夏和秋冬交替季節(jié)的禽流感防控工作，加強(qiáng)對批發(fā)市場水禽的禽流感防控和批發(fā)市場環(huán)境的清洗、消毒，以切實(shí)降低活禽批發(fā)市場的禽流感污染水平。

禽流感；活禽市場；活禽樣品；環(huán)境樣品；水禽；流行病學(xué)調(diào)查；

研究發(fā)現(xiàn)，活禽市場是禽流感病毒（Avian in fl uenza virus，AIV）的一個(gè)重要儲(chǔ)存庫[1]。在活禽市場，大量不同種屬、不同產(chǎn)地來源、不同健康狀況的活禽，以極高的密度聚集在一起，為AIV的基因重組和跨種間傳播提供了有利條件[2]。因此，活禽市場被認(rèn)為是禽流感病毒循環(huán)傳播的關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)[3]，并且是人感染H5N1、H7N9等流感的高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域[4]。廣州市所在的華南地區(qū)是“世界流感中心”之一[5]。該地居民有在活禽農(nóng)貿(mào)市場購買現(xiàn)宰活禽的消費(fèi)習(xí)慣，這進(jìn)一步增加了人通過活禽市場感染禽流感的風(fēng)險(xiǎn)。目前已有較多研究對活禽農(nóng)貿(mào)市場的禽流感病毒污染情況進(jìn)行了調(diào)查[6-7]，但對于活禽批發(fā)市場的研究相對較少。而農(nóng)貿(mào)市場的活禽絕大多數(shù)來自于活禽批發(fā)市場。為科學(xué)有效地開展禽流感防控，2015年2月—2016年1月選取廣州市2個(gè)活禽批發(fā)市場開展了為期12個(gè)月的禽流感病原學(xué)監(jiān)測，以期了解廣州市活禽批發(fā)市場AIV的種屬差異、季節(jié)流行差異、地區(qū)分布差異等信息，為進(jìn)一步防控禽流感提供參考。

1 方法

1.1 選擇對象

2015年2月—2016年1月，選取廣州市的2個(gè)活禽批發(fā)市場。在每個(gè)活禽批發(fā)市場，每月采集樣品1次。

1.2 抽樣策略及樣本量計(jì)算

按照隨機(jī)抽樣原則抽樣。對于活禽批發(fā)市場內(nèi)的禽類，按售賣的活禽種類進(jìn)行分層（如雞、水禽、其它禽類等3層）。采用兩階段隨機(jī)抽樣：第一階段，通過簡單隨機(jī)或系統(tǒng)隨機(jī)抽樣的方式，選擇所要進(jìn)行采樣調(diào)查的檔口；第二階段，對所選檔口內(nèi)的活禽進(jìn)行簡單隨機(jī)抽樣。

根據(jù)前期調(diào)查的活禽批發(fā)市場內(nèi)不同活禽種類的檔口數(shù)量，按照50%的檔口預(yù)期流行率、40%的可接受絕對誤差、95%的置信水平，確定需要采樣的檔口數(shù)量。然后，根據(jù)每個(gè)檔口內(nèi)活禽的存欄量，按照每個(gè)檔口50%的個(gè)體預(yù)期流行率、90%的試驗(yàn)敏感性、95%的置信水平，確定每個(gè)檔口需要采樣的數(shù)量（每個(gè)檔口存欄100～2 000只，計(jì)算得5份/檔）。同時(shí)，在每個(gè)檔口采集環(huán)境樣品5份。每次采樣的檔口不固定。采樣前，以系統(tǒng)隨機(jī)方式進(jìn)行隨機(jī)抽樣。對于環(huán)境樣品，優(yōu)先選擇潮濕和臟的區(qū)域，如污水、飲水槽、地面、籠子、屠宰板、裝屠宰活禽容器、垃圾箱等。

1.3 樣品采集

對活禽樣品，用棉拭子采集泄殖腔/咽喉雙棉拭子；對環(huán)境樣品，采用棉拭子涂抹方法。樣品存放在一個(gè)裝有10%甘油、雙抗和PBS液的EP管中，對樣品進(jìn)行唯一性編號(hào)。

1.4 儀器與試劑

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀7500，購自美國應(yīng)用生物有限公司；全自動(dòng)核酸提取儀，購自美國Thermo公司；熒光實(shí)時(shí)定量禽流感通用（AIV）熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，購自中山達(dá)安基因股份有限公司；RNA提取試劑，購自美國應(yīng)用生物有限公司。

