吳文靜

（安徽公安職業(yè)學(xué)院 公安科學(xué)技術(shù)系，安徽合肥230031）

高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（液相質(zhì)譜，HPLC－MS／MS）是一種高靈敏度和高選擇性的樣品定量分析方法，由于其高效樣品的選擇性和準(zhǔn)確的測(cè)定能力而被廣泛推廣應(yīng)用于食品相關(guān)檢測(cè)、環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、農(nóng)藥殘留分析、藥物組分以及代謝研究中［1－2］。近幾年，隨著液質(zhì)技術(shù)的快速發(fā)展，與檢測(cè)相關(guān)的基質(zhì)效應(yīng)問(wèn)題也開(kāi)始被廣泛關(guān)注?；|(zhì)效應(yīng)作為質(zhì)譜檢測(cè)中存在的必然問(wèn)題，對(duì)樣品檢測(cè)、分析方法和結(jié)果的特異性、靈敏度和準(zhǔn)確度都有顯著影響［3］。目前，國(guó)外的學(xué)者已經(jīng)開(kāi)展了大量的與基質(zhì)效應(yīng)相關(guān)的工作和研究，但國(guó)內(nèi)相關(guān)的研究還未能構(gòu)成完整的研究體系。本文結(jié)合國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)液質(zhì)檢測(cè)過(guò)程中基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生原因、相關(guān)作用以及目前常規(guī)的檢測(cè)方法和消除或降低基質(zhì)干擾的途徑等問(wèn)題進(jìn)行闡述。

1 基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生機(jī)制及影響

基質(zhì)效應(yīng)指的是在樣品檢測(cè)過(guò)程中，除待測(cè)組分以外的其它物質(zhì)對(duì)待測(cè)組分的分析進(jìn)程產(chǎn)生的干擾，并影響檢測(cè)結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確性。基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生主要是源于樣品中的待測(cè)組分與基質(zhì)成分在離子化過(guò)程中的競(jìng)爭(zhēng)。由于分析物中組分的共流出效應(yīng)，霧滴表面的離子化效率會(huì)受到影響，其結(jié)果會(huì)導(dǎo)致離子抑制或離子增強(qiáng)，并最終顯著影響待測(cè)組分中目標(biāo)離子的生成效率及檢測(cè)強(qiáng)度。

基質(zhì)效應(yīng)最初是在1993年由Tang［4］提出的，他在研究中發(fā)現(xiàn)分析物的響應(yīng)值在標(biāo)準(zhǔn)溶液中和生物基質(zhì)中有較大的差異，并通過(guò)試驗(yàn)根據(jù)其響應(yīng)值的增強(qiáng)和減弱結(jié)果提出了離子抑制和離子增強(qiáng)。Tang和Kar?le等人［2］在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生，其主要原因是由于待測(cè)組分與基質(zhì)中非揮發(fā)性組分之間的競(jìng)爭(zhēng)所導(dǎo)致?；|(zhì)中非揮發(fā)性組分能夠牢牢的吸附樣品霧滴，阻止其進(jìn)一步分裂為微滴。進(jìn)一步推斷競(jìng)爭(zhēng)的形式，一種為蒸發(fā)過(guò)程中氣態(tài)離子形成進(jìn)程的競(jìng)爭(zhēng)，另一種則是霧滴表面帶電離子間的競(jìng)爭(zhēng)?？偟膩?lái)說(shuō)，基質(zhì)效應(yīng)與進(jìn)入電噴霧離子源的基質(zhì)多少密切相關(guān)。

