張琪，甄守燕，霍乃蕊

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶雙酶水解羊骨粉的工藝研究

張琪1，甄守燕1，霍乃蕊2*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

[目的]堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶為水解羊骨粉制備膠原多肽效果最好的兩種單酶，為進(jìn)一步提高酶解效果。[方法]以羊骨粉為原料，進(jìn)行雙酶水解，比較同步水解與順序水解的效果，確定最優(yōu)水解工藝。[結(jié)果]同步水解AB2組合的水解效果最優(yōu)，各水解評價指標(biāo)均顯著高于單酶水解和順序水解(P<0.05)，與順序水解相比不顯著(P>0.05)，但優(yōu)于順序水解且大大節(jié)省了時間，其水解工藝為：底物濃度9%，堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶的加酶量分別為5.00%和4.25%，起始pH 8.5，50 ℃水解5 h時，水解度達(dá)29.79%，氨基酸態(tài)氮28.13%，多肽生成量110.43 mg·g-1，短肽得率73.88%。[結(jié)論]雙酶同步水解羊骨粉提高酶解效果的同時，也為充分水解羊骨制備膠原多肽提供了試驗(yàn)支持。

堿性蛋白酶； 復(fù)合蛋白酶； 羊骨粉； 膠原多肽； 雙酶水解

我國羊肉生產(chǎn)和消費(fèi)比重占世界首位，但羊骨的相關(guān)研究和開發(fā)卻落后于發(fā)達(dá)國家。羊骨營養(yǎng)豐富，氨基酸組成均衡，必需氨基酸含量高，其蛋白質(zhì)含量可與等量常見的鮮肉媲美[1]，骨膠原蛋白主要為三螺旋結(jié)構(gòu)，不易被生物體利用，酶解會使其轉(zhuǎn)變?yōu)殡暮陀坞x氨基酸[2]，多肽在人體腸道中的吸收率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于蛋白質(zhì)，且具有促進(jìn)人體脂質(zhì)代謝和對礦物質(zhì)的吸收、降低血液膽固醇濃度、促進(jìn)機(jī)體免疫功能等生理功能[3]。課題組先期研究，篩選到堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶是水解羊骨粉效果最好的3種酶，并對這3種單酶的水解工藝進(jìn)行了優(yōu)化。研究表明多肽的肽鏈越短，其生物活性越強(qiáng)[4]，雙酶作用時，由于作用位點(diǎn)增多，比單酶水解可獲得更多的短肽。水解度、多肽生成總量、短肽得率和游離氨基態(tài)氮是評價蛋白質(zhì)水解程度的常用指標(biāo)，本課題組研究結(jié)果表明4指標(biāo)之間呈正相關(guān)[5]。為了進(jìn)一步提高骨膠原水解程度，本研究擬以堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對羊骨粉進(jìn)行水解，測定其與酶解相關(guān)的指標(biāo)，比較同步水解和順序水解的水解效果，確定雙酶水解的最佳工藝條件，為羊骨粉的高值利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 原料及試劑

新鮮羊骨購買于山西太谷縣屠宰場(-20 ℃貯存?zhèn)溆?。堿性蛋白酶(A) (酶活≥200 U·mg-1，Solarbio)、復(fù)合蛋白酶(B)(酶活≥120 U·mg-1，Solarbio)；鉻黑T(天津市北辰方正試劑廠)；三乙醇胺(天津市北辰方正試劑廠)；對苯二甲醛(OPA)(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)；福林酚(天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

802型索式抽提器(天津市玻璃儀器廠)；722G可見分光光度計(上海精密儀器有限公司制造)；STARTER 3100 pH計(奧豪斯儀器(上海)有限公司)；Neofuge23R臺式高速冷凍離心(上海力申科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 羊骨粉制備

羊骨→清洗→高壓蒸煮(125 ℃，30 min)→水煮去脂→干燥(111 ℃，6 h)→高速萬能粉碎機(jī)粉碎→過80目篩。

2.2 雙酶水解的相關(guān)工藝

2.2.1 堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶同步水解

堿性蛋白酶(A)[6]以及復(fù)合蛋白酶(B)的響應(yīng)面法優(yōu)化得到的酶解工藝條件[7]下底物濃度均為9%，A和B的添加量分別為4.25%和5.00%，而酶解時間、溫度、pH值不同。因此設(shè)計試驗(yàn)如表1所示，酶解完成后，5 000 r·min-1離心15 min，取上清測定相應(yīng)的指標(biāo)。