1.5 病毒RNA提取及檢測

按照美國應(yīng)用生物有限公司AM1836-5 病毒核酸抽取試劑盒說明書方法和美國Thermo Scienti fi c KingFisher Flex全自動(dòng)磁珠提取純化系統(tǒng)的操作方法，提取病毒RNA；按照熒光實(shí)時(shí)定量禽流感通用（AIV）熒光定量RT-PCR檢測試劑盒使用說明書，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀7500儀器上進(jìn)行檢測。

1.6 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 20統(tǒng)計(jì)軟件和EXCEL軟件，對調(diào)查結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，對其中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)比，采用Pearson卡方進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 不同月份的通用型禽流感陽性率比較

2015年2月—2016年1月，在廣州市2個(gè)活禽批發(fā)市場共檢測樣品3 095份，檢出陽性1 625份，全年平均檢出陽性率為52.50%。在這12個(gè)月中，每個(gè)月都有陽性樣品被檢出。其中有5個(gè)月的陽性率大于平均陽性率，分別為4月和9—12月；1—5月的樣品陽性率與全年平均陽性率差異不顯著（P＞0.05），6—8月的樣品陽性率顯著低于全年平均陽性率，而9—12月的樣品陽性率顯著高于全年平均陽性率（P＜0.01）。各月陽性率見圖1。

圖1 2個(gè)活禽批發(fā)市場不同月份禽流感陽性率變化

2.2 不同種類樣品的禽流感陽性率和發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)比

對不同種類樣品的禽流感檢測發(fā)現(xiàn)，水禽棉拭子的陽性率最高，為66.67%，其它依次為環(huán)境棉拭子、雞棉拭子和其它活禽棉拭子（圖2）。以雞棉拭子陽性率為參考，分別進(jìn)行發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)比分析，發(fā)現(xiàn)水禽的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是雞的1.6倍，環(huán)境中存在禽流感病毒的風(fēng)險(xiǎn)是雞的1.39倍（P＜0.01），差異顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。風(fēng)險(xiǎn)比計(jì)算公式為：風(fēng)險(xiǎn)比（RR）=不同種類樣品的陽性率/雞棉拭子樣品的陽性率。

2.3 不同月份、種類樣品的禽流感陽性率比較

對2015年2月—2016年1月采集的活禽樣品和環(huán)境樣品進(jìn)行通用型禽流感病毒檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1月、3月、11月和12月份的環(huán)境樣品陽性率顯著高于家禽樣品（P＜0.01），而6月份家禽樣品的陽性率顯著高于環(huán)境樣品（P＜0.01），其他月份的活禽樣品和環(huán)境樣品陽性率差異不明顯（P＞0.05）。每月各樣品陽性率變化見圖3。

圖2 不同種類樣品禽流感陽性率比較

圖3 不同月份和種類樣品的通用型禽流感陽性率比較

2.4 活禽樣品和環(huán)境樣品的陽性率比較

比較廣州市2個(gè)活禽批發(fā)市場活禽樣品和環(huán)境樣品的陽性率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)環(huán)境樣品的通用型禽流感核酸檢測陽性率顯著高于相應(yīng)市場的活禽樣品核酸陽性率（P＜0.05）。具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 2個(gè)活禽批發(fā)市場活禽樣品和環(huán)境樣品的陽性率比較

2.5 不同來源活禽樣品的通用型禽流感陽性率和發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)比

對2個(gè)活禽批發(fā)市場不同來源地區(qū)的活禽樣品陽性率進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)廣州市以外的廣東省內(nèi)地區(qū)陽性率最高，為49.31%，廣東省外地區(qū)的最低，為31.43%。以廣州市活禽樣品陽性率為參考，計(jì)算發(fā)現(xiàn)廣州市的活禽發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是外省市的1.52倍，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表2 不同來源地區(qū)的活禽樣品禽流感病毒陽性率和發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)比

3 討論

本研究對廣州市2個(gè)活禽批發(fā)市場2015年2月—2016年1月的禽流感病毒污染情況進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每個(gè)月份都有陽性樣品被檢出，其中4月和9—12月的檢出陽性率均高于全年平均值。根據(jù)采樣檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1—5月份的檢出陽性率與全年平均值差異不顯著，6—8月份的陽性率顯著低于平均值，而9—12月份的陽性率顯著高于平均值。分析其原因可能是：廣州市地處亞熱帶沿海地區(qū)，全年平均氣溫為21.9 ℃，此濕熱環(huán)境極適合禽流感病毒的生長繁殖，因此全年都檢測出陽性樣品；6—8月份是廣州市的最熱時(shí)期，高溫環(huán)境不利于病毒的繁殖，因此禽流感陽性率較低；而4月份和9—12月份分別是春夏和秋冬交替時(shí)期，氣溫度較低，因此禽流感檢出陽性率明顯高于其它月份。這與曹藍(lán)等[8]的監(jiān)測結(jié)果基本一致，也與人感染禽流感的高發(fā)季節(jié)相一致[9]。