2 基質(zhì)效應(yīng)的檢測(cè)及評(píng)定

近些年來(lái)，隨著HPLC技術(shù)在不同行業(yè)中的廣泛應(yīng)用，基質(zhì)效應(yīng)評(píng)估的必要性也越來(lái)越顯著。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）規(guī)定，以電離質(zhì)譜為基礎(chǔ)的食品、藥品相關(guān)檢測(cè)法中，需要依據(jù)樣品的不同有針對(duì)性的考慮檢測(cè)進(jìn)程中的基質(zhì)效應(yīng)。但對(duì)于采用何種方法評(píng)估相關(guān)基質(zhì)效應(yīng)，并沒(méi)有做出明確的規(guī)定。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)定主要存在兩種基本的檢測(cè)方法，一種是1999年Bonfigjio［5］等人提出的柱后注射法；另一種是Matuszewski［6］等人提出的先提取后添加法。這種方法通過(guò)對(duì)信號(hào)峰面積平均值的測(cè)量，比較待測(cè)液中加入空白提取液的響應(yīng)值與在純?nèi)芤褐屑尤氪郎y(cè)物的響應(yīng)值最終來(lái)確定基質(zhì)效應(yīng)的高低。

2.1 柱后注射法

如圖1所示，柱后注射法這種基質(zhì)效應(yīng)檢測(cè)方法是在分析柱與質(zhì)譜儀之間，使用泵和分流器將待測(cè)樣品通過(guò)穩(wěn)定的流速注入到質(zhì)譜儀中，質(zhì)譜注入樣品后會(huì)生成穩(wěn)定的響應(yīng)基線。而空白基質(zhì)組分則會(huì)通過(guò)液相色譜注入，并經(jīng)由色譜分析柱的保留時(shí)間后，與待測(cè)樣品組分共同注入質(zhì)譜儀中，并通過(guò)質(zhì)譜分析儀檢測(cè)對(duì)應(yīng)的響應(yīng)基線。響應(yīng)基線中發(fā)生明顯波動(dòng)變化的區(qū)域則被認(rèn)定為存在有基質(zhì)效應(yīng)的干擾。當(dāng)待測(cè)樣品的保留時(shí)間與響應(yīng)基線的波動(dòng)范圍一致時(shí)，其質(zhì)譜響應(yīng)值也會(huì)隨波動(dòng)的程度而發(fā)生改變，從而影響試驗(yàn)結(jié)果的精密性和準(zhǔn)確度。該方法是現(xiàn)階段定性基質(zhì)效應(yīng)最為常用的方法，通過(guò)對(duì)基線波動(dòng)時(shí)間和 出峰時(shí)間的比較，優(yōu)化待測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間，盡量確保出峰時(shí)間與基線波動(dòng)（基質(zhì)干擾）區(qū)域不同。

2.2 提取后添加法

提取后添加法是利用構(gòu)建數(shù)學(xué)模型的方法評(píng)定基質(zhì)效應(yīng)。該方法是近些年來(lái)LC－MS／MS檢測(cè)中最為常見(jiàn)的基質(zhì)評(píng)定辦法。根據(jù)此方法基質(zhì)效應(yīng)被劃分為相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)和絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)。相對(duì)基質(zhì)是空白基質(zhì)來(lái)自于不同個(gè)體樣品間效應(yīng)的比較，而絕對(duì)基質(zhì)是指來(lái)自于一個(gè)個(gè)體的空白基質(zhì)。簡(jiǎn)而言之，提取后添加法利用質(zhì)譜檢測(cè)三個(gè)不同條件下峰信號(hào)，并計(jì)算出峰面積平均值。其中，設(shè)定Al為標(biāo)準(zhǔn)品溶液；A2為樣品基質(zhì)提取后添加溶液；A3為樣品基質(zhì)提取前添加溶液，則基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect，ME）＝A2／A1；回收效率（Recovery efficiency， RE） ＝A3／A2；進(jìn)程效率（Process efficiency， PE） ＝A3／A1。 這種檢測(cè)方法能夠較為客觀、全面地評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)的發(fā)生情況。目前對(duì)于基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)估是以不同個(gè)體間基質(zhì)變異系數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定6個(gè)不同個(gè)體基質(zhì)間的基質(zhì)效應(yīng)變異系數(shù)不應(yīng)大于或超過(guò)15%，若變異系數(shù)大于或超過(guò)15%則必須對(duì)相關(guān)的檢測(cè)步驟進(jìn)行有效的優(yōu)化，從而確保降低檢測(cè)過(guò)程中基質(zhì)干擾效果。最近，一種利用標(biāo)準(zhǔn)曲線評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)的新方法被提出［7］，該方法通過(guò)分別測(cè)定5個(gè)不同個(gè)體的基質(zhì)樣品，并逐一繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用計(jì)算5條標(biāo)準(zhǔn)曲線間斜率的偏差值，進(jìn)而確定基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量的影響，若相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜4%，則認(rèn)定該檢測(cè)方法不受到基質(zhì)效應(yīng)影響。

