甘 偉，趙陽玫，張寧寧，宋 奇，熊祥平，李 亮

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 611130）

瘦素對鴨成肌細(xì)胞增殖與分化的影響

甘 偉，趙陽玫，張寧寧，宋 奇，熊祥平，李 亮*

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 611130）

瘦素是一種重要的能量調(diào)控因子，存在于人體骨骼肌細(xì)胞，而瘦素在鴨肌肉生長和發(fā)育過程中的作用還不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)采用離體培養(yǎng)鴨成肌細(xì)胞、CCK-8、熒光定量PCR等技術(shù)，探索瘦素調(diào)控鴨成肌細(xì)胞的增殖和分化機(jī)理。結(jié)果表明：1 ng/mL瘦素促進(jìn)鴨成肌細(xì)胞生長，而10 ng/mL和100 ng/mL顯著抑制成肌細(xì)胞生長（P＜0.05）；瘦素處理24 h后，1 ng/mL 組的Myf5和MyoD的表達(dá)量最高，10 ng/mL組的Myf5和100 ng/mL組的MyoD的表達(dá)量最低（P＜0.05）；而MRF4和MyoG在各個(gè)濃度處理組的表達(dá)量均顯著下降（P＜0.05）；1 ng/mL瘦素處理24 h后，AMPK和PI3K的表達(dá)量也顯著升高（P＜0.05），即AMPK和PI3K參與瘦素調(diào)控鴨成肌細(xì)胞生長發(fā)育過程；分別抑制AMPK和PI3K信號通路后，瘦素誘導(dǎo)Myf5和MyoD表達(dá)被減弱（P＜0.05），而MRF4和MyoG的表達(dá)上升僅在AMPK被抑制組（P＜0.05）。以上數(shù)據(jù)表明，瘦素可通過激活A(yù)MPK和PI3K信號通路調(diào)控鴨成肌細(xì)胞增殖和分化，但是AMPK信號通路作用性應(yīng)大于PI3K信號通路。

瘦素；鴨成肌細(xì)胞；AMPK；PI3K；生肌調(diào)節(jié)因子家族（MRFs）

瘦素是 Leptin 基因編碼的脂源性內(nèi)分泌激素，人 Leptin 基因位于第7號染色體上，具有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，編碼167個(gè)氨基酸，分子量為16 ku[1]。前人研究已表明，瘦素可在腦中大量表達(dá)，對機(jī)體能量代謝和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起重要調(diào)控作用[2]。Shi等[3]發(fā)現(xiàn)，瘦素可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，并具有濃度依賴性。瘦素處理人成骨細(xì)胞后，骨橋蛋白和骨唾液酸蛋白（成骨細(xì)胞生長發(fā)育標(biāo)志蛋白）表達(dá)顯著升高[4]。

AMP激活的蛋白激酶（AMPK）和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）信號通路廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、氧化應(yīng)激及新陳代謝過程。瘦素處理血管平滑肌細(xì)胞后，p-AMPKα的表達(dá)量上升而細(xì)胞分化程度降低[5]。Chen等[6]研究表明，白藜蘆醇可通過磷酸化AMPK激活線粒體凋亡信號通路和Caspase3基因誘導(dǎo)小鼠3T3L1脂肪細(xì)胞系凋亡，隨后利用siRAN干擾AMPK表達(dá)后，白藜蘆醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的程度被減弱。烏索酸可激活PI3K-Akt信號通路促進(jìn)U937細(xì)胞分化，而添加LY294002（PI3K抑制劑）后，細(xì)胞分化程度明顯降低[7]。近年來，AMPK和PI3K在瘦素調(diào)控過程中的機(jī)理已受到廣泛關(guān)注。利用LY294002抑制PI3K活性后，瘦素促進(jìn)鵝顆粒細(xì)胞增殖的作用被減弱[8]。然而，AMPK和PI3K在瘦素調(diào)控鴨肌細(xì)胞發(fā)育過程中的機(jī)理還不夠明確。因此，本研究旨在探索瘦素與AMPK和PI3K信號通路在鴨成肌細(xì)胞生長發(fā)育過程的調(diào)控機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)所用鴨胚由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽育種場提供。所有胚蛋在相同的環(huán)境條件（溫度，濕度）下進(jìn)行，選用13胚齡雛鴨腿肌用于成肌細(xì)胞的培養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)程序獲得四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物操作規(guī)范與福利管理委員會同意。