2.2.2 堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶順序水解

在最優(yōu)水解工藝條件下，因堿性蛋白酶(A)的最佳水解溫度為45 ℃，復(fù)合蛋白酶(B)的最佳水解溫度為55 ℃，所以順序水解時，先由A酶在其最優(yōu)工藝條件下水解一定時間，再調(diào)整至B酶的最優(yōu)工藝pH和溫度下繼續(xù)水解，由于時間因素對堿性蛋白酶有顯著的影響[10]，所以控制總水解時間為625 min，水解時間比分別為：1∶3、3∶5、1∶1、5∶3、3∶1，進(jìn)行酶解和指標(biāo)測定。

表1 羊骨粉堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶雙酶同步水解設(shè)計表

Table 1 Simultaneous hydrolysis of sheep bone powder by alcalase and protamex

分組Testgroup時間/minTime溫度/℃TemperaturepHAB1300459.0AB2300508.5AB3300508.0AB4300557.5AB5325459.0AB6325508.5AB7325508.0AB8325557.5A300557.5B325459.0

2.3 指標(biāo)測定

水解度的測定采用OPA(鄰苯二甲醛)法；游離氨基酸態(tài)氮的測定采用中性甲醛滴定法；短肽得率的測定采用TCA法(三氯乙酸可溶性氮法)；游離鈣含量的測定采用EDTA滴定法；多肽生成總量的測定，測定的是分子量低于10 000 D且不被TCA所沉淀的多肽[8]。測定時以上各指標(biāo)均做3次重復(fù)。

2.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)首先采用excel進(jìn)行數(shù)據(jù)的初步分析及處理，然后采用SigmaPlot 10.0 軟件進(jìn)行顯著性分析,并繪制相關(guān)的柱形圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 同步水解各指標(biāo)測定結(jié)果

在底物濃度為9%，堿性蛋白酶(A)和復(fù)合蛋白酶(B)的添加量分別為4.25%和5.00%條件下進(jìn)行雙酶同步水解，時間、溫度和pH對水解效果和游離鈣含量的影響如圖1所示。

由圖1可見，堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶同步水解羊骨粉時，水解度，氨基酸態(tài)氮，多肽生成量，短肽得率，游離鈣含量的測定結(jié)果大體上均高于同等條件下堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶單酶水解的測定結(jié)果。這個測定結(jié)果，與本課題組研究的評價蛋白質(zhì)水解程度的常用指標(biāo)之間呈正相關(guān)理論一致，說明這些指標(biāo)在反應(yīng)酶解程度上是一致的，具有強(qiáng)相關(guān)性。同時，AB2組的各項(xiàng)水解指標(biāo)，除游離鈣含量外，均顯著高于其他各個組和單酶水解的各項(xiàng)指標(biāo)(P<0.05)，分析AB2組的游離鈣含量沒有理論值大的原因是，由于從骨組織釋放的Ca2+可能與酶解釋放出來的多肽發(fā)生了螯合作用[9]。所以，最終選擇的堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶的同步水解的復(fù)合水解方式為：在底物濃度為9%、溫度為50 ℃、pH為8.5的條件下同時加入堿性蛋白酶(5%)和復(fù)合蛋白酶(4.25%)。

圖1 堿性蛋白酶(A)和復(fù)合蛋白酶(B)同步水解時不同效果比較Fig.5 Comparison of different simultaneously hydrolyzing group by alcalase(A) and protamex(B) 注：不同字母表示同一指標(biāo)內(nèi)差異顯著(P<0.05)Note：Different letters show significant difference at the 0.05 level in the same index

圖2 堿性蛋白酶(A)和復(fù)合蛋白酶(B)順序水解時不同效果比較Fig.2 Comparison of different sequentially hydrolyzing group by alcalase(A) and protamex(B)

3.2 堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶順序水解的測定結(jié)果

堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶順序水解的測定結(jié)果如圖2所示。

由圖2可見，堿性蛋白酶與復(fù)合蛋白酶順序水解時間比為1∶3時，水解度，氨基酸態(tài)氮，多肽生成量，短肽得率均顯著高于其他組的對應(yīng)指標(biāo)(P<0.05)。而游離鈣含量卻是時間比為3∶1的組顯著高于其余組，說明在酶解的過程中，有可能有一些Ca2+被多肽或氨基酸螯合，這與順序水解的結(jié)果是一致的，說明游離鈣含量不能作為判定水解效果的指標(biāo)。

3.3 同步水解與順序水解結(jié)果比較

順序水解與同步水解的試驗(yàn)結(jié)果相比，同步水解AB2組水解效果最優(yōu)，其水解度可達(dá)29.79%，氨基酸態(tài)氮28.13%，多肽生成量110.43 mg·g-1，短肽得率73.88%；而順序水解先堿性蛋白酶后復(fù)合蛋白酶，水解時間比為1:3時效果最優(yōu)，水解度達(dá)29.67%，氨基酸態(tài)氮26.37%，多肽生成量109.71mg·g-1，短肽得率73.36%。兩者相比，順序水解各指標(biāo)均不及同步水解，兩者差異不顯著(P>0.05)，但同步水解大大節(jié)省了水解時間。總之，羊骨粉堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶同步水解的工藝優(yōu)于順序水解。