圖1 柱后注射法示意圖

3 基質(zhì)效應(yīng)的降低和消除

一般來(lái)說(shuō)，HPLC－MS／MS檢測(cè)分析時(shí)基質(zhì)效應(yīng)是必然存在的，并隨檢測(cè)樣品性質(zhì)的不同而不同。因此如何減弱和消除待測(cè)樣品中基質(zhì)效應(yīng)問(wèn)題對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的客觀和準(zhǔn)確是尤為重要的。研究表明影響基質(zhì)效應(yīng)的因素有很多，如樣品類(lèi)型、樣品前處理過(guò)程、色譜條件、質(zhì)譜條件、流動(dòng)相和離子源的選擇等，故基質(zhì)干擾的降低和消除需從多個(gè)方面考慮和分析。

3.1 樣品前處理的優(yōu)化

選擇合適的樣品制備方法是最有效的消除基質(zhì)效應(yīng)影響的途徑之一。待測(cè)組分常需要嘗試不同的樣品前處理方法以達(dá)到最小的基質(zhì)干擾和較高的回收效率。樣品前處理一般可以被分為離線處理和在線處理兩種。最常采用的離線樣品處理方法有固相萃?。⊿PE）、液液萃?。↙LE）、蛋白沉淀（PPT）等。Mullter等人［8］對(duì)SPE、PP、LLE以及PP與SPE相結(jié)合的四種樣品制備方法的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明，在這四種樣品前處理方法中，LLE法離子抑制作用最小，基質(zhì)效應(yīng)最低。目前在線樣品處理較為常見(jiàn)的有閥切換、二維液相色譜－質(zhì)譜、在線SPE等方法。其中二維液相色譜－質(zhì)譜技術(shù)是利用柱體反沖去除復(fù)雜樣品中的基質(zhì)組分。閥切換方法通過(guò)把基質(zhì)作為廢液并在待測(cè)組分注入前后分別排出，進(jìn)而使基質(zhì)組分對(duì)結(jié)果的影響顯著減少。而在線SPE是最近幾年發(fā)展出的一種有效、快速的樣品前處理方法?？傮w來(lái)說(shuō)，待測(cè)樣品前處理的目的是為了去除干擾物質(zhì)，從而達(dá)到減少樣品中基質(zhì)干擾。但由于樣品處理過(guò)程中會(huì)或多或少地導(dǎo)致待測(cè)組分的損失，因此在樣品前處理中方法的選擇必須要保證降低基質(zhì)效應(yīng)的同時(shí)兼顧提取回收率。并且最為關(guān)鍵的一點(diǎn)，無(wú)論是采用離線或在線的前處理方法，都不能簡(jiǎn)單地歸結(jié)某種方法一定會(huì)優(yōu)于另一種。這是由于不同種的分析物對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的敏感性都不相同，因此其最佳的樣品前處理方法也不盡相同。對(duì)于不同的待測(cè)組分，則需進(jìn)行相應(yīng)的試驗(yàn)來(lái)確定何種方法為基質(zhì)干擾最小的樣品前處理方法。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