1.2 試劑 氯仿、異丙醇、無水乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、乙二胺四乙酸（EDTA）等為國產(chǎn)分析純，由瑞進(jìn)特試劑耗材公司提供；DEPC、瓊脂糖、DNA Marker DL2000等購買于大連寶生物（TaKaRa）公司；RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen）購于成都奧克生物；胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、氨芐青霉素貯存液、5 mL移液槍頭、200目過濾器、400目過濾器、Ι型膠原酶、Dorsomorphin 2HCl（AMPK抑制劑）、2×Taq PCR Master Mix、PBS粉末和DH5α感受態(tài)細(xì)胞等購于成都溫江索萊寶科技有限公司；SYBR Rremix Ex×TaqTM（TaKaRa）購于成都天泰生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶、AICAR（AMPK激活劑）購于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和RT-qPCR 選用孵化期13胚齡雛鴨腿肌，采用混合酶法分離成肌細(xì)胞，具體步驟參照Liu等[9]。定量引物序列見表1。熒光定量反應(yīng)總體積為25 μL：模板 cDNA 8.5 μL，上、下游引物各2 μL，SYBR?Rremix Ex TaqTM12.5 μL。反應(yīng)條件為95℃ 10 s；95℃ 5 s；退火溫度參見表1，退火30 s；39個(gè)循環(huán)。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，并以不加模板cDNA為陰性對照。

1.4 總RNA提取 取鴨腿肌肌肉組織樣，置于液氮中冷凍并進(jìn)行研磨。取100 mg研磨好的樣品用Trizol法提取鴨腿肌的總RNA。采用Prime Scrip RT reagent Kit的mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，-20℃保存。

1.5 細(xì)胞活性檢測 細(xì)胞活性檢測參照Wang等[10]。首先，在96孔板中加入100 mL的細(xì)胞懸液后置于培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）預(yù)培養(yǎng)24 h。然后，向培養(yǎng)孔中分別加入瘦素（ProSpecTany TechnoGene Ltd., Rehovot, Israel），使其最終濃度分別為1、10、100 ng/mL，置于培養(yǎng)箱孵育。待培養(yǎng)時(shí)間到后向每孔加入10 mL CCK-8溶液，再將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1.5 h。最后，用酶標(biāo)儀（Bio-Rad Model 680, Richmond, CA, USA）測定在450 nm處的吸光度。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)目的基因的Ct值，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算，并以內(nèi)參基因GADPH和β-actin進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正。使用SAS 9.2軟件UNIVARIATE NORMAL程序驗(yàn)證是否符合正態(tài)分布，GLM程序進(jìn)行正態(tài)顯著性比較，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤形式表示，* 或不同小寫字母表示在P＜0.05時(shí)差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 鴨成肌細(xì)胞的離體培養(yǎng)及RNA的提取 離體培養(yǎng)的鴨成肌細(xì)胞如圖1所示。剛剛分離純化的成肌細(xì)胞為圓形（A），之后成肌細(xì)胞開始貼壁，大多數(shù)為圓形，少部分伸展為橢圓形，12 h后（B）大部分細(xì)胞完全貼壁，大多數(shù)伸展為梭形，部分為圓形，而后逐漸都變?yōu)樗笮渭?xì)胞。

收集不同時(shí)期的細(xì)胞樣，按照Trizol 法提取總RNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。由圖2可看出。28 S和18 S條帶較清晰，而 5 S條帶幾乎沒有，因此，所提取的總RNA結(jié)構(gòu)完整，可用于下一步熒光定量檢測。