4 討論

因酶解畜骨得到的多肽的營養(yǎng)豐富，所以是近年來專家學(xué)者研究的熱點(diǎn)。白艷紅、謝靜、丁小燕等[11～13]研究了復(fù)合蛋白酶酶解豬骨、雞骨的最佳工藝，張群飛[14]研究了堿性蛋白酶酶解蝦籽的工藝條件。以上學(xué)者均研究了單酶的水解效果，而采用堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶雙酶水解的研究甚少。本試驗(yàn)采用同步水解和順序水解的方式對羊骨粉進(jìn)行了酶解，從而制得了相對分子質(zhì)量更小的短肽。

同步水解的各水解指標(biāo)均顯著高于單酶水解，水解度相比提高了1.67%，氨基酸態(tài)氮提高了1.65%，多肽生成量提高了26.61%，短肽得率提高了31.24%，游離鈣含量提高了20.64 mg·100 g-1，這與不同蛋白酶水解畜骨，由于互補(bǔ)作用，可增大蛋白酶對底物的水解的原理是一致的，且各水解指標(biāo)之間呈正相關(guān)的關(guān)系，這與本課題研究的表明水解效果的水解指標(biāo)之間的關(guān)系也是一致的，另外通過試驗(yàn)表明，游離鈣含量不能作為判斷酶解效果的指標(biāo)，因?yàn)楣墙M織釋放的Ca2+可能與酶解釋放出來的多肽發(fā)生了螯合作用，形成了鈣螯合膠原肽。

此外，試驗(yàn)結(jié)果表明，順序水解需水解625 min而同步水解只需要作用300 min，此時同步水解的水解效果還優(yōu)于順序水解，另外同步水解還具有一次投酶，操作簡單的優(yōu)點(diǎn)，所以，采用同步水解的方法水解羊骨骨粉制備膠原短肽的方法更可靠。

5 結(jié)論

堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶雙酶同步水解AB2組合的水解效果最優(yōu)，各水解指標(biāo)均顯著高于單酶水解和順序水解(P<0.05)，此時的最佳水解工藝為：起始pH 8.5，堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶的加酶量分別為5.00%和4.25%，底物濃度為9%，50 ℃水解5 h。同步水解還有操作簡單，節(jié)省時間等優(yōu)點(diǎn)。另外，研究表明，游離鈣含量不能作為酶解骨粉的指標(biāo)?？傊?，通過以上試驗(yàn)可以說明，雙酶同步水解羊骨粉提高酶解效果的同時，也為充分水解羊骨制備膠原多肽提供了試驗(yàn)支持。這對于日益追求可持續(xù)發(fā)展的今天來說，運(yùn)用此技術(shù)可以更好得利用我國龐大的骨資源，為我國提供良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。

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(編輯：馬榮博)

The Study on the Hydrolysis of Alcalase and Protamex to Sheep Bone Powder

Zhang Qi1, Zhen Shouyan1, Huo Nairui2*

(1.CollegeofFoodScienceandEngineering,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

[Objective]Alcalase and protamex were the best enzymes for collagen polypeptide that hydrolyzed from the sheep bone through screening.[Methods]This research compared the effect of sequentially and simultaneously hydrolyzing to further improve the enzyme effect and to determine the best condition for hydrolyzing.[Results]This experiment showed that:The group of simultaneously hydrolyzing AB2 that the hydrolysis of indicators were extremely higher than the single (P<0.05) compared with sequentially hydrolyzing is insignificant(P>0.05) but saved time extremely in condition of 9% substrate,5% (E/S) alcalase and 4.25% (E/S) protamex,initial pH 8.5,50 ℃,5 h. From researching that the degree of hydrolysis,amount of amino-acid nitrogen,amount of formed polypeptides,the obtaining rate of oligopeptides partly researched to 29.79%, 28.13%, 110.43 mg·g-1and 73.88%.[Conclusion]To sum up,double enzyme simultaneously hydrolyzing not only could improve the enzyme effect but also could provide experimental support for the preparation of collagen polypeptide from sheep bone.

Alcalase， Protamex， Sheep bone， Collagen peptide， Double enzyme hydrolysis

2016-07-17

2016-09-23

張琪(1993-)，女(漢)，山西臨汾人，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)

*通信作者：霍乃蕊，教授，博士，Tel:0354-6289236;E-mail:tgnrhuo@163.com

國家自然科學(xué)基金(31201347)；山西省回國留學(xué)人員項(xiàng)目(2014-042)

TS251.94

A

1671-8151(2017)02-0121-05