篩選色譜條件是最為簡(jiǎn)便分離待測(cè)組分中基質(zhì)干擾物質(zhì)維持原樣。樣品在色譜分離時(shí)，最先被分離出的主要是基質(zhì)中的極性成分。而這些極性成分是誘發(fā)基質(zhì)干擾的主要原因。目前的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)目標(biāo)分析物在色譜內(nèi)的處理時(shí)間相對(duì)較短時(shí)（小于3分鐘），基質(zhì)干擾較為明顯。而適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)色譜處理時(shí)間則會(huì)顯著地降低待測(cè)組分的基質(zhì)效應(yīng)。而對(duì)于復(fù)雜的多組分物質(zhì)檢測(cè)，多種組間成分其色譜分離效果越好，則相應(yīng)的基質(zhì)影響也越小。總體來(lái)說(shuō)，選擇一個(gè)較為合適的色譜分離方式是降低組分檢測(cè)中基質(zhì)干擾的有效途徑。Djkmana等人［9］以水體中的除草劑為分析目標(biāo)，比較在單柱、柱前切換和雙柱三種色譜分離模式下的基質(zhì)干擾情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用單柱組分測(cè)定時(shí)基質(zhì)干擾效果最為明顯，而柱前切換和雙柱則可以很有效的避免該問(wèn)題，尤其在雙柱模式下，基質(zhì)效應(yīng)的消除非常顯著。另外Choi等人［10］的研究中發(fā)現(xiàn)，進(jìn)樣體積對(duì)檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)有顯著影響，隨著進(jìn)樣體積的不斷增加，檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度顯著降低。因此在確保檢測(cè)靈敏度的條件下，盡量采用較低的樣品進(jìn)樣量可以適當(dāng)避免基質(zhì)效應(yīng)的干擾。除此之外，色譜流動(dòng)相的pH值的變化也同樣會(huì)影響組分中分離物效果。Zhang［11］的試驗(yàn)中通過(guò)改變流動(dòng)相pH值的方法將待測(cè)物與內(nèi)源性物相分離，從而達(dá)到降低溶液中基質(zhì)干擾的目的。如圖2所示，在流動(dòng)相pH＝7.0的色譜條件下，由于同位素效應(yīng)，待測(cè)物和同位素內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間產(chǎn)生了相應(yīng)的漂移，導(dǎo)致待測(cè)物和同位素內(nèi)標(biāo)處于不同的離子抑制區(qū)，從而導(dǎo)致基質(zhì)對(duì)待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)產(chǎn)生抑制作用。相應(yīng)的當(dāng)流動(dòng)相pH被降低到3.4時(shí)，待測(cè)物和同位素內(nèi)標(biāo)同時(shí)避開(kāi)離子抑制區(qū)，并且保留時(shí)間也基本一致，這表明，pH的改變能夠有效地消除基質(zhì)對(duì)待測(cè)物的干擾。

3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)效應(yīng)會(huì)隨著質(zhì)譜中離子源、離子化模式的不同而產(chǎn)生不同的影響。因此修正質(zhì)譜分析是有效降低基質(zhì)干擾的途徑之一，其優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需改變樣品的前處理進(jìn)程和色譜分析條件。HPLC－MS／MS質(zhì)譜中ESI和APCI等都是最為常見(jiàn)的離子源，過(guò)去的研究中發(fā)現(xiàn)離子化模式同樣會(huì)受到樣品中基質(zhì)效應(yīng)的干擾。Kelly等人［12］利用ESI和APCI離子源對(duì)胎便中苯丙胺的離子化程度進(jìn)行了相關(guān)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明ESI較APCI更易受到待測(cè)樣品中基質(zhì)效應(yīng)的干擾，且不同的電離方式對(duì)于化合物中負(fù)離子電離特異性影響也略有不同，ESI對(duì)于檢測(cè)組分的離子抑制性更為明顯。這與之前Dams等人［13］采用柱后注射法對(duì)比APCI和ESI兩種電離模式對(duì)嗎啡的離子抑制情況的研究結(jié)果相一致?，F(xiàn)有的研究表明，基質(zhì)效應(yīng)主要對(duì)ESI電離模式有較為顯著的干擾。因而，若采用ESI電離時(shí)，伴隨顯著基質(zhì)效應(yīng)，可考慮采用APCI模式，但在改變電離模式的同時(shí)，需對(duì)待測(cè)組分中相關(guān)的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行重新的評(píng)價(jià)。