表1 定量PCR引物

圖1 離體培養(yǎng)的鴨成肌細(xì)胞

圖2 鴨成肌細(xì)胞總 RNA 電泳

2.2 瘦素對鴨成肌細(xì)胞增殖和分化的影響 為了檢測瘦素在鴨成肌細(xì)胞增殖中的作用，本實(shí)驗(yàn)利用不同濃度的外源性瘦素（1、10、100 ng/mL）處理細(xì)胞24 h。CCK-8檢測結(jié)果顯示，1 ng/mL組顯著高于對照組（P＜0.05），表明其促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖；而10、100 ng/mL組顯著低于對照組（P＜0.05），說明其抑制成肌細(xì)胞增殖（圖3）。RT-qPCR檢測瘦素調(diào)節(jié)鴨成肌細(xì)胞增殖與分化關(guān)鍵基因（圖4）。1 ng/mL組MyoD和Myf5表達(dá)量顯著高于對照組（P＜0.05），而10、100 ng/mL組顯著抑制MyoD和Myf5的表達(dá)。瘦素所有濃度處理組MoyG和MRF4 mRNA表達(dá)量均顯著低于對照組（P＜0.05），且1 ng/mL組顯著高于10、100 ng/mL組（P＜0.05），10 ng/mL與100 ng/mL組間均沒有顯著差異。因此，瘦素可促進(jìn)鴨成肌細(xì)胞增殖而抑制分化，且具有濃度依賴性，且將1 ng/mL作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的處理濃度。

2.3 瘦素激活A(yù)MPK和PI3K信號通路 由圖5可知，1 ng/mL瘦素處理鴨成肌細(xì)胞24 h后，AMPK和PI3K的表達(dá)量顯著上升（P＜0.05），即AMPK和PI3K參與瘦素調(diào)控鴨成肌細(xì)胞發(fā)育過程。

圖3 不同濃度瘦素處理24 h鴨成肌細(xì)胞活性

圖4 不同濃度瘦素對鴨成肌細(xì)胞增殖與分化關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

圖5 瘦素激活A(yù)MPK和PI3K信號通路

圖6 Compound C對瘦素調(diào)控Myf5、MyoD、MyoG和MRF4表達(dá)的影響

2.4 抑制AMPK信號通路后瘦素對鴨成肌細(xì)胞增殖與分化的影響 利用AMPK信號通路的特異性抑制劑Compound C（10 μmol/L）與Leptin（1ng/mL）共同處理生長中的鴨成肌細(xì)胞，處理時(shí)間為24 h（圖6）。熒光定量檢測結(jié)果顯示，阻斷AMPK后，MyoD和Myf5的表達(dá)量均發(fā)生下降，且顯著低于Leptin處理組（P＜0.05）。相反，MyoG和MRF4表達(dá)量顯著上升且高于Leptin處理組（P＜0.05）。

2.5 抑制PI3K信號通路后瘦素對鴨成肌細(xì)胞增殖與分化的影響 如圖7所示，利用LY294002（20 μmol/L）和瘦素共同處理鴨成肌細(xì)胞后，Myf5 和MyoD的表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。與AMPK抑制后不同，MyoG和MRF4表達(dá)在瘦素組和瘦素與LY294002共處理組間無明顯差異。