以雞棉拭子的陽性率為參考，進(jìn)行其他種類樣品的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)對比分析發(fā)現(xiàn)，水禽的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是雞的1.6倍，這與Olsen等[10]和Swayne等[11]的研究結(jié)論一致；環(huán)境中存在病毒的風(fēng)險(xiǎn)是雞的1.39倍，且差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Wang等[12]和顏玉炳等[13]的研究結(jié)果基本一致，說明水禽和環(huán)境是活禽批發(fā)市場禽流感防控的重要節(jié)點(diǎn)。因此，建議在活禽批發(fā)市場，加強(qiáng)對水禽和環(huán)境的衛(wèi)生監(jiān)督和消毒管理，或是在市場內(nèi)劃出獨(dú)立的區(qū)域銷售水禽。

不同來源地區(qū)的活禽樣品陽性率比較結(jié)果顯示，廣州市與廣東省內(nèi)地區(qū)（廣州市除外）的樣品陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而來自廣東省外地區(qū)的陽性率明顯低于廣州市及廣東省內(nèi)地區(qū)。基于此，可以認(rèn)為目前對于廣州市而言，禽流感的輸入風(fēng)險(xiǎn)主要來自本地而不是外地。該研究僅對2個(gè)批發(fā)市場12個(gè)月的數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，尚未開展H5、H7等亞型高致病性禽流感病毒的檢測和分析，下一步有必要對此開展相應(yīng)的深入研究，以切實(shí)了解本地區(qū)的高致病性禽流感輸入風(fēng)險(xiǎn)。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Epidemiological Survey on Avian In fl uenza in Live Poultry Wholesale Markets of Guangzhou City

Zhang Haibing1，Yang Suijuan1，Peng Nanxiu1，Shen Dan1，Xue Hong1，He Riwen1，Chen Yu1，Hu Yonghui1，Zhong Jinhiu1，Lin Hong1，Zhong Zhuoling1，Yin Shi1，Zhang Zhen1，Lin Zhongting1，Deng Xiaomin1，Peng Cong2，Duan Xiaodong2，Zheng Lilan1，Zhang Haiming1
（1. Guangzhou Animal Disease Prevention and Control Center，Guangzhou，Guangdong 510440；2. Guangzhou Agriculture Bureau，Guangzhou，Guangdong 510405）

[Objective] For fi guring out the infection status of avian in fl uenza virus（AIV）in live poultry wholesale markets in Guangzhou city，and providing technical supports for AI prevention and control．[Methods] An investigation towards 2 poultry wholesale markets was carried out from February 2015 to January 2016. Cotton swabs were sampled once a month，then altogether 3 090 collected samples were tested by real-time RT-PCR for AIV. [Results] The total positive rate of the two markets was 52.50%（1 625/3 090）in the whole period. Serious AIV infection was found in months of April and September to December，showing high positive rates，while the rates were lower in June to August. Compared with chicken swabs，the risk of waterfowl swabs carrying AIV was 1.6 times higher，and that of environmental swabs was 1.39 times higher. In addition，AIV positive rates in environmental samples were signi fi cantly higher than that in poultry samples（P＜ 0.01）in January，March，November and December，whereas June justthe opposite. The highest AIV positive rate of 49.31% were tested from avian samples of Guangdong province（except Guangzhou city）among the various origin areas，and the lowest rate of 31.43% for universal AIV was found from other provinces（P＜ 0.01）.[Conclusion]The seasons of high incidence of AI were periods from spring to summer and autumn to winter. Waterfowls and the environment in poultry wholesale markets were the key risk factors associated with AI prevalence. The results indicated that prevention and control of AI during high-occurrence seasons should be strengthened，so did the waterfowls，and the market environment should also be cleaned and disinfected frequently，so as to reduce the pollution levels effectively.

avian influenza；live bird markets；live poultry samples；environmental samples；waterfowls；epidemiological investigation

S851.38

B

1005-944X（2017）03-0001-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.03.001

廣東省農(nóng)業(yè)廳H7N9流感聯(lián)合攻關(guān)項(xiàng)目（粵農(nóng)函〔2014〕1046號(hào)）；廣東省省級科技計(jì)劃項(xiàng)目“H7N9亞型禽流感診斷方法和綜合防控技術(shù)研究”（2013B020224004）

并列第一作者：張海冰、楊穗娟、彭南秀、沈 丹

彭 聰、段曉冬、鄭麗蘭、張海明