3.4 同位素內(nèi)標(biāo)的選擇

在HPLC－MS／MS檢測(cè)中，由于待測(cè)樣品組分復(fù)雜，處理過(guò)程繁瑣，為確保檢測(cè)結(jié)果的精密性和可靠性通常會(huì)使用內(nèi)標(biāo)來(lái)校正試驗(yàn)進(jìn)程中的誤差。理想的組分內(nèi)標(biāo)應(yīng)當(dāng)對(duì)待測(cè)組分的提取、檢測(cè)過(guò)程無(wú)干擾，并在包括樣品制備、色譜分離和質(zhì)譜檢測(cè)的全過(guò)程中擁有與待測(cè)組分相似的應(yīng)答反應(yīng)。因此一個(gè)合理且穩(wěn)定的內(nèi)標(biāo)是消除基質(zhì)干擾的有效途徑。

表1 同位素氘代內(nèi)標(biāo)和同系物內(nèi)標(biāo)基質(zhì)效應(yīng)比較

目前的研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)是液質(zhì)檢測(cè)中最為穩(wěn)定和安全的內(nèi)標(biāo)物，穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)與傳統(tǒng)的同系物內(nèi)標(biāo)相比，與分析物的理化性質(zhì)更為相似，結(jié)構(gòu)也更為穩(wěn)定，且無(wú)論是在前處理過(guò)程還是在色譜分離、離子化以及質(zhì)譜檢測(cè)中，同位素內(nèi)標(biāo)與分析物的反應(yīng)基本一致，因此這大大降低了待測(cè)組分中的基質(zhì)干擾。

Sean等人［14］在定量分析西羅莫司藥物效果的試驗(yàn)中，對(duì)采用同位素氘代內(nèi)標(biāo)和同系物內(nèi)標(biāo)的不同試驗(yàn)樣品發(fā)生基質(zhì)效應(yīng)的情況進(jìn)行比較（如表1）。試驗(yàn)采用人的空白全血，評(píng)估血液在高、中、低不同濃度藥物刺激下的基質(zhì)干擾情況。結(jié)果表明，氘代標(biāo)記物和同系物分別作為待測(cè)組分內(nèi)標(biāo)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的變異系數(shù)分別為1.8%和5.4%，待測(cè)組分相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)分別為4.2%和8.9%；與同位素氘代內(nèi)標(biāo)相比，同系物基質(zhì)效應(yīng)較高，變異系數(shù)較大。這表明同位素氘代內(nèi)標(biāo)與傳統(tǒng)的同系物內(nèi)標(biāo)相比能夠更好地穩(wěn)定溶液環(huán)境對(duì)樣品的影響，降低組分中基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。這與Antignac等人［15］對(duì)20個(gè)動(dòng)物組織樣品進(jìn)行比較研究中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相一致，即使用同位素內(nèi)標(biāo)物醋酸曲安縮松較使用氟氫可的松作內(nèi)標(biāo)時(shí)信號(hào)強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差顯著降低。

4 結(jié)論

基質(zhì)效應(yīng)是生物樣品質(zhì)譜分析過(guò)程中重要的影響因素，在建立相關(guān)的質(zhì)譜檢測(cè)方法時(shí)應(yīng)對(duì)樣品中的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的評(píng)估，并通過(guò)綜合考量待測(cè)樣品前處理進(jìn)程、色譜分離條件、質(zhì)譜檢測(cè)和內(nèi)標(biāo)物的影響等方面，盡可能地降低或消除待測(cè)組分測(cè)定中的基質(zhì)干擾，從而確保檢測(cè)分析結(jié)果的精密性和可靠性。

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