圖7 LY294002對瘦素調(diào)控Myf5、MyoD、MyoG和MRF4表達(dá)的影響

3 討 論

成肌細(xì)胞作為骨骼肌肌纖維的前體細(xì)胞，首先經(jīng)過大量的增殖后，逐漸融合并形成肌管，最終分化形成肌纖維。成肌細(xì)胞的增殖與分化是胚胎期骨骼肌發(fā)育的源動力。醫(yī)學(xué)研究中，成肌細(xì)胞被作為基因治療的理想型細(xì)胞，特別是在骨骼肌萎縮治療方面已有較多的臨床研究。鑒于成肌細(xì)胞形成肌管的過程可制約著整個(gè)肌肉的發(fā)育過程，因此被廣泛用于肌肉發(fā)育的基礎(chǔ)研究。于太永等[11]在豬骨骼肌成肌細(xì)胞中添加瘦素后，MyoD的表達(dá)量顯著升高，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，且隨著瘦素的濃度增高促進(jìn)效果更佳明顯，細(xì)胞增殖速度加快。本實(shí)驗(yàn)利用外源瘦素處理成肌細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上檢測細(xì)胞的增殖情況，CCK結(jié)果顯示1 ng/mL組的活細(xì)胞數(shù)量最多且顯著高于對照組，說明1 ng/mL 瘦素對成肌細(xì)胞具有促進(jìn)增殖的作用。10 ng/mL和100 ng/mL組的活細(xì)胞顯著低于對照組和1 ng/mL組，這說明隨著處理濃度的增加瘦素對成肌細(xì)胞的增殖作用受到了抑制，這可能是因?yàn)槭菟剡^高的濃度影響。而在瘦素對豬成肌細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，分別用10、20、40 ng/mL的瘦素處理后，細(xì)胞的數(shù)量呈線性增長[11]。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所相同，猜測可能是由于實(shí)驗(yàn)動物種類的差異造成的。為了更進(jìn)一步分析瘦素對鴨成肌細(xì)胞增殖的影響，本實(shí)驗(yàn)分別檢測了不同濃度瘦素處理對MyoD、Myf5的表達(dá)情況。結(jié)果同樣顯示，1 ng/mL瘦素處理對MyoD、Myf5表達(dá)量有顯著促進(jìn)作用，與CCK檢測相似，10 ng/mL和100 ng/mL組反而抑制其表達(dá)。因此，低濃度瘦素（1 ng/mL ）對促進(jìn)鴨成肌細(xì)胞增殖，而高濃度瘦素（10、100 ng/mL）起抑制作用。

鳥類的肌纖維總數(shù)在出雛前就已經(jīng)確定，出生后肌肉的生長是蛋白質(zhì)合成的增加，衛(wèi)星細(xì)胞與肌纖維融合，導(dǎo)致肌纖維增大或肥大。因此，胚胎時(shí)期的肌肉發(fā)育將直接影響出生后產(chǎn)肉性能，且具體研究分化過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)、了解肌肉的生長發(fā)育的機(jī)制對家畜產(chǎn)肉性能的提升是必不可少的。其中MoyG與MRF4主要在成肌細(xì)胞分化融合過程中發(fā)揮作用。研究表明，MyoG在對成肌細(xì)胞融會成肌管這一過程中有著不可替代的作用，而且MyoG在所有骨骼肌細(xì)胞中都可以表達(dá)，這在MRFs家族中是唯一的，因此它在肌肉發(fā)育過程中具有重要的地位。缺失MyoG基因的小鼠雖然仍有正常數(shù)量的成肌細(xì)胞，卻因?yàn)閲?yán)重缺乏肌纖維在出生時(shí)死亡[12]。MRF4在人類體內(nèi)主要功能是參與肌管的形成和終端分化，維持生肌細(xì)胞功能的作用，如果MRF4的基因序列發(fā)生突變或缺失，導(dǎo)致MRF4蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，就可能會引起肌肉組織病變，出現(xiàn)肌肉功能障礙[13]。所以，研究骨骼肌細(xì)胞時(shí)，MoyG與MRF4被定義為成肌細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因。本實(shí)驗(yàn)使用胚牛血清分化誘導(dǎo)鴨成肌細(xì)胞，利用瘦素處理，檢測分化標(biāo)志性基因MoyG、MRF4的表達(dá)情況，結(jié)果顯示1、10、100 ng/mL濃度的瘦素對MoyG、MRF4均有顯著影響，表達(dá)量顯著低于對照組。說明瘦素在鴨成肌細(xì)胞分化中具有抑制作用。

AMPK作為生物體內(nèi)的細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器，與細(xì)胞的生長發(fā)育、分泌代謝及抗應(yīng)激等生理過程緊密關(guān)聯(lián)。應(yīng)激條件下，如缺氧、缺血、缺糖、運(yùn)動、熱應(yīng)激等均可導(dǎo)致AMP/ATP比例顯著性升高或ATP的量減少，進(jìn)而激活細(xì)胞AMPK。瘦素能夠直接作用于肌肉組織，活化AMPKα2，增加肌細(xì)胞PPARα表達(dá)，調(diào)節(jié)骨骼肌脂肪酸氧化[14]。本實(shí)驗(yàn)通過抑制AMPK，并利用瘦素處理，探究瘦素是否通過AMPK調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞的增殖與分化。結(jié)果顯示，當(dāng)抑制AMPK時(shí)瘦素對MyoD和Myf5的促進(jìn)作用顯著降低，表達(dá)量顯著低于瘦素組；而MoyG和MRF4的表達(dá)顯著升高且高于瘦素組，這表明瘦素調(diào)控鴨成肌細(xì)胞增殖與分化可通過AMPK實(shí)現(xiàn)，且瘦素誘導(dǎo)的鴨成肌細(xì)胞變化可被AMPK抑制劑所抑制。

PI3K信號通路在細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要的作用，廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、新陳代謝等生理過程。PI3K作為一種細(xì)胞生長的重要誘導(dǎo)因子，瘦素處理大鼠血管平滑肌細(xì)胞后，PI3K-Akt信號通路被激活，細(xì)胞增殖速度明顯加快[15]。添加LY294002后，PI3K-Akt信號通路被抑制，瘦素誘導(dǎo)的細(xì)胞生長被減弱[15]。Maroni等[16]用瘦素處理鼠骨骼肌細(xì)胞10 min后，PI3K的活性開始顯著增強(qiáng)，細(xì)胞生長速度也明顯加快。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PI3K信號通路受到抑制時(shí)瘦素促進(jìn)Myf5和MyoD表達(dá)量上升的趨勢被減弱；瘦素處理分化期成肌細(xì)胞，當(dāng)PI3K信號通路受到抑制時(shí)MoyG、 MRF4的表達(dá)量無顯著變化，所以PI3K信號通路不參與瘦素調(diào)控鴨成肌細(xì)胞分化過程。

4 結(jié) 論

綜上可以得出，低濃度瘦素（1 ng/mL）對鴨成肌細(xì)胞具有促進(jìn)增殖的作用，而高濃度瘦素（10、100 ng/mL）無此作用特征。結(jié)果表明各濃度瘦素均抑制鴨成肌細(xì)胞的分化。另外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，AMPK和PI3K信號通路參與瘦素誘導(dǎo)的鴨成肌細(xì)胞增殖過程，而在分化過程僅AMPK作用明顯。

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E ff ect of Leptin on Proliferation and Di ff erentiation of Duck Myoblasts

GAN Wei, ZHAO Yang-ping, ZHANG Ning-ning, SONG Qi, XIONG Xiang-ping, LI Liang*
(Farm Animal Genetic Resources Exploration and Innovation Key Laboratory of Sichuan Province, Sichuan Agricultural University, Sichuan Chengdu 611130, China)

Leptin, a major regulator of energy, was present in human skeletal muscle. But the role of leptin in muscle growth and development is not well understood in duck. In this experiment, the regulation mechanism of leptin on the duck myoblasts proliferation and di ff erentiation were investigated using in vitro cultured myoblasts, CCK-8, fl uorescence quantitative PCR technology. Our results showed that 1 ng/mL leptin could promote the cell growth but 10 ng/mL and 100 ng/mL inhibit(P＜0.05). The expression of Myf5, MyoD signi fi cantly increased at 1 ng/mL for 24 h, decreased at 10ng/ mL (Myf5) and 100ng/mL (MyoD) (P＜0.05). However, leptin outstandingly reduced the expression of MRF4 and MyoG in all treatment concentrations(P＜0.05). Here, we also found the increase of AMPK and PI3K expression at 1ng/mL for 24 h(P＜0.05). In addition, suppressing the AMPK and PI3K attenuated the expression of Myf5 and MyoD by leptin induced(P＜0.05). However, the expression increased of MRF4 and MyoG were found only after inhibited the AMPK in leptin+Compound C group compared the leptin group(P＜0.05). Summing up, these data implied that leptin regulate duck myoblasts proliferation and di ff erentiation through activating the AMPK and PI3K, however, the AMPK may enjoy more important role than PI3K signal pathway.

Leptin; Duck myoblasts; AMPK; PI3K; Myogenic rEgulatory factors (MRFs)

S834.4

：A

：10.19556/j.0258-7033.2017-02-050

2016-08-19；

2016-09-21

四川省畜禽雨中攻關(guān)項(xiàng)目（20161NYZ0044）

甘偉（1991-），男，河南信陽人，碩士，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：571937541@qq.com

? 通訊作者：李亮，E-mail：liliang@sicau.edu.cn